Extracto
Antecedentes
La nicotina es el componente adictivo principal de humo de tabaco. Aunque la nicotina es generalmente cree que tienen una capacidad limitada para iniciar el cáncer, se puede inducir la proliferación celular y la angiogénesis en una variedad de sistemas. Estas propiedades podrían permitir la nicotina para facilitar el crecimiento de tumores ya iniciada. Aquí mostramos que la nicotina promueve significativamente la progresión y la metástasis de tumores en modelos de ratón de cáncer de pulmón. Este efecto se observó cuando la nicotina se administra a través de inyecciones intraperitoneales, o por medio de parches transdérmicos over-the-counter.
métodos y las conclusiones
En el presente estudio, las células de adenocarcinoma de ratón línea 1 se implantaron subcutáneamente en ratones /c singénicos BALB. la administración de nicotina ya sea por vía intraperitoneal (i.p.) inyección o parches transdérmicos provocó un aumento notable en el tamaño de los tumores implantados LINE1. Una vez que los tumores se retiraron quirúrgicamente, los ratones tratados con nicotina tenía una recurrencia del tumor marcadamente más alto (59,7%) en comparación con los ratones tratados con vehículo (19,5%). La nicotina también aumenta la metástasis de tumores implantados LINE1 dorsalmente a los pulmones por 9 pliegues. Estos estudios sobre tumores trasplantados se extendieron a un modelo de ratón en que los tumores fueron inducidos por el carcinógeno tabaco, NNK. Los tumores de pulmón se iniciaron en ratones A /J por vía intraperitoneal inyección de NNK; la administración de 1 mg /kg de nicotina tres veces a la semana llevado a un aumento en el tamaño y el número de tumores formados en los pulmones. Además, la nicotina redujo significativamente la expresión de marcadores epiteliales, E-cadherina y β-catenina, así como la proteína de unión estrecha ZO-1; Estos tumores también mostraron un aumento de expresión de la α
7 nAChR subunidad. Creemos que la exposición a la nicotina, ya sea por los suplementos de humo de tabaco o nicotina podría facilitar un mayor crecimiento tumoral y la metástasis.
Conclusiones
Nuestros resultados anteriores indican que la nicotina podría inducir la invasión y la transición epitelio-mesenquimal (EMT ) en el pulmón cultivadas, de mama y células de cáncer pancreático. Este estudio demuestra por primera vez que la administración de nicotina ya sea por vía i.p. inyección o a través de parches dérmicos más de venta libre pueden promover el crecimiento del tumor y la metástasis en ratones inmunocompetentes. Estos resultados sugieren que mientras que la nicotina tiene capacidad sólo se limita a iniciar la formación de tumor, se puede facilitar la progresión y metástasis de tumores pre-iniciado por los carcinógenos del tabaco
Visto:. Davis R, Rizwani W, Banerjee S, M Kovacs , Haura E, Coppola D, et al. (2009) La nicotina promueve el crecimiento tumoral y la metástasis en el ratón modelos de cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (10): e7524. doi: 10.1371 /journal.pone.0007524
Editor: William Pao, la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de junio de 2009; Aceptado: August 25, 2009; Publicado: 20 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Davis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios fueron apoyados por el Instituto Nacional del Cáncer subvenciones CA63136 y CA127725, así como Bankhead-Coley subvención#06BB-04-9587 de Carolina del Sur. RD es un beneficiario de una beca predoctoral de la Asociación Americana del Corazón. Los patrocinadores no estaban involucrados en el diseño del estudio; recolección, análisis e interpretación de datos; redacción del documento o la decisión de presentar el documento para su publicación
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El humo del tabaco contiene una amplia gama de compuestos que son perjudiciales para la salud; algunos de estos compuestos tales como 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) y N'-nitrosonornicotina (NNN) son derivados de nicotina y son altamente cancerígeno [1]. Estas moléculas pueden formar aductos con el ADN celular, lo que conduce a mutaciones en genes vitales como Ras, p53, Rb y [2], [3], [4]. Aunque la nicotina es el componente adictivo en el humo del cigarrillo, no puede iniciar la formación de tumores en ratones o ratas, aunque se ha informado de que puede iniciar tumores en hámsters [5].
nicotina ejerce sus funciones celulares a través de acetilcolina nicotínico receptores (nAChR), que son muy extendida en las neuronas y las uniones neuromusculares [6], [7], [8]. Se encontraron subunidades de nAChR que estar presente en una amplia variedad de células no neuronales, incluyendo los de origen epitelial y endotelial [9]. nAChR son proteínas pentaméricas integrada por nueve subunidades alfa (α2-α10) y tres subunidades beta (β2-beta 4) en las células neuronales [10] y se pueden agrupar en dos tipos: uno que comprende de un heteromérica pentámero de α2-α6 y β2- β4, y el otro que comprende de un homomeric pentámero de α7-α9 [11], [12], [13]. (tipo de músculo), los receptores no neuronales están compuestos de cualquiera de α1, β1, δ y gamma subunidades en forma embrionaria, o como α1, β1, δ y subunidades varepsilon en la forma adulta en una relación 2:1:1:1 [ ,,,0],14]. Ambos receptores musculares y de tipo neuronal son algo similares a la otra, especialmente en las regiones hidrófobas. Ellos difieren en su sensibilidad a alfa-bungarotoxina (α-BT) [13], [15]. α7 nAChR es abundante en las células neuronales, tiene una alta permeabilidad al Ca
2 + facilitando de este modo Ca
2 + dependientes de eventos tales como la liberación de neurotransmisores, la regulación de las cascadas de segundo mensajero [16], [17], la supervivencia celular [ ,,,0],18] y la apoptosis [19]. El hallazgo de que los nAChR están presentes en las células no neuronales fue seguido por la observación de que la nicotina puede inducir la proliferación de las células endoteliales [20], así como líneas celulares de carcinoma de pulmón in vitro y in vivo [21]. La nicotina también se ha demostrado que protege las células de cáncer de pulmón de la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos estándar [22]; Además, la nicotina puede inducir la proliferación a través de la mediación de la β-arrestina-1, Src quinasa y la inducción de Rb-Raf-1 interacción [23], [24].
Los estudios recientes del laboratorio Russo tiene se muestra que la inhibición de nAChR por a-cobratoxin puede inhibir el crecimiento de tumores A549 en ratones inmunodeprimidos [25]. Informes recientes también han demostrado la presencia de receptores de estrógeno funcionales en líneas celulares de cáncer de pulmón; estradiol se ha demostrado para promover la proliferación de células tumorales de pulmón [26], [27], [28], [29] y una combinación de nicotina y estradiol puede promover el crecimiento de tumores A549 en ratones desnudos atímicos [30]. Estos informes presentan estudios realizados en ratones inmunodeficientes; nos aventuramos para estudiar el efecto de la nicotina sobre dos modelos separados de ratones inmunocompetentes. Los estudios presentados aquí indican que la nicotina por sí mismo puede inducir el crecimiento y la metástasis de tumores en ratones inmunocompetentes, independientemente de otros carcinógenos del tabaco. Nicotina administrada ya sea por vía intraperitoneal o por parches transdérmicos disponibles en el mercado podría promover sustancialmente el crecimiento del tumor. Se observaron efectos similares en tumores implantados, así como tumores inducidos por el carcinógeno tabaco, NNK. Además, los ratones expuestos a la nicotina mostraron una mayor significativamente la metástasis de pulmón, así como la extirpación quirúrgica recurrencia posterior del tumor del tumor primario. Estos resultados implican que la nicotina puede mejorar el crecimiento y la metástasis de los tumores de pulmón preestablecidos.
Métodos
Cultura celular y la proliferación ensayos
p>
7. La proliferación celular se evaluó midiendo la incorporación de BrdU. Bromodesoxiuridina (BrdU) kits de etiquetado se obtuvieron de Roche Bioquímicos. células en fase S se visualizaron por microscopía y se cuantificaron contando 3 campos de 100 por cuadruplicado.
Línea1 experimentos de crecimiento tumoral
ratones Balb /c hembras de entre 26-30 días (Charles River) se recortado y depilar el uso de Nair para la eliminación del vello en la espalda y los flancos. se recogieron las células LINE1 (1 × 10
6 por tumor) y se resuspendieron en 100 l de PBS para inyección. Los ratones fueron aleatorizados 3-7 días después de la inyección de las células tumorales. Los ratones se dividieron en dos grupos- Vehículo (
n
= 8) y nicotina (
n
= 8) (parche o inyección por vía intraperitoneal). Los ratones recibieron nicotina mediante inyección i.p. inyección a una dosis de 1 mg /kg tres veces a la semana. La nicotina también se aplicó usando parches transdérmicos (Nico®Derm® CQ, GlaxoSmithKline) a una dosis de 25 mg /kg al día. Parches (14 mg) se cortaron en 30 cuadrados de igual tamaño que representan 0,45 mg de nicotina usando una hoja de afeitar. El peso medio de los ratones era 0,018 Kg (18 g). Un pequeño cuadrado que representa 0,45 mg del parche igualó una dosis final de 25 mg /kg al día. Un parche se aplicó a la zona dorsal inferior (depilar) por día. La nicotina se administró durante 2 semanas y el crecimiento del tumor se midió tres veces por semana. Los niveles de nicotina en ratones fueron analizados utilizando un kit ELISA cotinina. (cat#CT086D; Calbiotech, Spring Valley, CA):
experimentos metástasis línea 1
células línea 1 (1 × 10
6 por tumor) se inyectaron y los ratones se asignaron al azar a continuación en dos grupos. El grupo uno recibió el vehículo (
n
= 16) y el segundo grupo recibió la nicotina (1 mg /kg) (
n
= 16) por vía intraperitoneal inyección tres veces por semana. Después de 3 semanas de tratamiento con nicotina, los tumores se retiraron bajo anestesia y la piel se grapan, los ratones se recuperaron en una almohadilla de calefacción calentado y las grapas se retiraron después de 7 días. Los ratones continuó recibiendo la nicotina o vehículo durante 2 semanas adicionales. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y los pulmones se fijaron en formalina.
experimentos de carcinogénesis A /J
Dos experimentos se llevaron a cabo usando ratones A /J Una hembra de 4-6 semanas de edad (Jackson Labs). Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con los procedimientos y directrices empleo Comisión (IACUC) Institucional de Cuidado y animal. NNK (NCI) (100 mg /kg) se administró a todos los ratones (
n
= 16) una vez a la semana durante 5 semanas [31], [32]. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos; el grupo uno recibió el vehículo (PBS) (
n
= 8) y el grupo dos recibió la nicotina (
n
= 8) por vía intraperitoneal inyección a una dosis de 1 mg /kg tres veces por semana durante 28 semanas adicionales. Los niveles de nicotina en ratones se analizaron usando un kit ELISA de cotinina. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y los pulmones fueron fijadas en 10% formalina tamponada. Los pulmones fueron examinados posteriormente por estereoscopio para el número de tumores de pulmón. Los pulmones fueron embebidos en parafina y se seccionaron para la tinción IHC y el examen patológico.
se utilizó cuantificación de cotinina
El nivel de cotinina en la orina como marcador de los niveles de nicotina. Se recogió orina (100 l) a lo largo de la longitud de los experimentos y se almacena en -20 ° C para su posterior análisis. Los niveles de cotinina se determinaron utilizando el kit ELISA Directo BioQuant cotinina siguiendo los protocolos del fabricante.
RT-PCR
La transcriptasa inversa acoplada PCR se realizó para α
7 nAChR en las células línea 1. Se aisló el ARN total a partir de suero de hambre y la nicotina estimula las células LINE1 (RNEasy Kit; Qiagen) utilizando el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADNc por transcripción inversa mediante el uso de un kit de AMV-RT (Promega). Los cebadores y las condiciones de RT-PCR para α
7 nAChR se describen en otra parte [23], [33]. PCR para la actina se utilizó como control de carga.
noradrenalina y adrenalina ELISA
Las células fueron prestados línea 1 de reposo por la privación de suero y tratadas con nicotina 1 M durante 48 h. Después de lo cual, se recogió el medio y se diluyó apropiadamente para evaluar la noradrenalina y adrenalina secretada en los medios de comunicación. El ELISA se realizó mediante ELISA investigación adrenalina y noradrenalina investigación kits ELISA de Trabajo Diagnostika Nord (cat#BA 10-5100 y 10-5200, respectivamente BA) siguiendo el protocolo del fabricante. Las concentraciones se alcanzaron alrededor siguiendo los cálculos que se sugieren en el protocolo y los valores son representativos de dos experimentos independientes.
La inmunohistoquímica
A la terminación de los experimentos con animales, se extrajeron los tumores y se fijaron en 10% formalina tamponada neutra antes de procesar en bloques de parafina. Las secciones de tejido (5 m de espesor) se cortaron de los bloques y se tiñeron o bien con H & amp; E solo o con anticuerpos contra α, (dilución
7 nAChR (dilución 1:50, Abcam) E-cadherina 1:200, Santa Cruz ), β-catenina (dilución 1:200, Santa Cruz) o ZO-1 (dilución 1:200, Abcam). Para los estudios de inmunohistoquímica, las secciones de parafina se rehidrataron a PBS y se procesaron utilizando el siguiente protocolo. Las secciones se aclararon en dH2O, y después se sometieron a microondas 'de recuperación de antígeno' durante 20 minutos en 70% de potencia, con un período de enfriamiento después de 1 minuto cada 5 minutos, en citrato de sodio 0,01 M, pH 6,0. Las secciones se enfrían durante 20 minutos, se enjuagaron 3 veces en dH2O, dos veces en PBS y el resto de la tinción se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (kit universal Elite ABC, Vector Labs). Para el desarrollo del color de las diapositivas fueron tratados con el kit de sustrato de peroxidasa de Vector Labs (cat#SK-4100) y se desarrollaron utilizando DAB como cromógeno. Después de un aclarado final en dH2O, las secciones fueron ligeramente counterstained en hematoxilina, se deshidrataron y se montaron con el montaje Clarion medio (Santa Cruz Biotech.). Tanto H & amp; E y tinción inmunohistoquímica diapositivas fueron digitalizadas en un Ariol SL-50 (versión 3.0.70) Sistema de escaneo automático de Applied Imaging. Tumor secciones fueron escaneados a 20 × magnificación y se identificaron las regiones de interés y esbozaron por un patólogo (DC). Las secciones del tumor con las regiones immunopositive de control y ratones tratados fueron cuantificados para la intensidad, tamaño y área de uso de software Ariol estación de revisión. se determinó el valor p para la significación estadística con la ayuda de la prueba t de Student.
Resultados
La nicotina estimula el crecimiento de tumores en ratones
Los proliferativos y pro-angiogénicos efectos de nicotina se ha demostrado en varios sistemas; estudios recientes han demostrado que la nicotina podría promover el crecimiento de A549 (células de adenocarcinoma de pulmón de tipo II fenotipo alveolar) tumores en ratones inmunodeficientes [25]. Para determinar los efectos de la nicotina sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en ratones inmunocompetentes, se utilizaron células de adenocarcinoma de ratón LINE1. Las células forman tumores subcutáneos línea 1 (vía subcutánea) en ratones BALB /c, lo que puede producir metástasis en los pulmones [34], [35], [36], [37], [38]. Para examinar si la proliferación inducida por nicotina de células línea 1, las células se mantuvieron en ayunas de suero durante 72 horas y posteriormente se estimularon con 1 M de nicotina durante 18 horas. entrada en fase S se midió usando ensayos de incorporación de BrdU. La nicotina podría estimular eficazmente células línea 1 para entrar en la fase S (Figura 1A). A continuación, las células línea 1 se implantaron en los flancos de ratones BALB /c y se dejaron formar tumores. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos, con un grupo que recibía el vehículo (
n
= 8) y el segundo de recibir 1 mg /kg de nicotina (
n
= 8) tres veces por semana por vía intraperitoneal (ip ) de inyección. Los ratones que recibieron la nicotina tenía tumores significativamente más grandes en comparación con los que recibieron vehículo; los volúmenes tumorales promedio de 695 ± 98 mm
3 en ratones tratados con vehículo, en comparación con 2267 ± 369 mm
3 en ratones tratados con nicotina (Figura 1B),
p
= 0,002.
(A) nicotina (1 M) promueve la fase S de entrada de las células privadas de suero línea 1 en ensayos de incorporación de BrdU. (B) La nicotina (1 mg /kg) aumenta significativamente el crecimiento del tumor Línea 1 en ratones Balb /c cuando se administra por vía i.p. inyección tres veces por semana, p = 0,002, n = 10. (C) de nicotina (25 mg /kg /día) también aumenta significativamente el crecimiento del tumor Línea 1 cuando se administra por vía transdérmica parches p = 0,019, n = 14.
sobre la base de los resultados anteriores, los experimentos se realizaron para examinar si la nicotina administrada por parches transdérmicos más de venta libre podría promover el crecimiento del tumor. ratones BALB /c (
n
= 16) implantado con la línea 1 tumores fueron asignados al azar en dos grupos y se aplicaron los parches de nicotina diaria en una dosis de 25 mg /kg de nicotina. Se encontró que la nicotina administrada por parches transdérmicos podría aumentar significativamente el crecimiento de tumores línea 1; los ratones de control tenían un volumen tumoral medio de 530 ± 59 mm
3, mientras que los ratones que usan parches de nicotina tenían un volumen promedio de 871 ± 106 mm
3 (Figura 1C),
p = 0,019
. Estos experimentos confirman que la exposición a la nicotina, incluso a través de suplementos de nicotina, podrían afectar a los tumores preestablecidos.
nicotina promueve la re-crecimiento y la metástasis de tumores en ratones
Desde que se encontró nicotina para mejorar tumor crecimiento, se llevaron a cabo experimentos para evaluar sus efectos sobre la metástasis tumoral. Con el fin de examinar esto, los tumores implantados fueron retirados quirúrgicamente después de 14 días de tratamiento o una vez que llegaron a 500-700 mm
3. Los tumores se eliminan para evitar las molestias de tumores grandes. Los ratones fueron anestesiados para la extirpación del tumor, y las heridas estaban grapadas cerca. Después de la eliminación del tumor, los ratones se les administró vehículo o nicotina mediante inyección i.p. la inyección durante otros 14 días. Curiosamente, los ratones tratados con nicotina mostraron una mayor tasa de recurrencia del tumor después de que los tumores se retiraron quirúrgicamente (Figura 2A); los ratones tratados con vehículo muestran un promedio de 19 ± 7% la recurrencia del tumor, en comparación con un promedio de 59 ± 3% de recurrencia del tumor en nicotina (1 mg /kg) ratones tratados,
p
= 0,01,
n = 16.
recurrencia del tumor se calculó como porcentaje de los tumores recurrentes de entre el número total de tumores eliminados. Como se muestra en la figura 2B, los ratones tratados con nicotina también muestran significativamente mayor número de metástasis pulmonares, así como focos metastásicos más grandes en comparación con los que recibieron vehículo. El examen histológico de los tumores de pulmón confirmó más grande focos metastásicos en los ratones tratados con nicotina (Figura 2C). Los ratones que recibieron el vehículo tenían un promedio de 0,9 ± 0,2 focos metastásicos en los pulmones por ratón; en comparación, los ratones que recibieron nicotina en dosis de 1 mg /kg tres veces por semana tenían un promedio de 8,1 ± 1,7 focos en los pulmones por ratón, p = 0,001,
n
= 16 (Figura 2D). Curiosamente, los ratones que recibieron nicotina a través de parches dérmicos tenido una media de 20,6 ± 4,9 pulmón focos metastásicos por ratón, mientras que los ratones que recibieron vehículo tenían un promedio de 6,7 ± 2,1 focos por ratón (p = 0,02, n = 16) (Figura 2E).
ratones tratados (a) nicotina (1 mg /kg) muestra una mayor incidencia de la recurrencia del tumor después de la eliminación quirúrgica de los tumores en comparación con el grupo control del vehículo,
p
= 0,01,
n
= 16 ratones tratados (B) de nicotina muestran significativamente más metástasis de pulmón a partir sc línea1 primaria tumores. (C) H & amp; E tinción de los pulmones de vehículo y los ratones tratados con nicotina, los ratones tratados con nicotina muestran tumores de mayor tamaño, como se indica por las flechas. (D) Gráfico que muestra el número total medio de los tumores de pulmón por ratón en el vehículo y la nicotina (1 mg /kg) ratones tratados, p = 0,001,
n
= 16. (E) Gráfico que muestra el número total medio de los tumores de pulmón por ratón en el control y parche de nicotina (25 mg /kg) ratones tratados, p = 0,02, n = 16.
la cotinina, un metabolito principal de la nicotina, es considerado actualmente el mejor indicador de la exposición al humo del tabaco [39]. Es específico para la nicotina, tiene una vida media larga (15-40 horas), y su nivel se piensa que es directamente proporcional a la cantidad de nicotina absorbida [40]. Por lo tanto para determinar la concentración de nicotina en nuestros modelos de ratón, se examinaron los niveles de cotinina en la orina de los ratones experimentales. Orina (100 l) se recogió de forma rutinaria en toda la longitud de los experimentos. Los ratones que recibieron 1 mg /kg de nicotina tres veces por semana tenían una concentración media de cotinina de 3000 ng /ml en orina. Los ratones que recibieron 25 mg /kg de nicotina por parche transdérmico tenía una concentración media de cotinina de 5000 ng /ml de cotinina en la orina. Los niveles de cotinina en la orina eran a menudo en una amplia gama de concentración debido a la diferencia de los volúmenes de recogida de orina. En los fumadores humanos, las concentraciones de cotinina han sido reportados en valores que van de 1,500 ng /ml a 8000 ng /ml [41], [42], [43], [44]. Las dosis de nicotina utilizados en estos estudios se correlacionaron bien con los niveles de cotinina en la orina de los fumadores pesados [42], [43].
La nicotina aumenta el crecimiento de tumores inducidos por carcinógenos del tabaco
Los experimentos fueron diseñados para examinar los efectos de la nicotina en los tumores inducidos por el carcinógeno tabaco, NNK; este sistema experimental imita una situación en la que los tumores se inician por un carcinógeno, seguido de la exposición a la nicotina sola. Hacia este fin, los ratones A /J fueron tratados con 100 mg /kg NNK una vez a la semana durante cinco semanas para iniciar la formación de tumores y, posteriormente, se asignaron al azar en dos grupos. Un grupo de ratones recibió el vehículo (PBS), mientras que el segundo grupo recibió la nicotina (1 mg /kg) tres veces por semana mediante inyección i.p. inyección; los ratones fueron tratados con nicotina o vehículo durante 28 semanas. Los pulmones de tanto el vehículo como los ratones tratados con nicotina habían desarrollado tumores (Figura 3A & amp; B). H & amp; E secciones de pulmón teñidas fueron escaneados y un patólogo (DC) describen el área del tumor; tamaño y el número de focos tumorales se cuantificaron. Los ratones que recibieron PBS después de las inyecciones de NNK tenían un promedio de 10 ± 3.0 tumores de pulmón por sección y ratones que recibieron nicotina 1 mg /kg tuvo 16 ± 3,0 tumores por sección, p = 0,01, n = 8 (Figura 3C). El tamaño del tumor (área) también aumentó en los ratones tratados con nicotina (Figura 3D). Esto sugiere que la exposición a la nicotina una vez que los tumores ya están iniciados pueden resultar en el crecimiento del tumor mejorada
(A) H & amp;. E tinción de seccionamiento transversal de los pulmones (B) Representante imágenes escaneadas de H & amp; E manchado de pulmón coronal secciones, los tumores se describen por las cajas. Las imágenes fueron escaneadas a 20 × magnificación. (C) La nicotina aumenta el número medio de tumores pulmonares por ratón,
p
= 0,01,
n = 8.
(D) La nicotina aumentó el tamaño del tumor significativamente en los ratones A /J.
La nicotina induce la proliferación celular a través de α
7 nAChR subunidad en el cáncer de pulmón de ratón
en nuestro informe anterior, hemos demostrado que la nicotina podría inducir la proliferación e invasión de NSCLC humanos a través de α
7 nAChR subunidad [45]. En el presente estudio, encontramos la nicotina podría inducir la proliferación en células de adenocarcinoma de pulmón de ratón Línea1 principalmente a través de α
7 nAChR subunidad. α-bungarotoxina, un α inhibió significativamente 7 antagonista subunidad proliferación
inducida por la nicotina en las células línea 1, lo que sugiere que α
7 subunidad es principalmente responsable de mediar el efecto proliferativo de la nicotina (Figura 4A). Para confirmar aún más la función de la α
7 nAChR en la proliferación celular mediada por la nicotina se realizó RT-PCR para α
7 nAChR expresión de la subunidad. El tratamiento de células LINE1 con nicotina durante 24 horas provocó la regulación al alza de α
7 nAChR subunidad con respecto a las células privadas de suero, como se muestra en la Figura 4B. Se observó un aumento similar en la expresión de la proteína de α
7 nAChR en las secciones de tumor de pulmón de ratones A /J tratados con nicotina sobre la inmunotinción (Figura 4C); los resultados se cuantifican en la figura 4D. Estos resultados sugieren que la exposición a la nicotina es la inducción de la proliferación celular y el crecimiento tumoral a través de la α
7 subunidad de nAChR.
células (A) quiescente línea 1 se trataron con 1 M de nicotina durante 18 h en presencia o ausencia de α-BT, una α
7 nAChR inhibidor de la subunidad. La nicotina aumenta α
7 de expresión, mientras que α-BT invierte este. (B) de la transcriptasa inversa acoplada-PCR muestra la expresión de α
7 subunidades de nAChR en células privadas de suero línea 1 tratados con nicotina durante 24 h. PCR para la actina se utilizó como control de carga. (C) α
7 nAChR tinción de los tumores de pulmón A /J inducidos por NNK o inducidos por NNK y expuestos a la nicotina. La nicotina mejora la expresión de esta subunidad del receptor. (D) La cuantificación de α
7 nAChR expresión en tumores de vehículos y nicotina tratada.
nicotina se ha demostrado que induce el crecimiento de células de cáncer de colon y células de cáncer gástrico a través de α
7 nAChR- liberación de adrenalina, que a su vez regula positivamente la expresión de COX-2, PGE2 y VEGF mediada, facilitando de este modo la progresión de estos tipos de cáncer [46], [47], [48]. Del mismo modo, en nuestro estudio, se encontró que el tratamiento con nicotina eleva los niveles de adrenalina y noradrenalina en el adenocarcinoma de pulmón de ratón. células línea 1 se trataron con nicotina durante 48 horas y se recogió el medio para comprobar la liberación de adrenalina y noradrenalina. La nicotina eleva los niveles de adrenalina a 42,5 ± 2,4 pg /ml de 17 ± 1 pg /ml en el control, mientras que los niveles de noradrenalina alcanzaron su punto máximo a 37 ± 4,8 pg /ml en comparación con 6,7 ± 0,87 pg /ml en el control. Estos resultados sugieren que la señalización a través de la adrenalina también puede contribuir a los efectos proliferativos observados de la nicotina.
La nicotina facilita los cambios de EMT-como en los cánceres de pulmón
Teniendo en cuenta la observación de que la nicotina puede inducir el crecimiento del tumor y promover metástasis [20], [45], [49], se hicieron intentos para entender los eventos moleculares que median en estos procesos. Transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un fenómeno por el cual las células pierden su fenotipo epitelial y adquieren más características mesenquimales que facilitan el desprendimiento y la migración [50], [51], [52]. Se examinaron los tumores en ratones A /J para los cambios consistentes con un fenómeno EMT-como, el uso de la tinción inmunohistoquímica para la E-cadherina y β-catenina, dos proteínas implicadas en la adhesión de células epiteliales. β-catenina une a la E-cadherina para facilitar la adhesión celular y ejercer sus funciones de señalización. Se encontraron niveles de E-cadherina ser significativamente menor en los tumores de los ratones tratados con nicotina (Figura 5A); los resultados se cuantifican en la Figura 5B. La tinción para β-catenina, que se une a E-cadherina para facilitar la adhesión, además de sus funciones de señalización [53], la pérdida de la localización membranosa de β-catenina en tumores de pulmón de ratones tratados con nicotina (; D Figura 5C & amp) revelado. Por otra parte secciones de tumor de pulmón de ratones tratados con nicotina mostraron una reducción significativa expresión de ZO-1 sobre la inmunotinción (Figura 5E & amp; F). Fue coherente con nuestros hallazgos anteriores sobre células de mama y cáncer de pulmón que mostró disminución membranosa ZO-1 tinción en el tratamiento de nicotina, lo que indica que la nicotina facilita la ruptura de las uniones estrechas para promover la metástasis [45].
(A ) E-cadherina tinción de los tumores de pulmón A /J inducidos por NNK o NNK + nicotina. (B) La cuantificación de la intensidad de E-cadherina en los tumores (C) β-catenina tinción de los tumores de pulmón A /J inducidos por NNK o NNK + nicotina. (D) La cuantificación de la β-catenina membranosa. (E) ZO-1 tinción de los tumores de pulmón A /J inducidos por NNK o NNK + nicotina. (F) La cuantificación de membranosa ZO-1.
Discusión
Varias observaciones sugieren que los pacientes en los expuestos a los carcinógenos del tabaco son más propensos a desarrollar tumores más grandes, más vascularizados con un alto propensión a la diseminación metastásica y la resistencia a la quimioterapia [54]. Además, alrededor del 30% de los pacientes con cáncer de pulmón que son fumadores siguen fumando después de haber sido diagnosticado [38]. Esto es problemático, ya que los fumadores que continúan consumiendo tabaco después de un diagnóstico de cáncer o volver a la experiencia de fumar aumentaron consecuencias médicas adversas, tales como: aumento de la progresión del tumor, el desarrollo de un segundo cáncer, mayor recurrencia después del tratamiento con éxito, una mayor mortalidad relacionada con el cáncer y reducción de la calidad de vida [55], [56]. Si bien estos estudios demuestran un papel para los carcinógenos del tabaco en el inicio, el crecimiento y la progresión del cáncer, no se conoce la contribución relativa de la nicotina por sí misma para estos procesos. Este es un aspecto significativo, ya que el uso de suplementos de nicotina es generalmente parte de muchos programas de abandono del hábito de fumar cigarrillos.
Mientras que la nicotina se ha demostrado que induce la proliferación celular, la angiogénesis y el crecimiento de tumores [20], los estudios presentados aquí mostrar por primera vez que los parches de nicotina pueden promover nuevo crecimiento tumoral y la metástasis. Además, nuestros resultados muestran que la presencia de la nicotina puede mejorar el crecimiento de los tumores de pulmón iniciadas por un carcinógeno tabaco. Esencialmente, el A /J modelo de ratón es un reflejo de una situación en la que un fumador que tiene tumores iniciados en el pulmón deja de fumar y utiliza suplementos de nicotina para superar el ansia. Nuestros resultados también muestran que un parche transdérmico de nicotina disponibles en el mercado puede promover el crecimiento de los tumores implantados en ratones.
Nuestros resultados, así como los resultados de laboratorio de John Cooke muestran que la subunidad del receptor α7 es vital para la proliferación celular de la nicotina mediada y la función de Src es indispensable para la nicotina para inducir la proliferación y la angiogénesis [23], [24]. En otro estudio se ha propuesto la participación de los de tipo muscular subunidades de nAChR en la proliferación [57]. Curiosamente, tres estudios diferentes de Europa mostraron un locus de susceptibilidad para el cáncer de pulmón que se asigna a los genes de las subunidades del receptor nicotínico de la acetilcolina en chromosome15q24-25 [58], [59], [60]; este locus contenía genes para a3, a5 y beta 4 subunidades. Las variaciones dentro de este locus se encuentran predominantemente en los fumadores y se correlacionaron con el cáncer de pulmón relacionado con el tabaquismo, así como otras enfermedades como la enfermedad arterial periférica [61]. Estos estudios recientes plantean la posibilidad de que existe una correlación directa entre el estado y, probablemente, función de nAChR y el inicio así como la progresión del cáncer de pulmón en los fumadores [62]. Además, se ha demostrado que NSCLCs de no fumadores expresan niveles más altos de α6β3 subunidades mientras que los fumadores muestran una mayor expresión de a1, a3 y a7 subunidades y una menor expresión de subunidades de nAChR α6β3 [47]. Nuestros estudios presentados en este manuscrito sugieren que la estimulación de nicotina de los nAChR, y, esencialmente, la activación de la función de nAChR, en efecto, contribuyen a la progresión de los cánceres de pulmón.
Existen muchas moléculas de señalización que se sabe que ser activado por la estimulación nAChR . Estos incluyen la activación de Src quinasa cascada, vía de la PI3-Akt, ERK /MAP quinasa cascada, vía NFkB, así como AMP cíclico cascada de señalización. Además, la nicotina se ha demostrado que funcionan en colaboración con estradiol [30]. Estas observaciones plantean la posibilidad de que una amplia gama de señales que emanan de estos receptores afecta a diversos aspectos de la iniciación del tumor, progresión y diseminación metastásica. Este escenario también abre la posibilidad de que la orientación de una o más de estas vías puede ser beneficioso en la lucha contra este tipo de neoplasias.
El hallazgo de que las moléculas de adhesión epitelial como E-cadherina y su pareja de unión β-catenina se ven afectados por la nicotina proporciona una base molecular para estos hallazgos. Se puede imaginar que la nicotina, a través de las vías de señalización nAChR, induce cambios en los patrones de expresión génica para facilitar EMT y la metástasis tumoral. De hecho, se ha informado de que el patrón de expresión de las subunidades de nAChR es diferente en los tumores de los fumadores y los no fumadores [63], [64].