Extracto
dolor por cáncer de huesos es el más grave entre el dolor por cáncer y es a menudo resistente a los analgésicos actuales. Por lo tanto, se desea el desarrollo de nuevos analgésicos eficaces en el tratamiento del dolor del cáncer de hueso. antagonistas de los receptores del factor activador de plaquetas (PAF) fueron recientemente demostrado tener dolor eficaz para aliviar los efectos sobre el dolor neuropático en varios modelos animales. El presente estudio examinó el efecto de alivio del dolor de antagonistas del receptor de PAF en el dolor del cáncer de hueso con el cáncer de hueso fémur modelo (FBC) en ratones. Los animales fueron inyectados con células NCTC2472 osteolíticas en la tibia, y, posteriormente, se evaluaron los efectos de los antagonistas de los receptores de PAF sobre los comportamientos de dolor. Una sustancia química estructuralmente diferentes tipos de antagonistas, TCV-309, BN 50739 y WEB 2086 mejoró la alodinia y la mejora de los comportamientos de dolor como la vigilancia del comportamiento y la integridad física de uso de anomalías en ratones modelo FBC. El dolor efectos de estos antagonistas aliviar se logra con dosis bajas y tuvieron una duración prolongada. El bloqueo de los receptores de PAF espinales mediante inyección intratecal de TCV-309 y 2086 WEB o desmontables de la expresión de la proteína del receptor de PAF vertebral mediante transferencia intratecal de PAF receptor de siRNA también produjo un efecto de alivio del dolor. La cantidad de una enzima inducible síntesis PAF, aciltransferasa lisofosfatidilcolina 2 (LPCAT2) proteína aumentó significativamente en la médula espinal después del trasplante de las células tumorales NCTC 2472 en la tibia de ratón. La combinación de la morfina con antagonistas de los receptores de PAF desarrolla marcada mejora del efecto analgésico contra el dolor del cáncer de hueso sin afectar el estreñimiento inducido por morfina. La administración repetida de TCV-309 suprime la aparición de comportamientos de dolor y prolongó la supervivencia de los ratones FBC. Los presentes resultados sugieren que los antagonistas de los receptores de PAF en combinación con, o sin, los opioides pueden representar una nueva estrategia para el tratamiento del dolor del cáncer óseo persistente y mejorar la calidad de vida de los pacientes
Visto:. Morita K, Shiraishi S, Motoyama N, Kitayama T, Kanematsu T, Uezono Y, et al. (2014) La paliación del dolor del cáncer de hueso por los antagonistas del factor activador de plaquetas receptores. PLoS ONE 9 (3): e91746. doi: 10.1371 /journal.pone.0091746
Editor: Theodore John Price, Universidad de Arizona, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de octubre de 2013; Aceptado: 14 Febrero 2014; Publicado: 17 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Morita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en Ayudas a la Investigación Científica (B) 22390349, (C) 21592421 y (C) 24592798 de la Sociedad japonesa para la Promoción de las Ciencias y por el Fondo Nacional del Centro del cáncer de Investigación y Desarrollo (23-a-30 ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
dolor en el cáncer se produce por la presión en, o la estimulación química de, las terminaciones nerviosas del dolor de señalización especializadas llamadas nociceptores (dolor nociceptivo) o puede ser causado por daño o enfermedad que afecta a las fibras nerviosas mismos (dolor neuropático), que es sensible a estímulos que son normalmente no dolorosas; alodinia. dolor por cáncer de huesos es una de las condiciones de dolor más comunes y por lo general graves en pacientes con cáncer [1].
Los opiáceos siguen siendo el pilar del tratamiento del dolor por cáncer, pero además de los efectos secundarios agudos las consecuencias a largo plazo de tolerancia, dependencia, hiperalgesia y la supresión del eje hipotálamo /pituitaria debe ser reconocido. Debido a que los actuales tratamientos disponibles son relativamente ineficaces contra el dolor del cáncer de hueso, casi la mitad de los pacientes con cáncer tienen un control inadecuado del dolor [2], [3]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos analgésicos eficaces en el tratamiento del dolor del cáncer de hueso son obligatorios.
Hemos sugerido anteriormente que factor activador de plaquetas (PAF) puede ser un mediador del dolor neuropático. la inyección de PAF en la médula espinal de ratón causó hiperalgesia térmica y alodinia táctil, que eran al menos en parte mediada por la disfunción de la médula de α3 receptor de glicina (GlyRα3) y fueron bloqueados por los antagonistas del receptor del PAF [4], [5]. Estudios posteriores demostraron PAF bloqueo del receptor reducida comportamientos de dolor provocados en modelos de lesión del nervio. Un antagonista del receptor de PAF, CV-3988, se inyecta cerca del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en ratas o ratones que carecen de receptores de PAF mostró una reducción en la alodinia táctil después de la lesión del nervio espinal [6]. La inyección intratecal del antagonista del receptor PAF, WEB 2086, un derivado de benzodiazepina durante 9 días después de la cirugía en ratas suprimió el desarrollo de alodinia mecánica en un modelo de lesión del nervio escatimado rata [7]. antagonistas de los receptores de PAF, TCV-309 (PAF relacionada), BN 50739 (compuesto relacionado con productos naturales), y WEB 2086, producen efectos anti-alodinia duraderos profundos y largos en varios diferentes modelos de dolor neuropático en ratones, incluyendo una lesión en la ligadura parcial del nervio ciático modelo, un modelo de ligadura del nervio infraorbital parcial, una constricción crónica del modelo de nervio infraorbital lesión (modelo CCI) y un estreptozotocina (STZ) inducida modelo de diabetes [8]. La evidencia sugiere que el PAF contribuye al daño del tejido neural y el comportamiento del dolor después de la lesión del nervio
.
Los modelos animales de dolor por encima investigado debido a cáncer de hueso, en el que se inyectan células tumorales de forma local en el hueso. El presente estudio se utilizó el modelo de cáncer de hueso fémur (FBC) en ratones [9]. Los animales fueron inyectados con células osteolíticas NCTC2472, y posteriormente se evaluaron los efectos de los antagonistas de los receptores de PAF sobre los comportamientos de dolor.
Materiales y Métodos
Animales Experimentales
Los experimentos se realizaron con los ratones C3H /solteros, varones (CLEA Japan, Inc., Tokio), 20-25 g de peso. Todos los procedimientos experimentales y manejo de animales se realizaron de acuerdo tanto a los Principios Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio aprobadas por la Sociedad Japonesa farmacológico y las directrices de la Universidad de Hiroshima, Hiroshima, Japón y las directrices del Centro Instituto Nacional de Investigación del Cáncer, Tokio, Japón. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Hiroshima (Número de Permiso: A-09-17 y A-11-16), y del Centro Nacional del Cáncer (Número de Permiso: T11-004-M02) . Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los animales fueron utilizados para una sola medición en cada experimento
El cáncer de hueso de fémur (FBC) modelo de ratón
Para el modelo FBC, NCTC 2472 células tumorales (Tipo Cuiture Colección Americana, ATCC.; Manassas, VA, EE.UU.) se inyecta en la cavidad medular del fémur distal de ratones C3H /HeN [9]. Las células NCTC 2472 se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (todos los productos de Gibco Laboratories); y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2, entonces pasan semanalmente según las directrices de la ATCC. Para la administración, las células fueron separadas por raspado y luego se centrifuga a 900 rpm durante 3 min. El sedimento se suspendió en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y luego se usa para la inyección intratibial.
Para la implantación, se inyectaron células tumorales siguiendo el protocolo descrito previamente por Honore et al. [9] con una ligera modificación. En resumen, los ratones C3H /HeN fueron anestesiados con una inyección i.p. de pentobarbital sódico (60 mg /kg) inyectado. Para la inoculación intratibial de las células, la rodilla derecha de cada ratón fue doblado y colocado frente al experimentador y una incisión de la piel mínima se hizo la exposición de la meseta tibial. Un escariador dental de calibre 25 se utiliza para perforar la meseta tibial y, una vez retirado, una aguja de calibre 30 unida a una jeringa Hamilton llena de la suspensión de células se introdujo cuidadosamente en la cavidad medular de la tibia. A continuación, 10
5 NCTC 2472 células suspendidas en 5 l de HBSS fueron inyectados lentamente (células vivas). Los grupos de control fueron inyectados con 5 l de HBSS o HBSS que contienen 10 2472 células
5 NCTC muertos por congelación rápida y descongelación dos veces sin protección por el frío y luego lavado con HBSS fresco (amortiguar células). Por último, caviton EX, un sellador temporal hidráulica dental de calidad (GC Dental Products, Co. Ltd., Tokio, Japón) se aplicó a la zona incisa meseta tibial y el procedimiento quirúrgico se completó con la costura de la piel de la rodilla. Los pesos corporales se registraron para cada ratón cada 3 días durante todo el estudio. Los animales fueron sacrificados después de la pérdida de peso superior al 20% del peso corporal o en el momento que demuestra síntomas relacionados, como los movimientos atáxicos graves u otras anormalidades neurológicas debido a preocupaciones éticas.
Administración de Drogas
La gabapentina (1 - (aminometil) ciclohexanoacético) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La morfina se obtuvo de Takeda Pharmaceutical Co., (Osaka, Japón). WEB 2086 (3- [4- (2-clorofenil) -9- metil-6
H
-tieno [3,2-
f
] [1], [2], [ ,,,0],4] triazolo [4,3-
a
] [1], [4] diazepin-2-il] -1- (4-morfolinil) -1-propanona) se obtuvo de Tocris Bioscience ( Ellisville, MO). TCV-309 (3-bromo-5 - [
N-fenil-
N CD - [2 - [[2- (1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinolilo - carboniloxi) etilo] carbamoil] etil] carbamoil] -1-nitrato de propylpyridinium), y BN 50739 (tetrahidro-4,7,8,10methyl- (cloro-2phenyl) 6 [feniltio dimetoxi-3,4-] metiltiocarbonilo-9 pirido [4 ', 3'-4,5] tieno [3,2-
f
] triazol-1,2,4 [4,3
a
] diazepina-1, 4) fueron donados por Takeda Pharmaceutical Co., y el Instituto Henri Beaufour, respectivamente.
TCV-309 y WEB 2086 se disolvieron cada uno en el líquido cefalorraquídeo artificial estéril (ACSF) o solución salina. BN 50739 se disolvió en un disolvente que contiene 25% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Sigma /RBI, Natick, MA) y agua destilada, pH ajustado a ~ 6 usando NaOH 1 N, y se diluyó apropiadamente con ACSF o solución salina. Otros reactivos se disolvieron en ACSF o solución salina. Las soluciones de fármacos se preparan en cada día experimental. composición ACSF (en mM) era NaCl 142, KCl 5, CaCl
2 2 H
2O 2, MgCl
2 · 6H
2O 2, NaH
2 PO
4 1.25, D -glucosa 10, HEPES 10, pH 7,4. TCV-309, BN70329 o WEB 2086 se administró por vía intravenosa 30 min-3 h antes de la evaluación del dolor.
se realizó Desmontables de PAF en el receptor de la médula espinal
Desmontables de FAP receptor de acuerdo con un informe anterior [5]. siRNAs se incorporaron en el virus hemaglutinante del Japón (VHJ) -Envelope Vector de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, después de mezclar 40 l (1 unidad de ensayo, AU) de VHJ-Envelope Vector con 4 l de factor que encierra, la mezcla se centrifugó (10.000 x
g
, 10 min, 4 ° C), y el sedimento en suspensión en 10 l de solución tampón. Después, se añadieron 10 l de una mezcla de solución 3 siRNAs (# 1,#2 y#3, 1 g /l de cada uno), y la mezcla se mantuvo en hielo durante 5 min. ACSF estéril (10 l) que contiene dúplex de siRNA sintéticos (0,45 pmol /animal) se inyectó en el espacio subaracnoideo entre los vertebrados L5 y L6 de ratones conscientes. Las secuencias de oligonucleótido siRNA (sentido) fueron los siguientes: receptor PAF (# 1, 5'-CACCUCAGUGAGAAGUUUUACAGCA-AG-3 ';#2, 5'-ACCCUUCCAAGAAACUAAAUGAGAU-AG-3';#3, 5'-CAACUUCCAUCAGGCUAUUAAUGAU- AG-3 '; las secuencias seleccionadas alrededor de la posición 1005 a 1029, 232 a 256, 893 a la 917, respectivamente, en
PAFR
, GenBank adhesión no D5087).. Por otra parte, siRNA no coinciden con tres o cuatro nucleótidos desajustes se preparó para examinar los efectos no específicos de dúplex siRNA (siRNA#4, 5'-ACUCUGCCAAGAGACUACAUGAGAU-AG-3). Estas secuencias seleccionadas también fueron sometidos a una búsqueda BLAST (Instituto de Bioinformática Centro de Investigación Química, Universidad de Kyoto, Japón) en contra de la secuencia del genoma del ratón para asegurarse de que sólo un gen en el genoma del ratón fue blanco. siRNAs fueron adquiridos de Igene Therapeutics Inc. (Tsukuba, Japón).
Análisis de Comportamiento en el FBC Modelo
El análisis de comportamiento se preformados siguiendo el protocolo descrito anteriormente [5], [10]. Los comportamientos relacionados con el dolor en el modelo FBC fueron evaluados antes y después de la administración del fármaco en 11 días después de la implantación del tumor. Los animales de experimentación y operación simulada se evaluaron para el dolor en curso basado en la vigilancia de comportamiento, para el dolor ambulatoria basada en el miembro de usar anormalidad, y para un comportamiento similar a la alodinia basado en el test de ensayo de filamentos de von Frey y pincel. Que guarda comportamiento, alteración del miembro de usar y dolor alodinia-como se evaluó en los mismos animales. Los ratones fueron colocados en una caja de plástico transparente de observación y se dejó que se habituaran durante 15 min. Entonces, el comportamiento vigilancia espontánea se evaluó durante un periodo de observación de 2 min. El tiempo de elevación de la pata trasera en el lado ipsilateral durante la deambulación se midió como vigilancia de comportamiento. La distrofia muscular del uso anormalidad se puntuó en una escala de 0 a 4: 0, el uso normal de las extremidades; 1, leve cojera; 2, cojera clara; 3, la no utilización parcial de las extremidades; y 4, la no utilización completa de las extremidades. alodinia comportamiento similar se evaluó por acariciar suavemente la pierna lesionada con un pincel (puntuación alodinia) o evaluado midiendo el umbral de retirada de la pata en respuesta a sondear con una serie de filamentos finos calibrados (umbral de alodinia) como se informó anteriormente [5]. La puntuación alodinia se clasificó como se describe por Minami et al. [11]: 0, no hay respuesta; 1, chirrido suave con los intentos de alejarse de la sonda caricias; 2, chirridos vigorosa, mordiendo la sonda caricias y un gran esfuerzo para escapar de la sonda caricias. Los valores son la media de la puntuación total evaluada 3 veces en cada punto temporal (puntuación máxima posible en cada momento: 2 /ratón). Los tiempos de guarda se prolongaron significativamente a los 5 y 6 días después de la implantación del tumor en comparación con los valores de pre-implantación. Del mismo modo, los animales también comenzaron a exhibir la extremidad uso anormal a los 5 días después de la implantación del tumor, y tal comportamiento anormal fue más prominente en los días posteriores. El umbral de alodinia se evaluó midiendo el umbral de retirada de la pata en respuesta a sondeo con monofilamentos de von Frey, y se observaron importantes disminuciones de umbral después de la 3
rd día implantación del tumor posterior en comparación con los valores de pre-implantación, y la disminución alcanzó un pico después de 5 y 7 días. La puntuación alodinia se evaluó midiendo la respuesta ha clasificado a acariciar suavemente con un pincel, y no se observaron aumentos significativos de puntuación después de la implantación del tumor postal 4 días en comparación con los valores de pre-implantación, y el aumento alcanzó un máximo después de 6 y 8 días. Durante todo el experimento, las pruebas de comportamiento se realizó en condiciones ciegas por un solo experimentador. Las inyecciones se realizaron a ciegas por otra persona. La inyección intratecal se llevó a cabo como se describe anteriormente [4].
Determinación de liso-PAF-acetiltransferasa (liso-PAF AT) /Lysophospha- tidylcholine aciltransferasa 2 (LPCAT2), una síntesis de la enzima PAF
las regiones lumbar de la médula espinal (L2-L6) se obtuvieron a partir de ratones que funcionan con simulado (amortiguar células implantadas) o portadores de tumores. Los tejidos de la médula espinal (4,8 a 5,0 mg) fueron homogeneizados en 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) que contiene EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 10 mM, 10 mM de beta-glicerofosfato y 1 g /ml de varios inhibidores de la proteasa ( benzamdine, leupeptina y antipaína). El homogeneizado se hizo reaccionar con 0,6% NP-40 durante 5 min a 4 ° C, seguido de centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min a 4 ° C y se obtuvo el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló a una ración de volumen de 4:01 en 10 mM Tris-HCl (pH 6,8) que contiene 10% (v /v) de glicerol, 2% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,01% de azul de bromofenol y 0,5% β-mercaptoetanol , con la posterior de ebullición a 70 ° C durante 30 min.
Immunoblotting Los ensayos
Las muestras obtenidas se sometieron a electroforesis durante 2 horas a temperatura ambiente en geles de poliacrilamida (gel de apilamiento de 3% y de separación de gel 10% ) y después se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno tratados previamente con 100% de metanol. Las proteínas transferidas sobre las membranas se bloquearon por incubación con solución de bloqueo, un descremada tampón 5% que contiene leche de lavado (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 137 mM y 0,1% de Tween 20), a 25 ° C durante 1 hora Las membranas se expusieron al anticuerpo primario de la siguiente manera: contra LPCAT2 (1:1,000; Sigm); contra β-actina (1:1,000; Innovaciones IMGENEX en genómica funcional, SanDiego, CA) diluida con el tampón de lavado que contiene 1% de leche desnatada durante la noche a 4 ° C, seguido de lavado tres veces con el tampón de lavado, y después de la incubación con una anticuerpo secundario como sigue: para el anticuerpo y el anticuerpo LPCAT2 β-actina, un anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2,000; DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) a temperatura ambiente durante 1 hr. Las membranas se lavaron de nuevo tres veces con el tampón de lavado y se desarrollaron con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) sistema de detección de Western (reactivos ECL, comprados de Thermo Fisher Scientific, y Nacalai Tesque Inc., Kyoto Japón; ImageQuant ™ LAS 4000 mini sistema de detección, GE Healthcare Japón, Tokio, Japón). La densidad de cada banda se analizó mediante software NIH Image, y las unidades densitométricas se corrige utilizando el valor de β-actina. Los datos se expresan como la media ± SEM.
Se proporcionaron
inducida por la morfina estreñimiento
Ratones comida y agua ad libitum antes del período de prueba, y ambos (con o sin TCV-309) grupos cantidades comparables de los alimentos que se consumen antes de la prueba, medida durante un período de 24 horas en el entorno de prueba. Sin comida ni agua estaba disponible durante la prueba. Los ratones fueron enjaulados en cajas de acrílico con suelos de rejilla suspendida sobre papel de filtro. boli fecales se recogieron de cada grupo de ratones cada hora durante 1 hr después de la inyección de solución salina o varias dosis de morfina y el peso de boli fecal se registró como un índice de los efectos de estreñimiento de morfina.
Generación de las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia
la salud de los ratones se examinaron diariamente. Los ratones que presentaban signos de enfermedad se sacrificaron por dislocación cervical de acuerdo con las recomendaciones de nuestro Comité Ético. En nuestra experiencia, estos síntomas preceden al momento de la muerte por un par de días. El momento de la muerte se registró para cada ratón que fue encontrado muerto o murió. Kaplan-Meier de supervivencia se generaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 4; Graphpad, Inc, San Diego, CA):
Análisis estadísticos
Todos los datos se presentan como valores de la media ± SEM. (Error estandar de la media). el software GraphPad Prism versión 4 se utilizó para realizar el análisis estadístico. En cuanto al análisis estadístico de los comportamientos relacionados con el dolor, las comparaciones de los allodynis puntuación, el umbral de retirada, que guarda el comportamiento y la integridad física de usar anormalidad de las diferencias entre los grupos tratados con el fármaco y el grupo tratado con vehículo fueron evaluados usando ANOVA de dos vías seguido mediante la prueba de Tukey-Kramer, o un de Student para datos independientes
t-test
. Las comparaciones de la mediana de supervivencia se realizaron mediante pruebas de Gehan-Breslow-Wilcoxon de rangos logarítmicos y. Un valor de probabilidad (P) de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Efectos de la administración sistémica de antagonistas de los receptores de PAF específico sobre la alodinia táctil y el dolor en los comportamientos FBC Ratones Modelo
.
Efectos de TCV-309 sobre la alodinia y dolor comportamientos (que guardan el comportamiento y la integridad física de usar anomalía) se examinaron en ratones modelo FBC. TCV-309 con un rango de 10 a 300 g /kg por vía i.v. dependiente de la dosis reducida la puntuación de la alodinia (Figura 1A) y el aumento del umbral de retirada (Figura 1B) en 11 a 15 días después de la implantación del tumor en los ratones. Los efectos de la TCV-309 eran bastante larga duración. Por ejemplo, TCV-309 mejoró significativamente la alodinia mecánica por una sola inyección de 100 mg /kg, i.v. con un efecto máximo a 1 a 2 días después de la inyección hasta 6 días. Protección comportamiento se agravó continuamente durante el periodo de observación, mientras que las extremidades de usar anormalidad alcanzó una respuesta máxima y continuó durante el período (Figura 1C, 1D). Conducta protección y la integridad física de usar anomalía también se mejoraron por TCV-309. TCV-309 hasta 1 mg /kg no afectó comportamiento general, o la función motora estimado por la prueba de RotaRod (datos no mostrados). Otros antagonistas de los receptores de PAF, BN 50739 y WEB 2086, también mejoran los comportamientos alodinia y el dolor en los ratones modelo de FBC (Figure1E-1H).
TCV-309 0,01-0,3 mg /kg, WEB 2086 0,1 mg /kg, BN 50739 0,1 mg /kg o un vehículo se inyectaron por vía intravenosa a los 11 días del transplante del tumor posterior. Los ratones de control recibieron inyecciones con un vehículo: solución salina o 25% 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. Los comportamientos relacionados con el dolor que se desarrollaron después de la implantación del tumor en los ratones no se vieron afectados por los tratamientos de vehículos. Los valores representan la media ± SEM. n = 11 ratones por grupo. † P & lt; 0,05, * P & lt; 0,01 en comparación con los valores de control correspondiente (tratado con vehículo), tal como se determina por análisis de varianza seguido por la prueba de Tukey-Kramer
efectos del bloqueo de la columna vertebral de PAF receptores en. alodinia y dolor en Comportamientos FBC modelo de ratón
Para confirmar el sitio de la paliación del dolor por cáncer por antagonistas del PAF, los efectos de la inyección intratecal de TCV-309 y wEB 2086, y también la interferencia en la expresión de receptores de PAF espinales utilizando ARNsi de ARNm del receptor PAF fueron examinados. la administración espinal de 10 pg de estos fármacos 13 días después del implante del tumor producidos rápida y la supresión de la alodinia táctil con el efecto máximo marcado en 1 día después de la implantación y significativamente suprimió la alodinia dentro de 4 días (Figura 2A). efectos de liberación del dolor evaluados por el umbral de retirada, que guarda el comportamiento y la integridad física de usar anormalidad de la inyección intratecal de TCV-309 y WEB 2086 también se lograron (Figura 2B-2D)
(A-D).; Las células tumorales se implantaron en el intramedulla del hueso fémur izquierdo 13 días antes de la inyección intratecal (i.t.) de antagonistas de los receptores de PAF. TCV-309 (10 pg /ratón), WEB 2086 (10 pg /ratón) o el vehículo se inyectaron por vía intratecal en el tiempo "0". Los datos se expresan como la media ± SEM., N = 8-12 ratones por grupo. * P & lt; 0,01 en comparación con el control correspondiente (vehículo tratado) valores, como se determina por análisis de varianza seguido por la prueba de Tukey-Kramer. Los ratones de control recibieron inyecciones con un vehículo: ACSF. Los comportamientos relacionados con el dolor que se desarrollaron después de la implantación del tumor en los ratones no fueron afectados por los tratamientos de vehículos. (E-H); siRNA o no coincidentes siRNA de PAF-receptor mRNA se transfectaron en la médula espinal 13 días después de la implantación del tumor. Los datos se expresan como la media ± SEM. n = 8-10 ratones por grupo. † P & lt; 0,05, * P & lt; 0,01 en comparación con los valores de control correspondiente (no coincidentes transfección siRNA), según lo determinado por análisis de valiance seguido de un Student
t-test
. Los ratones de control recibieron inyecciones con siRNA no coinciden o un vehículo: Sólo VHJ-sobre. Los comportamientos relacionados con el dolor que se desarrollaron después de la implantación del tumor en los ratones no se vieron afectados por los tratamientos de siRNA o vehículos que no coinciden.
Desmontables de la expresión de la proteína del receptor de PAF espinal se logró mediante transferencia intratecal de receptores de la FAP en siRNA ratones. Como se informó anteriormente, una reducción significativa en la expresión del receptor de PAF en ratones normales y de ratones 15 días después de la cirugía en el nervio ciático, alcanzando 37,5 ± 5,4% y 29,9 ± 4,9% del control a los 3 días después de siRNA transfección, respectivamente, mientras que la expresión no se vio alterada por el vector VHJ-E solo o unido mal siRNA [5]. De siRNA transfección 13 días después del implante tumoral, la puntuación de la alodinia, el umbral de retirada, el comportamiento que guardan una anormalidad del miembro de usar se mejoraron con el efecto máximo a las 2 a 3 días después de siRNA transfección, mientras que la acción contra el dolor desapareció gradualmente durante 9 días (Figura 3E-3H). La inyección de siRNA no coincidente no tuvo efecto sobre el desarrollo de conductas alodinia y el dolor. La cantidad de proteína LPCAT2 aumentó significativamente en la médula espinal en 8, 15 y 30 días después del trasplante de las células tumorales NCTC 2472 en ratones tibia (Figura 3). Los resultados apoyan el concepto de que el aumento de PAF en la médula espinal de ratones portadores de tumores puede relacionarse con la producción de dolor, y que el sitio de acción de alivio del dolor de los antagonistas de los receptores de PAF implican la médula espinal en ratones FBC.
alteración de la expresión de la médula LPCAT2 3, 8, 15, y 30 días después de que los niveles de inmunorreactividad se normalizaron a la de la β-actina y representados como% de inducción en comparación con los valores de los ratones con operación simulada (amortiguar células implantadas) (media ± SEM ., n = 5-7). * P & lt; 0,05, *** P & lt; 0,001 frente a los valores correspondientes en los ratones con operación simulada (de Student no pareada
t-test
) guía empresas
Potenciación del efecto analgésico de combinación. los antagonistas del PAF con morfina receptor
dolor del cáncer de hueso es uno de los tipos más graves de dolor por cáncer y es a menudo resistente al tratamiento, incluso con analgésicos opioides. Las combinaciones de opiáceos y analgésicos no opiáceos son una práctica habitual para obtener un mejor efecto analgésico en la práctica clínica. La administración combinada de la morfina con TCV-309 fue examinado (Figura 4A). La morfina 0,1 y 0,3 mg /kg inyección de 1 día después de TCV-309 3 y 10 g /administración kg produjo una marcada reducción en la puntuación de la alodinia en 30 min después de inyección de morfina y el efecto de regresar a cada nivel de TCV-309 sola en 3 a 4 horas después de la administración. La combinación de morfina 1 mg /kg de gabapentina con 10 mg /kg i.v. no tuvo ningún efecto significativo anti-alodinia (Figura 4B). Una gran dosis de gabapentina, 30 mg /kg, se requiere para producir un efecto anti-alodinia transitoria. Morfina sola tuvo poco efecto analgésico a 0,3 a 3 mg /kg, s.c. y un pequeño efecto en 10 mg /kg en el modelo de FBC. Una dosis mayor de 30 mg /kg de morfina fue menos eficaz (Figura 4C).
fueron inyectados TCV-309, 3 y 10 mg /kg i.v. a los 10 días de implantación del tumor poste y la morfina 0,1 mg /kg y 0,3 mg /kg se inyectaron s.c. 1 día después de la inyección de TCV-309 (A). Gabapentina 10 y 30 mg /kg i.v. se inyectaron 11 días después del trasplante del tumor y la morfina, 1 mg /kg se inyectó a 30 min después de la inyección gabapentina (B). La morfina 0,3-30 mg /kg se inyectó a 11 días del transplante del tumor posterior (C). conductas de dolor similar se evaluaron a los 20 min después de la inyección de morfina. Varias dosis de TCV-309 fueron inyectados i.v. a los 11 días de implantación del tumor poste y la morfina 0,3 mg /kg se inyectaron s.c. 1 días después de la inyección de TCV-309 (D). Un día después de la inyección de TCV-309, se inyectaron varias dosis de morfina (E). Los ratones de control recibieron inyecciones con un vehículo: solución salina. Los comportamientos relacionados con el dolor que se desarrollaron después de la implantación del tumor en los ratones no se vieron afectados por los tratamientos de vehículos. Cada grupo contenía 11 ratones.
† P & lt; 0,05, * P & lt; 0,01 en comparación con el control correspondiente (vehículo tratado) valores, como se determina por análisis de varianza seguido por la prueba de Tukey-Kramer.
§p & lt; 0,01 en comparación con el control correspondiente (tratado con vehículo sin morfina) los valores, según lo determinado por análisis de varianza seguido de un Student
t-test
. La relación dosis-respuesta de TCV-309 y la morfina en combinación se muestra en la Figura 4D y Figura 4E. La morfina 0,3 mg /kg y TCV-309 0,1 a 1,0 mg /kg en cada dosis sola no tuvo efecto anti-alodinia, pero en combinación, la alodinia puntuación de disminuyeron en más del 90% en función de la dosis de TCV-309 (Figura 4D ). La morfina en combinación con TCV-309 10 mg /kg tan bajo como 0,03 mg /kg produjo un efecto significativo anti-alodinia y abolió la respuesta alodinia a 0,3 mg /kg (Figura 4E). Ocho días después de la inyección de TCV-309, WEB 2086 y BN 50739, para aliviar el dolor efecto de estos compuestos no se hizo significativa (Figura 5). Sin embargo, la administración adicional de morfina 0,3 mg /kg siendo notablemente mejorado la alodinia y comportamientos de dolor (Figura 5). Estos resultados mostraron que los antagonistas del receptor de PAF logra la potenciación de larga duración del efecto analgésico cuando se administró la morfina.
TCV-309, WEB 2086 y BN 50739 se administraron a los 11 días después de la implantación del tumor. La morfina 0,3 mg /kg s.c. se inyectó a los 8 días después de la inyección de antagonistas de los receptores de PAF. Alodinia (A, B), el comportamiento (C) y la integridad física de usar anormalidad (D) que guarda se evaluaron a los 20 min después de la inyección de morfina. Los valores representan la media ± SEM. n = 11 ratones por grupo. * P & lt; 0,01 en comparación con los valores de control correspondientes, como se determina por análisis de varianza seguido por
t-test
Efecto de antagonistas de los receptores de PAF en morfina inducida de un Student no apareado. el estreñimiento
el estreñimiento es uno de los efectos secundarios más comunes de la morfina y aparece en casi todos los pacientes tratados con morfina. Si el efecto de la morfina obstáculo en la actividad intestinal no se potencia, este efecto secundario de la morfina se podría reducir mediante la reducción de la dosis de morfina sin perturbar el efecto analgésico. La morfina redujo la cantidad de heces de 1 mg /kg s.c. y abolido más de 10 mg /kg. El efecto estreñimiento dependiente de la dosis de morfina no se vio afectada por la TCV-309 10 mg /kg (Figura 6).
Los ratones normales recibido con varias dosis de morfina y las heces acumuladas en el suelo sobre 60-309 fue inyectada 1 día antes de la administración de morfina. Los datos se expresan como la media. n = 10 ratones por grupo.
La administración repetida de TCV-309 Protegido contra la aparición de dolor similar comportamiento
A medida que el efecto anti-alodinia de TCV-309 fue largo duradera, se examinó el efecto de la administración repetida. En los ratones de control, la alodinia táctil apareció a los 3 días después de la implantación del tumor y alcanzó su punto máximo de la respuesta a los 8 días. Conducta protección apareció a los 10 días de la implantación del tumor puesto y aumentó gradualmente a lo largo de 30 días, mientras que las extremidades de usar anomalía apareció a los 8 días y alcanzó un máximo en alrededor de 16 días después de la implantación (Figura 7A-7D). La inyección de TCV-309 a 0,3 mg /kg, i.v. se inició en los ratones del día fueron implantados con el tumor y se continuó cada 4 días durante 28 días. conductas de dolor evaluados por puntuación de la alodinia, el umbral de retirada, Conducta protección y la integridad física de usar anormalidad no aparecieron durante la dosificación (Figura 2). Por lo tanto, el tratamiento con TCV-309 antes de dolor surgió protegido contra crisis de dolor y tolerancia a TCV-309 analgesia no se desarrolló.
La administración de TCV-309 0,3 mg /kg i.v. se inició 6 h antes de la implantación del tumor, dado una vez al día y continuó cada 4 días hasta 28 días. Alodinia (A, B), que guarda comportamiento (C) y la integridad física de usar anormalidad (D) se evaluaron a las 3 horas y 1, 2, 3 días después de la inyección TCV-309. Los datos se expresan como la media ± SEM.