Extracto
Antecedentes
La familia de zinc que contiene los dedos-GATA factores de transcripción juega un papel crítico en la especificación del linaje celular durante el desarrollo embrionario temprano y la formación de órganos. Se encontraron GATA4 y GATA6 que se pierde con frecuencia en el cáncer de ovario, y se propone la pérdida de dar cuenta de la desdiferenciación de las células cancerosas.
Metodología /Principales conclusiones
Además, investigó la expresión de GATA4 GATA6 y en las lesiones epiteliales de ovario superficie y subtipos histológicos de carcinomas de ovario por inmunotinción. GATA4 y GATA6 se encontró que eran ausentes en altos porcentajes (80 a 90%) de las células serosas, clara y endometrioide cáncer de ovario examinados. Por el contrario, ambos se encontraron positivas en 11 de los 12 casos de carcinomas mucinosos, lo que sugiere la expresión de los factores GATA puede distinguir cáncer mucinoso de otros subtipos histológicos. GATA4 fue con frecuencia pierde en lesiones preneoplásicas como quistes de inclusión morfológicamente normales y la hiperplasia epiteliales adyacentes a las células malignas. La pérdida de GATA6 se correlaciona estrechamente con la transformación morfológica neoplásica del epitelio superficial del ovario. En la cultura, GATA4 expresión se redujo progresivamente a pases las células epiteliales de la superficie ovárica primaria, que se correlacionaban con los cambios en la modificación de las histonas del locus GATA4. Una dosis de genes GATA6 reducida como en GATA6 (+/-) ratones dio lugar a un aumento de alteraciones preneoplásicas y quistes de inclusión en los ovarios, lo que sugiere la pérdida de GATA6 contribuye al desarrollo del cáncer de ovario.
Conclusiones /Importancia
Este estudio sugiere que el estado de la expresión de GATA4 y GATA6 puede dictar las vías patológicas distintas que conducen a los carcinomas de ovario seroso o mucinoso. La pérdida de la expresión de GATA4 fácilmente a través de cambios en la conformación de la cromatina sugiere un potencial no fenotípica suceso iniciador, dando lugar a la consiguiente pérdida de GATA6, la transformación morfológica, y la tumorigénesis última
Visto:. Cai KQ, Caslini C, Capo- chichi CD, Slater C, Smith ER, Wu H, et al. (2009) La pérdida de GATA4 y GATA6 Expresión Especifica subtipos histológicos del cáncer ovárico y precede a la transformación neoplásica del epitelio superficial del ovario. PLoS ONE 4 (7): e6454. doi: 10.1371 /journal.pone.0006454
Editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundación para la Investigación de Niños de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2009; Aceptado: June 23, 2009; Publicado: 31 de julio 2009
Derechos de Autor © 2009 Cai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios recibieron el apoyo de los fondos de las subvenciones R01 CA095071, CA79716 y CA75389 a XX Xu, y los fondos de Ovario CA83638 SPORE cáncer P50 (RF Ozols, PI), y Core Subvención#CA006927. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer epitelial de los ovarios generalmente se cree que deriva del epitelio celómico que cubre la superficie del ovario [1], [2] o de los quistes de inclusión que también se cree que deriva del epitelio superficial del ovario [3], [4 ]. Sin embargo, también hay argumentos fuertes que al menos algunos de los cáncer epitelial de ovario originó a partir de células que no sean de los epitelios de superficie [5], [6], [7]. Varios subtipos histológicos distintos se pueden clasificar en base a la morfología celular: son células serosas, mucinoso, clara y subtipos endometroid [8], [9]. Una idea para explicar los diversos subtipos histológicos es que las células epiteliales de la superficie del ovario se someten metaplasia adoptar diversas características histológicas durante la transformación [2], [8]. Otra idea es que el cáncer de ovario puede surgir a partir de los restos de estructuras de los conductos de Müller [6], que son precursores de las trompas de Falopio, el cuello uterino, el útero, etc., y puede presentar como todos los subtipos histológicos de tumores. De hecho, recientes observaciones conducen a la hipótesis de que una parte significativa de los carcinomas de ovario seroso puede proceder de las trompas de Falopio [5], [7], que tiene seroso como las células epiteliales.
Aunque algunas características de las células precursoras pueden retener, la distinción de las células cancerosas a partir de células precursoras es aparente, y varias características de las células neoplásicas se han reconocido [10]. mutaciones genéticas únicas son la base de los fenotipos neoplásicas [11] - [13], y, además, las células cancerosas a menudo aparecen en una etapa diferenciada de manera inapropiada, y el término "desdiferenciación" se utiliza a menudo [14] - [16]. El fenotipo descrito como "indiferenciada" o "dediferenciado" de cáncer de ovario a menudo se refiere a la aparente cambios en las células cancerosas hacia una morfología menos epitelial o la deriva de las células precursoras. Para proporcionar una interpretación molecular de "desdiferenciación" de las células cancerosas, se puede considerar el concepto de la diferenciación del linaje celular importante en la biología del desarrollo, en el que una célula primordial sufre cambios en su perfil de expresión génica global hacia un tipo de célula madura específica. Por analogía, la desdiferenciación de las células cancerosas puede ser causada por la pérdida de uno o más genes que son críticos clave en la inducción de la diferenciación de un tipo de célula primordial para producir las células epiteliales de ovario superficie. Estudios recientes sugieren que la pérdida de la GATA6 factor de transcripción y GATA4 en cáncer de ovario puede explicar la pérdida de las características epiteliales y pueden ser el mecanismo subyacente de "desdiferenciación" de las células de cáncer de ovario [17], [18].
Los factores de transcripción GATA unen una secuencia /TGATAA /G consenso a en promotores y se conservan en insectos y vertebrados, de mosca para los seres humanos [19]. GATA4 y GATA6 se expresan en la mayoría de los órganos, y juegan un papel crítico en el desarrollo de estos órganos [20], [21]. GATA4 y GATA6 se expresan primero durante la formación del endodermo extraembrionario diferenciado de las células madre embrionarias pluripotentes de la masa celular interna durante el desarrollo embrionario temprano [22] - [25]. GATA factores no son específico de tejido, sino más bien la función en la especificación y diferenciación de linajes de células dentro de un órgano, tales como la diferenciación de un linaje de células epiteliales a partir de células del estroma. GATA4 y GATA6 se expresan en células epiteliales superficiales de ovario humano [17], [18], y, presumiblemente, GATA4 y GATA6 son importantes para la formación y el mantenimiento del estado diferenciado de las células epiteliales de ovario superficie. GATA4 y GATA6 a menudo se pierden en las células de cáncer de ovario [17], [26], y se especula que la pérdida de estos importantes en el desarrollo de factores de transcripción puede ser el mecanismo subyacente de desdiferenciación [17], [18].
Si GATA6 es importante para la formación de la superficie del epitelio de ovario se desconoce, ya que se sabe poco acerca de la derivación de las células epiteliales de la superficie del ovario. Ambas proteínas GATA4 y GATA6 se expresan en células epiteliales de ovario superficie, pero ausente en la mayoría de las células de cáncer de ovario [17], [18], [26]. Nos encontramos por el chip de ensayo que la histona H3 y H4 acetilación del locus GATA4 disminuyeron en gran medida en las células cancerosas en comparación con las células no tumorales GATA4-positivas [18]. Por el contrario, las histonas H3 y H4 acetilación del locus GATA6 en muchas células de cáncer no se redujo y trazas de GATA6 mRNA podrían ser detectados por RT-PCR, indicando que el gen GATA6 no es silenciada transcriptionally pero el mensaje es suprimido por otro mecanismo (s ) [18].
se han identificado pocos objetivos de transcripción de los factores GATA, y discapacitados-2 (Dab2) es un objetivo de transcripción conocido de GATA6 [27]. Dab2 también se encontró perdido en el cáncer de ovario [28], que se correlaciona con la ausencia de GATA6 y transformación morfológica [18]. deficiencia Dab2 en ratones conduce a la letalidad embrionaria temprana [29] - [31], y los ratones mutantes heterocigotos Dab2 desarrollar lesiones pre-neoplásicas de la superficie del ovario epitelios [32]. Dab2 es un adaptador de proteínas implicados en el tráfico endocítica, y Dab2 juega un papel en el establecimiento y la superficie epitelial de la polaridad de posicionamiento [33]. La pérdida de Dab2 se cree que causa la transformación morfológica de la superficie del ovario epitelios [34], [35]. Por lo tanto, una especulación es que la pérdida de GATA6 dará lugar a la pérdida de Dab2 y la transformación morfológica neoplásica del epitelio superficial del ovario.
En el estudio actual, que además analiza los detalles de GATA4 y expresión GATA6 en tejidos de ovario y cáncer y examinado el impacto de la reducción de GATA6 en ratones sobre la transformación del epitelio superficial del ovario.
resultados
la expresión de GATA4 y GATA6 en subtipos histológicos de cáncer de ovario
Antes, tanto se observaron GATA4 y GATA6 estar fuertemente expresada en células epiteliales de superficie primarios de ovario, pero ausente en las células de cáncer de ovario cultivadas tanto por Western blot para examinar la proteína o transferencia de Northern para medir ARNm [17], [18].
con un mayor desarrollo de anticuerpos y refinamiento del procedimiento de tinción, se realizó un análisis inmunohistoquímico de la expresión de GATA4 y GATA6 en un panel de tejidos de ovario no neoplásicas y cáncer en los microarrays de tejidos (Tabla 1). Otros tejidos de ovario 26 no cancerosas de ooforectomías profilácticos también se utilizaron en este estudio. Estos tejidos ováricos se obtuvieron de dos mujeres de alto riesgo y normales, pero no se encontró cáncer microscópico [36]. Las 111 carcinomas de ovario informativos en los microarrays de tejidos utilizados en este estudio consisten en 82 serosa, 12, 12 mucinoso de células claras, y 5 subtipos endometrioide (Tabla 1). En la monocapa normal de la superficie del ovario epitelios, todas las células epiteliales de la superficie del ovario se tiñeron positivo para GATA4 nuclear y GATA6 (Figura 1A). Mientras GATA4 y tinción GATA6 son ausente o muy reducida en los carcinomas de ovario más (Tabla 1). Entre los casos informativos, se encontró pérdida de GATA4 en 81/82 (99%) de los carcinomas serosos, 1/12 (8,3%) de los carcinomas mucinosos, 11/12 (92%) de los carcinomas de células claras y 5/5 ( 100%) de los carcinomas endometrioide. La pérdida de GATA6 se encontró en 55/82 (67%) de los carcinomas serosos, 1/12 (8,3%) de los carcinomas mucinosos, 10/12 (83%) de carcinoma de células claras y 5/5 (100%) de endometroide carcinomas. Ejemplos de las immunostainings se muestran en la Figura 1, para un GATA4- y carcinoma seroso GATA6-negativo (Figura 1B), un carcinoma seroso GATA4-negativa, pero GATA6-positivos (Figura 1C), un carcinoma seroso GATA6-negativa, pero GATA4-positivo (Figura 1D), y un carcinoma mucinoso GATA4 y GATA6-positivos (Figura 1E). También es notable que algunos GATA4 y /o GATA6 tinción está presente en las células del estroma en ambos ovarios normales y tímidos, aunque la mayoría de estos tinción no son tan intensas como las de las células epiteliales. En algunos casos, como se ve en el tumor se muestra en la Figura 1B, algunas pequeñas células del estroma, probablemente las células inmunes y linfocítica, muestran fuerte tinción nuclear de GATA4.
Immunostainings de GATA4 y GATA6 se realizaron en 111 carcinomas de ovario, incluyendo la 4 subtipos histológicos. Los resultados se resumen en la Tabla 1. A. células epiteliales de superficie ovárica normal son positivas tanto para GATA4 y GATA6 en el núcleo. 200 × magnificación. B. Un ejemplo de tanto GATA4- y carcinoma seroso GATA6-negativas. 40 aumentos. C. Un ejemplo de carcinoma seroso GATA4-negativas y GATA6-positivo. 40 aumentos. D. Un ejemplo de carcinoma seroso GATA4-positivas y GATA6-negativas. 40 aumentos. E. Un ejemplo de tanto GATA4- y carcinoma mucinoso GATA6-positivo. 40 aumentos. E, epitelio; T, tumor; S, estroma.
Una característica notable de GATA4 y tinción GATA6 es que a pesar de GATA4 y GATA6 se pierden en el cáncer de ovario más (subtipo predominantemente serosa), carcinomas del subtipo mucinoso son en su mayoría GATA4 - y GATA6-positivas (Tabla 1). Por lo tanto, la expresión de GATA4 y GATA6 distingue carcinomas mucinosos de otros subtipos histológicos.
La pérdida de GATA4 precede a la pérdida de GATA6 en pre-neoplásica de superficie y quiste ovárico epitelios
GATA4 expresión está ausente en el mayoría de cáncer de ovario seroso, y GATA6 también está ausente en muchos, pero también positiva en algunos casos (Tabla 1). GATA6 negativo y positivo GATA4 existen sólo en raros casos de carcinomas de ovario. Por lo tanto, la pérdida de GATA4 parece ser más frecuente que la pérdida de GATA6 en el cáncer de ovario.
Anteriormente, se observaron carcinomas microscópicos y cambios morfológicos pre-neoplásicas en ooforectomías profilácticos, que muestra la utilidad de estos tejidos en el estudio de la iniciación del cáncer epitelial de ovario [37]. En el presente análisis, se encontró que los 26 casos de tejidos de ovario de ooforectomías profilácticos que no contienen tumores microscópicos, pero exhibió lesiones morfológicamente alterados derivadas de la superficie del ovario o quiste epitelio [36]. En algunos carcinomas ováricos abiertas, las monocapas morfológicamente normales de las células epiteliales se encuentran adyacentes a las células malignas. El hecho de que la proximidad física, estas células epiteliales normales morfológicos pueden compartir algunas características con las células neoplásicas. Por la inmunotinción, se encontró que en la mayoría de los casos está ausente y GATA4 GATA6 es positiva en la una sola capa, las lesiones morfológicamente benignos, como se muestra mediante un ejemplo (Figura 2A). En un segundo ejemplo, las células epiteliales que recubren la superficie del ovario son positivos para GATA6 y negativo para GATA4, y los quistes epiteliales debajo de la superficie perdieron ambos GATA4 y GATA6 expresión (Figura 2B).
Cada diapositivas de las 26 muestras contiene un número variable de lesiones con grados variables de cambios morfológicos. Hemos examinado sobre 80 de las lesiones que hacer varias descripciones generales: GATA4 es negativo en aproximadamente 80% de los epitelios de superficie y GATA4 está ausente en casi todas las lesiones evidentes y también sobre las monocapas medio morfológicamente normales. GATA6 está generalmente presente (70%) en las lesiones epiteliales, y la pérdida de GATA6 se correlaciona con cambios morfológicos neoplásicas (múltiples de capas epiteliales) en aproximadamente 90% de los casos. Por lo tanto, la pérdida de GATA4 a menudo precede a la pérdida de GATA6, y la pérdida de GATA4 y GATA6 se produce antes de la transformación maligna de las células epiteliales de la superficie del ovario.
inmunotinción de GATA4 y GATA6 en la superficie del ovario morfológicamente normal y /o epitelio quiste encontrado en ovario carcinomas. A. Un epitelio superficial del ovario es positivo para GATA6 y negativo para GATA4. Se observa tinción positiva en el estroma GATA4. B. Un epitelio superficial del ovario es positivo para GATA6 y negativo para GATA4. Tanto GATA4 y GATA6 se pierden en las células epiteliales del quiste adyacentes a la superficie. 200 × magnificación. E, epitelio; C, quiste; S, estroma.
La pérdida de GATA4 y /o GATA6 se correlaciona estrechamente con el epitelio transformación morfológica
A través de los años, se conformó una colección de 12 carcinomas de ovario que contienen las lesiones del epitelio contigua la vinculación de las células epiteliales benignos morfológicamente a células cancerosas manifiestos [35]. Estas lesiones también se han descrito previamente para cistoadenocarcinomas ováricos mucinosos y serosos [38]. Pensamos que la presencia de una transición de benigno a maligno puede ser útil para determinar la implicación de los genes candidatos en la tumorigénesis epitelial de ovario. De hecho, en todos los 12 casos de benigno a las transiciones neoplásicas analizadas, la pérdida de GATA4 y /o GATA6 estrechamente asociadas con la transformación morfológica neoplásica. En el primer ejemplo (figura 3A), GATA4 ya está ausente en la monocapa benigna; GATA6 es positivo en la monocapa de células, pero se pierde en las células cancerosas adyacentes. La pérdida de GATA6 se correlaciona estrechamente con la pérdida de su objetivo de transcripción Dab2 (Figura 3A). En un segundo ejemplo, GATA4 y expresión GATA6 se pierden simultáneamente, estrechamente asociado con la pérdida de Dab2 y transformación morfológica (Figura 3B). El agrandamiento benigno de sitio de transición neoplásica (Figura 3B, paneles inferiores) muestra que GATA4 se pierde bruscamente y GATA6 se reduce en gran medida de la transición.
Los ejemplos de cáncer de ovario humano manchado de GATA4, GATA6, y en Dab2 secciones de tumores adyacentes. A. Un epitelio superficial del ovario que consiste en un epitelio superficial (cabeza de flecha) morfológicamente normales contigua que une las células malignas (flecha) que han invadido ya sea en el estroma o ampliados en las áreas alrededor del ovario. GATA4 es negativo tanto en las células epiteliales normales o neoplásicas morfológicas. Las células epiteliales en el epitelio normal morfológico son positivos para GATA6 y Dab2, y las células malignas son negativos para GATA6 y Dab2. Algunas células dispersas en el estroma son Dab2 positivo, pero negativo para GATA6. Estas células son macrófagos en el que la expresión no es Dab2 GATA6-dependiente. B. En este carcinoma de ovario, las células epiteliales en el epitelio normal morfológico son positivos para GATA4, GATA6, y Dab2, y las células malignas adyacentes son negativos para GATA4, GATA6, y Dab2. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio con una ampliación de 100 x. Las tinciones para GATA4 y GATA6 en la transición en el panel B se muestran en un aumento mayor (400 veces) en los paneles inferiores. E, epitelio; C, quiste; S, estroma; T, tumor.
Por lo tanto, la pérdida de expresión GATA6 se correlaciona estrechamente con la transformación neoplásica de la superficie del epitelio de ovario, como se observa en contigua epitelio superficial del ovario de conexión morfológicamente normal a células malignas (Figura 3). En estudios anteriores [18], [35], el epitelio superficial del ovario inmediatamente adyacente a las zonas tumorales se consideró que era pre-neoplásicas. Estas lesiones pre-neoplásicas a menudo carecen de una membrana basal intacta como se indica por la ausencia de colágeno IV y tinción laminina, así como la pérdida de expresión Dab2 [35]. En los epitelios morfológicamente normales inmediatamente adyacentes a las zonas tumorales, tanto GATA6 y Dab2 son positivos. Sin embargo, las células neoplásicas de forma contigua conectados son negativos tanto para GATA6 y tinción Dab2. Las células neoplásicas en el epitelio transformado que se conecta inmediatamente a las células epiteliales de la superficie de ovario morfológicamente normales son probablemente más similar a la normal, y por lo tanto se consideran células tumorales tempranas. Este análisis sugiere la posibilidad de que la pérdida de GATA6 es uno de los factores causantes de la transformación epitelial de ovario.
Las observaciones de los tejidos de cáncer de ovario humano sugiere que la pérdida de la expresión de GATA4 a menudo precede a la pérdida de GATA6, y la pérdida de GATA6, en correlación con la pérdida de Dab2, se asocia con la transformación morfológica epitelial.
Reducción de la expresión del factor GATA sobre los pases de las células epiteliales de la superficie del ovario en cultivos primarios
Durante los últimos 5 años en el estudios de factores GATA en las células epiteliales y de cultivo de la superficie del ovario, se encontró que GATA4 está ausente en líneas celulares de cáncer de ovario más y también SV-40-transfectadas, "inmortalizada" células epiteliales superficiales de ovario [17], [18]. Además, la expresión de GATA4 fue variable en cultivos primarios de células epiteliales de la superficie de ovario humano. Por lo tanto, se especula que la expresión de GATA4 no es estable en las células epiteliales de la superficie del ovario y puede reducir gradualmente con el tiempo.
Para probar esta idea, hemos seguido atentamente los pasajes de las células epiteliales de la superficie del ovario primarios en la cultura y las horas extraordinarias monitoreado la expresión de GATA4, GATA6, y los genes Dab2. Se recogieron las células epiteliales superficiales de ovario de ovarios ooforectomías profilácticos como se describe anteriormente [17], [18]. Los tejidos fueron examinados y se determinó que eran morfológicamente normales y sin efecto de los tumores microscópicos. El tiempo de duplicación celular fue alrededor de dos semanas y se acortarán a una semana a 5 días en los pasajes posteriores. Hemos llevado a cabo los pasos de una preparación de células manguera (ROE 1.005.816) para el paso 10 durante un período de dos meses y las células todavía eran altamente proliferativa al final. Típicamente, las células pueden crecer en cultivo durante aproximadamente 20 pasajes más de un período de 6 meses antes de someterse a la senescencia replicativa. En cada paso, la mitad de las células se recogieron y se utiliza para el análisis de expresión, y la otra mitad se mantuvo de forma continua en cultivo.
En primer lugar, los cambios en la morfología de las células epiteliales de la superficie del ovario eran obvias. Inicialmente, las células parecían ser redonda y plana, con una morfología "de adoquines", y cada vez que las células se hicieron alargadas y de tipo huso, y se observó que los cambios más dramáticos en el paso 4 (Figura 4A). los niveles de ARNm de GATA4 se encontró que reduce rápidamente, y se convirtieron en no detectable por el paso 4 (Figura 4B, C). La expresión de GATA6 y su objetivo transcripción Dab2, reducido poco a poco con el tiempo, y los niveles de ARNm de ambos genes eran 20 a 30% de las células originales (Figura 4C). Como control, mantenimiento de la casa gen TBP (caja TATA proteína de unión, número de acceso NM_003194) nivel de expresión tuvo cambios significativos en el transcurso de la cultura, y la variación probablemente refleja el margen de error del ensayo.
las células epiteliales superficiales de ovario humanos se aislaron a partir de ovarios humanos morfológicamente normales obtenidos de la cirugía ooforectomía. Las células se pasaron 10 veces durante un período de 3 meses, y las células se recogieron de cada pasaje para el análisis de mRNA. A. Morfología de las células en el paso#1, 2, 4, 6, 8, 10. B. El ARN total se utilizaron para cuantitativa en tiempo real RT-PCR para ensayar los niveles de mRNA. Los resultados se presentan como un "mapa de calor". C. La cantidad de mRNA en relación con el paso 1 se cuantificó y se presenta como un gráfico de barras.
Por lo tanto, todos los GATA4, GATA6, y los niveles de ARNm Dab2 se reducen al paso de las células epiteliales de la superficie ovárica primaria en la cultura. La pérdida de GATA4 precede a la pérdida de GATA6 (y Dab2), similar a la observación en los epitelios de ovario pre-neoplásicas adyacentes a los carcinomas de ovario, en los que GATA4 a menudo se pierde antes de GATA6. Anteriormente, la pérdida de GATA4 y GATA6 en el cáncer de ovario y células epiteliales se demostró que mediante el mecanismo de hypoacetylation de las histonas H3 y H4 y la pérdida de la histona H3 /lisina trimethylation K4 en sus promotores [18]. La expresión génica se determina por el patrón de la modificación de histonas asociada, conocida como los códigos de histonas [39]. La pérdida de la acetilación de histonas conduce a una conformación de la cromatina más compacta y pérdida de la actividad transcripcional [40], y asociados de la histona H3 /lisina K4 metilación con genes activos [41], [42]. La pérdida fácilmente de GATA4 y GATA6 expresión sugiere que la inestabilidad de la conformación estados epigenéticos /cromatina, consistente con la pérdida temprana de los factores GATA en la tumorigénesis de ovario.
Alteración de la modificación de la cromatina en el locus GATA4 asociado con la pérdida de expresión a pases de células epiteliales de ovario superficie en cultivos primarios
Para determinar la causa de la reducción de la expresión del factor GATA en cultivos primarios, en primer lugar determinar la expresión en un gran panel de células epiteliales superficiales de ovario y células cancerosas. ARN total fue aislado de 8 preparaciones de células primarias MANGUERA (de 7 personas, aquí, C.47 y D.47 se separaron de las mismas preparaciones MANGUERA pero fueron cultivadas por los diferentes miembros del personal de laboratorio), 6 HIO líneas que son las células transfectadas con MANGUERA SV40-T-antigent para prolongar la vida útil del cultivo, y 6 líneas de células de cáncer de ovario (Figura 5). El ARN se sometió a semi-cuantitativos de RT-PCR (Figura 5A) y en tiempo real de RT-PCR (Figura 5B) para determinar los niveles de ARNm para GATA4, GATA6, Dab2, y GAPDH o BHD como controles de carga. GATA4 expresión se reduce en algunas preparaciones manguera y líneas de HIO, y está ausente en todas las líneas de cáncer según lo determinado por tanto semi-cuantitativos de RT-PCR en tiempo real y RT-PCR (Figura 5 A, B). Reducción de GATA6 y expresión Dab2 en HIO y líneas de cáncer es más evidente por tiempo real de RT-PCR (Figura 5B).
células epiteliales superficiales de ovario humano se aislaron a partir de ovarios humanos morfológicamente normales obtenidos de la cirugía ooforectomía. Varias líneas de HIO también se establecieron mediante la transfección de las células primarias con SV-40 T-antígeno para prolongar la duración de la vida en las culturas. El ARN total aislado a partir de una colección de la manguera principal, HIO, y las células cancerosas se utilizaron para: A. Semi-RT-PCR cuantitativa, y B. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR, para analizar los niveles de ARNm de GATA4, GATA6, Dab2, y GAPDH (semi-cuantitativos RT-PCR) o BHD (en tiempo real RT-PCR) como controles de carga. Suficiente ARN se obtuvieron de HOSE.96 (o C.96), el paso#3; HOSE.47 células, el paso nº 5; y HOSE.63 células, el paso#12; para el ensayo CHIP. C. Se muestra la ubicación de los cebadores F3 y R3 en GATA4 gen para PCR en el chip de ensayo. D. lisados de HOSE.96, HOSE.47, HOSE.63, ES2, SKOV3, A2780, OVCAR3, y OVCAR10 se prepararon para el ensayo CHIP. precipitaciones cromatina por anticuerpos contra Ac H3, H4 Ac, Me
2H3K4, Me
3H3K4, Me
2H3K9, Me
2H3K27, y HPγ1 se utilizaron para amplificar mediante PCR utilizando cebadores F3 y R3. Se incluyeron la señal de entrada ( "in", el 2% de cromatinas totales utilizados para la inmunoprecipitación), sin control de anticuerpos ( "no"), y el control sin molde ( "H
2O"). Se muestran las imágenes de campo claro de los productos de la PCR semi-cuantitativa. E. Se muestra la ubicación de los cebadores F2 y B2 en el gen GATA6 para PCR en el ensayo CHIP. F. lisado de HOSE.96, HOSE.47, A2780, OVCAR3, y OVCAR10 se prepararon para el ensayo CHIP. Se muestran las imágenes de campo claro de los productos de PCR semicuantitativos.
Hemos sido capaces de obtener una cantidad suficiente de células 3 MANGUERA primarios (HOSE.96, HOSE.47, y HOSE.63) para su posterior estudio de los cambios en la modificación de la cromatina de la GATA4 y GATA6 locus por chip de ensayo durante los pases de las células en los cultivos. Los niveles de expresión de GATA4 correlacionar inversamente con el número de pases de las células: HOSE.96 (o C.96) las células, el paso#3, tienen una expresión de alto GATA4; HOSE.47 células, el paso#5, tienen un nivel de GATA4 inferior; y HOSE.63 células, el paso#12, tener un nivel de expresión muy reducida (Figura 5B).
Siguiendo el protocolo establecido con anterioridad por chip de ensayo para GATA4 y GATA6 genes [18], hemos encontrado que, de hecho, en un sitio inmediatamente aguas arriba de la GATA4 exón 1 (Figura 5C), la reducción de los niveles de expresión GATA4 se correlaciona con la pérdida de la acetilación de la histona H3 y H4 (Figura 5D). No se observaron cambios significativos para los di y tri metilación de H3K4, marcadores para la conformación activa de la cromatina [41], [42]. Sin embargo, dimethylation de la histona H3 en la lisina 9 y 27 (Me
2H3K9, Me
2H3K27) y HP1 está ausente, lo que sugiere el gen silenciado GATA4 no está siendo incorporado en la heterocromatina [43].
junto a la reducción de acetilación de las histonas H3 y H4 en células A2780, los patrones de modificación de las histonas en el locus GATA6 (Figura 5E) es similar entre las células de la manguera y líneas de cáncer de OVCAR3 y OVCAR10 (Figura 5F), lo que sugiere la modificación de la modificación de histonas en GATA6 locus no es un evento en general en las células epiteliales y cáncer de ovario.
tumor de ovario fenotipo propensos de GATA6 heterogénea ratones
Encontrar una estrecha correlación entre la pérdida de GATA6 y la transformación del epitelio nos llevó a especular que la pérdida de GATA6 puede ser causal en la transformación de células epiteliales de ovario superficie. Las observaciones anteriores también sugieren que la pérdida de GATA6 puede ser más crítico que la pérdida de GATA4 en la promoción de la transformación epitelial de ovario. Para determinar la consecuencia de la pérdida de GATA6 en el epitelio superficial del ovario, se determinó el fenotipo de ovario de GATA6 (+/-) ratones, ya que los ratones homocigotos son embriones letal [24], [25]. Hemos obtenido y mantenido una colonia de ratones knockout GATA6 en los últimos 2 años. tejidos ováricos fueron cosechadas de los ratones en alrededor de un año de edad, y (+/-) de tipo salvaje y se compararon la morfología de los ovarios de los compañeros de camada de GATA6. Sorprendentemente, los ovarios de GATA6 (+/-) genotipo exhibido algunas anomalías (Tabla 2): Algunos ovarios tienen extensas lesiones proliferativas del epitelio de la superficie (Figura 6A), y los otros tienen grandes quistes ováricos que son positivas para citoqueratina (Figura 6B ). El fenotipo de ovario se asemeja a los de
Dab2 gratis (+/-) ratones [32], en consonancia con Dab2 como un objetivo GATA6 la transcripción y mediador [27].
La morfología ovárica de GATA6 (+ /-) y compañeros de camada de tipo salvaje de aproximadamente un año de edad se comparó. tinción de citoqueratina fue utilizado como un marcador para las células epiteliales. A. Un ejemplo típico de un ovario de tipo salvaje muestra numerosos folículos en diversas etapas de desarrollo cerrados dentro de una capa de epitelio superficial. Un representante GATA6 (+/-) ovario muestra la presencia de derivación de células epiteliales de la superficie (flecha). B. Una gran parte de GATA6 (+/-) ovarios también exhibe grandes quistes dentro de los ovarios. Las células que revisten los quistes son citoqueratina (paneles inferiores) positivos. Todas las imágenes fueron tomadas con un microscopio con una ampliación de 100 aumentos.
Por lo tanto, este resultado sugiere influencias deficiencia GATA6 epitelio superficial del ovario, posiblemente promover la transformación del tejido, aunque deleción específica de GATA6 en el epitelio superficial del ovario células serán una mejor prueba, cuando los ratones knockout condicional GATA6 estén disponibles.
Discusión
Este estudio examinó la expresión de GATA 4 y GATA6 en las células epiteliales de ovario superficie y carcinomas en detalle, y se encontró que la pérdida de GATA4 es más amplia difusión y, a menudo precede GATA6 en la transformación del epitelio superficial del ovario. La pérdida de GATA6, sin embargo, se correlaciona estrechamente con la transformación morfológica de los epitelios. La facilidad de la reducción de GATA4 y GATA6 expresión en cultivo de las células epiteliales de la superficie del ovario sugiere la inestabilidad de la epigenética conformación estado /cromatina de GATA4 y GATA6 locus, consistente con la pérdida temprana en la tumorigénesis de ovario. La pérdida temprana de GATA4 y GATA6 y la estrecha correlación con la transformación neoplásica del epitelio superficial del ovario sugiere un papel causal, que es apoyada por la prevalencia de lesiones epiteliales de ovario en ratones con deficiencia de heterocigotos GATA6 [32].
a diferencia de otros subtipos histológicos, los carcinomas de ovario mucinoso en general son positivos para GATA4 y expresión GATA6. De hecho, la morfología de los carcinomas de ovario mucinoso es muy singular en que las células cancerosas parecen mantener la polaridad apical y existen a menudo como el epitelio monocapa.
La pérdida rápida de GATA4 en pases de células primarias en cultivo es intrigante. La pérdida de expresión de GATA4 en pases de células primarias en cultivo asociados con la pérdida de H3 y H4 acetilación de histonas en el locus promotor GATA4. La pérdida de GATA4 en líneas celulares de cáncer también aparece mediado por la reducción de H3 y la histona H4 acetilación del locus promotor.