Extracto
epitelio-mesenquimal transición (EMT), el cambio fenotípico de Las células de un epitelio de tipo mesenquimal, se piensa que es un acontecimiento clave en la invasión y metástasis de adenocarcinomas. Estos cambios incluyen la pérdida de expresión de la queratina, así como pérdida de la polaridad celular y la adhesión. Nosotros aquí El objetivo fue determinar si la pérdida de expresión en sí queratina unidades aumentó la invasión y metástasis en los adenocarcinomas y si la pérdida de queratina conduce a los cambios fenotípicos asociados con EMT. Por lo tanto, se empleó un modelo murino descrito recientemente en la que la supresión condicional del clúster queratina II por Cre-recombinasa conduce a la pérdida de toda la familia keratinmultiprotein. Estos ratones se cruzaron en un modelo de cáncer inducible recién generado Cre-recombinasa KRAS impulsada murino de pulmón para examinar el efecto de la pérdida de la queratina en la morfología, la invasión y la metástasis así como la expresión de genes relacionados EMT en los tumores resultantes. Estamos aquí demostrar claramente que la pérdida de un citoesqueleto queratina funcional no alteró significativamente la morfología del tumor o la biología en términos de invasión, metástasis, la proliferación o la carga tumoral y no dio lugar a la inducción de la EMT. Además, las células tumorales no indujeron sincrónicamente expresión de vimentina, que a menudo se ve en EMT, para compensar la pérdida de queratina. En resumen, nuestros datos sugieren que los cambios en la forma celular y la migración que subyacen EMT dependen de cambios en las vías que causan cambios secundarios en la expresión y la organización de la queratina de señalización. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la pérdida de la queratina citoesqueleto per se no es suficiente para causalmente EMT unidad en este modelo de tumor
Visto:. König K, L Meder, Kröger C, L Diehl, Florin A, Rommerscheidt-alboroto U, et al. (2013) La pérdida de la queratina del citoesqueleto no es suficiente para inducir epitelial mesenquimal transición en una esporádica cáncer de pulmón de ratón Modelo Novel KRAS Driven. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10.1371 /journal.pone.0057996
Editor: Victoria Lawson, Universidad de Melbourne, Australia |
Recibido: 24 Septiembre, 2012; Aceptado 30 de enero de 2013; Publicado: 11 de marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 König et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por el Consejo de investigación alemán a través de SFB 832, Projekt A5 y Z1 y de la ayuda del cáncer de alemán a través de la CIO de Colonia /Bonn. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cambios fenotípicos de un epitelial a un tipo de células mesenquimales, que se refiere como epitelio-mesenquimal transición (EMT), son pasos clave para la invasión y la metástasis del cáncer. Un sello distintivo de EMT se cree que la remodelación del citoesqueleto, tales como la regulación hacia abajo de las queratinas epiteliales, lo que conduce a alteraciones en las adhesiones y los cambios de célula a célula en la polaridad celular y la motilidad [1]. Estos cambios se han descrito en la mayoría de tipos de adenocarcinomas y se cree que apoyar la invasividad de los tumores y la formación de metástasis [2] y la resistencia a la quimioterapia [3].
El cáncer de pulmón, la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo, tradicionalmente se ha dividido en los carcinomas de pulmón de células pequeñas (SCLC) y carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). SCLCs representan el 20% de los cánceres de pulmón [4]. NSCLC se subdividen en tres subtipos histológicos: tumores de carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y neuroendocrino. NSCLC forman tumores primarios grandes cohesivos que difieren de SCLCs, que son clínicamente muy agresivo y revelan una tasa de mortalidad del 95% [5]. SCLCs metástasis muy temprano, son no cohesivo y muestran un patrón difuso y crecimiento infiltrante. Histológicamente, se caracterizan por un citoesqueleto queratina incompleta y condensada presentan una distribución marcada y perinuclear.
Con la creciente aplicación de la terapia dirigida EGFR inhibidor de la tirosina quinasa (TKI) en adenocarcinomas del pulmón, varios mecanismos de resistencia contra este La terapia han surgido. Por una parte, se han observado mutaciones que causan cambios estéricos en la proteína o la evasión del objetivo inhibido objetivo a través de la contratación de un segundo transductor receptor o la señal. Por otra parte, la transformación linaje epitelial por sometidos a mesenquimal transición (EMT) [6] o la recaída de TKI tratada NSCLS como cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) se han descrito [7], [8]. Por lo tanto, estas observaciones clínicas apoyan la hipótesis de que la progresión del NSCLC a SCLCs puede ser desencadenada por la EMT.
Dado que la pérdida de expresión de queratina se piensa que es el centro de la EMT, la detección de disminución o pérdida de expresión de queratinas
In vivo
se utiliza como marcador de la EMT en muchos
in vivo
sistemas modelo, así como en las secciones histológicas humanos. La pérdida de queratinas conduce a la pérdida de las uniones celulares, tales como desmosomas funcionales y medias uniones, y por lo tanto, una fuerte adhesión célula-célula [9], [10]. En particular, la expresión de las uniones adherentes está regulada por genes EMT tanto en adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas del pulmón [11].
Sin embargo, el papel funcional preciso de la pérdida de queratina sobre el crecimiento tumoral, la metástasis y la invasión y su papel en la EMT no se ha establecido claramente en cualquier modelo de tumor. Por lo tanto, investigamos si la pérdida completa de la expresión de la queratina induce EMT, invasión y metástasis. Con este fin, hemos desarrollado un novedoso modelo inducible de ratón para el adenocarcinoma de pulmón defectuoso en todo el tipo de queratina grupo II fracaso para formar causando ningún filamentos de queratina funcional. Usando este modelo, que aquí muestran que la pérdida completa de la queratina en tumores de pulmón mutado KRAS no afecta a la morfología del tumor, la invasión o la metástasis, lo que indica que la pérdida del citoesqueleto de la queratina no está impulsando la transición de los tumores de pulmón en carcinoma de pulmón de células pequeñas o un fenotipo sarcomatoide . Por otra parte, los marcadores de EMT no estaban regulados en los adenocarcinomas de queratina deficientes.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la FELASA. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Bonn. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Generación de ratones transgénicos RASLO
Para inducir tumores de pulmón, generamos un vector de expresión que expresa un gen KRAS mutado
Val12, así como una molécula de fusión que consta de ovoalbúmina, un S-tag y una molécula de luciferasa dirigido por un promotor 1,8 kb de pollo ß-actina [4] después de la eliminación mediada por Cre de un codón STOP. RASLO ratones fueron generados por la inyección pronúcleo de C57BL /6 × embriones FVB F1 con los KRAS oncogénicos constructo representan en la Figura 1A. Los ratones fueron criados en las instalaciones de animales central de la Universidad de Bonn, según la Federación de directrices de la Asociación Europea de la Ciencia Animal de Laboratorio. La Comisión de Cuidado de Animales de Nordrhein-Westfalen aprobó todos los experimentos con ratones.
(A) constructo esquemático que muestra la estrategia utilizada para generar el modelo inducible KRAS cáncer de pulmón accionado (RASLO). imagen Bio-luminiscencia tomada con una cámara IVIS-200 (Xenogen) de los fibroblastos de la cola culturas de los ratones fundadores RASLO después del tratamiento con la proteína 2 M TAT-CRE y la adición de luciferina justo antes de la imagen (B), que muestra las señales fuertes en 5 ratones fundadores . (C) de la luciferasa de formación de imágenes (IVIS-200) durante 1 min a medio sensibilidad de ratones RASLO 6 semanas después de la inducción con 2 × 10
7 PFU de Adeno-CRE i.n (+) o los controles de reproducción. (-). Los ratones fueron inyectados i.p. con luciferina en 200 l de PBS y se anestesiaron por inhalación de isoflurano. (D) la imagen macroscópica del pulmón de un ratón RASLO 6 semanas después de la administración AdCre, y (E) HE tiñeron sección con múltiples tumores en 100x y 400x aumentos. análisis (F) por PCR de ADN aislado a partir de líneas celulares derivadas de tumor de RASLO y RASLO × KIIf /ratones D muestran un producto de PCR de 240 pb que indica que la casete de parada se ha eliminado con éxito por CRE recombinasa en el tumor. El vector utilizado para generar la cepa de ratón (pRASLO) antes del tratamiento CRE muestra un fragmento de 1200 pb. El mismo vector Cre después del tratamiento in vitro sirve como control positivo para la escisión mediada por CRE y muestra a la banda esperada de 240 pb después de la recombinación.
La detección de ratones transgénicos RASLO
recortes de la cola de los fundadores fueron utilizados para establecer cultivos de fibroblastos y análisis de PCR. Por lo tanto puntas de la cola se esterilizaron con 70% de etanol, cortado en trozos pequeños y se digirió con colagenasa durante cuatro horas a 37 ° C. Ellos se cultivaron en medio DMEM suministrado con 8% de FCS, glutamina 2 mM y penicilina /estreptomicina. Después de cinco días, los fibroblastos de la cola fueron tratadas con 2 mM de proteína Tat-Cre durante siete horas y al día siguiente analizado bajo la cámara de bioluminiscencia IVIS 200 después de la adición de luciferina al medio de cultivo. PCR y ensayo de luciferasa positivos fundadores fueron utilizados para establecer varias cepas RASLO. La genotipificación se realizó mediante PCR utilizando la cola hacia adelante (5'-CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 ') y atrás primers (5'-CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3').
Producción y Administración de adenovirus CRE
HEK 293 células se infectaron con adenovirus recombinante que expresa Cre-recombinasa (AdCre) [12] con (MOI = 5). Después de cinco días, se recogieron las células y el virus fue liberado por los ciclos de congelación y descongelación rápida. Virus se purificó por ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cesio [13] A partir de entonces, las reservas de virus se generaron a través de concentración utilizando cassettes Slidalyzer (Thermo Fisher Scientific).
Antes de nasal aplicación de ratones AdCre fueron anestesiados con una combinación de 10 mg /ml ketamina /0,1% Rompun en PBS. Dependiendo del peso corporal del ratón entre 150 ml y 200 l se inyectó i.p. 2 × 10
7 UFP de AdCre se pipeta en la nariz de los ratones para ser inhalado. Los animales fueron observados hasta que esté completamente despierto y cómodo. No se observaron signos de estrés y malestar. Después de la inducción del tumor, los animales se controlaron diariamente para detectar signos de malestar o dificultad respiratoria. Los ratones fueron excluidos de análisis adicionales, cuando los ratones mostraban síntomas de estrés respiratorio. Los ratones se obtuvieron imágenes sobre una base regular bajo IVIS cámara 200 bioluminiscencia (PerkinElmer). Brevemente, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano y luego recibieron 2,8 mg de D-luciferina Firefly (Caliper) en 200 l de PBS i.p. y fotografiado en un escenario calentado. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de 6 semanas de administración AdCre. Los pulmones se fijaron inmediatamente en formalina al 4% tamponado con PBS durante 24 horas para la inclusión en parafina, o se congelaron en nitrógeno líquido para la crio-conservación.
Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
ADN fue aislado de las líneas celulares generadas a partir de los tumores de pulmón de ratones transgénicos o de tejido congelado (FF) de pulmón fresco con DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng de ADN molde se utilizó por reacción. Cada reacción de PCR contenía tampón 1x, dNTP 0,2 mM, MgCl 2 mM
2, 0,2 U Taq polimerasa y 0,2 M de imprimación. Para mostrar la escisión exitosa de los sitios loxP 5 'Lox5 forward: 5'-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3' y 3 'Ras5 inversa: 5'-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3' se utilizaron dando un producto de 240 pb. Sin escisión del codón STOP estos cebadores producen un producto de 1,2 kb. Para confirmar la escisión locus queratina se utilizaron los siguientes cebadores: DEL (hacia adelante 5'TGAACCCAGGAGGTTGAGAC-3 'y revertir 5'TGGCGTCGTGATTAGTGATGA) y FLOX (hacia adelante 5'GATAACCGTATTACCGCCTTTG-3' y revertir 5'CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 ').
líneas celulares
se utilizaron las siguientes líneas celulares de origen humano: A549, H1975, H460, HCC827, DMS114, y SW1271 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. R. Thomas (Universidad de Colonia) proporcionado amablemente: N417 [14], PC9 [15]. Glc1, glc2 [16], y GLC36 [17] eran una especie de regalo del Dr. L. de Leij (Universidad de Groningen, Groningen, Países Bajos). líneas celulares de NSCLC y SCLC se cultivaron en medio DMEM suplementado con 8% de FCS se incubaron a 37 ° C y 5% de CO
2
líneas de células de pulmón de ratón fueron generados a partir RASLO KII + /+ y KIIf /. - ratones. Los tumores se escindieron con un escalpelo y se digirieron durante al menos 3 horas a 37 ° C en medio DMEM /medio F12 de Ham con L-glutamina suplementado con albúmina bovina al 2%, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 600 U /ml de colagenasa, 5 g /insulina humana ml, 200 U /ml de hialuronidasa, tampón Hepes 10 mM, y penicilina /estreptomicina. La suspensión celular se filtró glóbulos rojos dos veces y se lisaron con tampón de lisis ACK. Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con murinos EGF 20 ng /ml, factores de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) 20 ng /ml, la sal de heparina de sodio a partir de la especie porcina intestinal mucosa 4 g /ml, B-27 Suplemento libre de suero, penicilina /estreptomicina y gentamicina 35 mg /ml.
QRT-PCR
El ARN total fue aislado de líneas celulares de cáncer de pulmón humano o tejido pulmonar de ratón crio-conservados (5 veces 10 micras) se desliza por RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng de ARN total fue transcrito en cDNA utilizando superíndices ™ III H
- la transcriptasa reversa y oligo (dT) 12-18 (Life Technologies). QRT-PCR se realizó con SYBR Green (Qiagen) con cebadores dirigidos contra queratina 8 (hacia adelante 5'-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 'e inverso 5'-CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3'). Como control se utilizó el servicio de limpieza 28 s ARN (adelante 5'-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 'y revertir 5'-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3'). cebadores luciferasa tenían la siguiente secuencia: adelante 5'-TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 'y revertir 5'TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3'; y como control de limpieza 18 s: 5 'hacia adelante. ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3' y revertir 5'-3 'TGACCGCGGACAGAAGGCCC
Todos los QRT-PCR se ejecutan en el sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosystems ), y se analizaron con software SDS2.2 (Applied Biosystems). Todas las muestras fueron analizadas por triplicado y nivel de expresión se calculó utilizando el método ΔΔCT.
inmunofluorescencia de líneas celulares de cáncer de pulmón
Las células se sembraron en cubreobjetos durante la noche y se fijaron en metanol enfriado con hielo durante 5 minutos , después se tiñeron con pan-queratina (1:100, MNF116, Dako) y DP-1 (1:100, DP-1, Progen) diluido en TBS /1% BSA /5% NGS durante 1 hora a temperatura ambiente. Correspondientes anticuerpos secundarios de cabra anti-gp
Alexa488 (1:800, Life Technologies), de cabra anti-ratón
TexasRed (1:800, Life Technologies) y DAPI (1:1000, Life Technologies) diluido en TBS /1% BSA /5% NGS se añadieron a las células durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio invertido equipado con un ApoTome (Zeiss).
La inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en formalina al 4% tamponado con PBS, se incluyeron en parafina (FFPE). 3 micras diapositivas se utilizan para las tinciones histológicas. La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [18]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: Ki67 (01:25, TEC-3, Dako), K8 /18 (1:100, GP11, Progen), vimentina (1:100, EPR3776, Abcam), E-cadherina (1:50 , SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), ß-catenina (1:100,#4270, Cell Signaling), CD56 (1:50, RNL-1, Abcam), Caracol (1:200, Abcam), sinaptofisina (1 :200, SY38, Abcam), cromogranina A (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), perk (1:50, Señalización celular), CD44 (1:50, Abcam). Todas las diapositivas fueron escaneados con un escáner de diapositivas Pannoramic 250 (3D Histech.com).
Estadísticas
Las estadísticas se calcularon con Excel, Prisma y SPSS. Las barras de error indican el error estándar de la media. Se utilizó la prueba t de Student para analizar los datos de las diferencias significativas. P-valores & lt; 0,05 se consideraron significativos e indicados en las figuras de la siguiente manera:. * P ≤ 0,05, ** *** p≤0.01, p≤0.001
Resultados
Generación RASLO modelo murino de cáncer de pulmón
Hemos generado un nuevo modelo murino transgénico (RASLO) para el adenocarcinoma de pulmón, que tras la eliminación de la recombinasa CRE-inducida de un codón de parada es conducida por un KRAS oncogénicos constitutivamente activados
Val12 bajo el control de un promotor de pollo 1,8 kb ß-actina. El constructo también expresa un gen de fusión que consiste en una etiqueta S (para inmunohistoquímica), luciferasa (para la detección in vivo de tumores) y ovoalbúmina de pollo (como un antígeno modelo de tumor) por medio de un virus de polioma sitio re-entrada ribosomal interno ( Fig. 1A). ratones RASLO se generaron por inyección pronúcleo de embriones C57Bl /6 × FVB F1. Los animales resultantes se seleccionaron para la integración exitosa de una construcción funcional, mediante la incubación de cultivos de fibroblastos de la cola con la proteína Tat-Cre recombinante [19] para escindir el cassette para y activa el constructo
in vitro
. Posteriormente, estos fibroblastos se obtuvieron imágenes con una cámara IVIS 200 bioluminiscencia después de la adición de luciferina al medio de cultivo (Fig. 1B) para identificar a los animales con una integración completamente funcional del constructo RASLO. Cinco fundadores fueron identificados basado en PCR y ensayos de luciferasa, una de las cuales mostraban la transmisión de la línea germinal.
aplicó un adenovirus que expresa recombinasa CRE (AdCre) por vía intranasal (por vía intranasal) para RASLO ratones. Los tumores de pulmón desarrollados en estos ratones después de 6 a 8 semanas que podrían ser visualizadas
in vivo
por la detección de la bioluminiscencia después de i.p. inyección de luciferina (Fig. 1C) y eran macroscópicamente detectable
ex vivo
como numerosos nódulos blancos que cubren los pulmones (Fig. 1D). Los tumores que surgen en los ratones tratados con RASLO AdCre comprenden múltiples adenomas papilares y adenocarcinomas papilares invasivos (Fig. 1E), que es coherente con los modelos de cáncer de pulmón impulsado KRAS descritos anteriormente [4], [20]. La formación de tumores se estableció exclusivamente en el pulmón, ya que no se observó la formación de tumores en ningún otro órgano de los ratones tratados con RASLO AdCre. El análisis genómico por PCR de las líneas celulares establecidas a partir de los tumores de pulmón reveló RASLO lograr la supresión de la casete de parada (Fig. 1F).
reducción de la expresión de la queratina en el CPCP
La pérdida de expresión de queratina se observa con frecuencia durante la EMT así como la transformación de un adenocarcinoma de un carcinoma de células pequeñas (SCLC) [8]. Por lo tanto, teñidas adenocarcinomas de pulmón humanos y las muestras pequeñas de cáncer de pulmón de células para queratinas y observamos solamente tinción de la queratina perinuclearmente condensado en las muestras de SCLC en comparación con una fuerte tinción citoplasmática en las cohesivamente crecimiento adenocarcinomas de pulmón (Fig. 2A paneles superiores). Se observó un patrón de tinción similar de queratinas en cultivos celulares de adenocarcinoma y las líneas celulares de SCLC por tinción de inmunofluorescencia (Fig. 2A, paneles inferiores). Además, se tiñeron para desmoplaquina que, cuando se ausente, conduce al crecimiento del tumor invasivo y más está ausente o reducida en muchos cánceres epiteliales humanos [21]. En SCLC, desmoplakina estaba ausente, mientras que el NSCLC expresó desmoplakina (Fig. 2A). Además, investigó si las queratinas se expresan diferencialmente en CPNM y CEP líneas celulares. De hecho, las líneas celulares de SCLC expresan poco o nada de ARNm para la queratina 8, mientras que las líneas de NSCLC expresaron altos niveles de queratina 8 mRNA (Fig. 2B).
Inmunohistoquímica de FFPE muestras de tumores (A) para la cacerola de la queratina de adenocarcinoma de el pulmón y un típico SCLC (paneles superiores de a). Inmunofluorescencia de un adenocarcinoma (HCC827) y la línea de células SCLC (GLC36) teñidas para un molde de la queratina (rojo) y desmoplakina (DSP en verde) (A, paneles inferiores). (B) ARN total fue aislado de un panel de SCLC humano y líneas celulares de NSCLC. la expresión del ARNm relativa de la queratina 8 se midió mediante qRT-PCR media de la expresión relativa de los análisis de cuatro ejemplares se representan cada una las líneas celulares y el SEM se indica. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student: * p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representativos de tres experimentos independientes.
Pérdida de la queratina in vivo no conduce a la EMT o una más agresivo Biología Tumoral
Para investigar si la pérdida de la expresión de queratina en los adenocarcinomas pulmonares funcionalmente las derivaciones en peor biología del tumor mediante la inducción de la EMT o una pequeña fenotipo celular, cruzamos los ratones RASLO con la línea KO queratina inducible (KII). RASLO ratones con un racimo de tipo salvaje Tipo II queratina (KII + /+) o abrigo a uno de tipo salvaje y un alelo de knock-out (KII +/-) o uno floxed y un alelo ronda (KII f /-) fueron tratados con AdCre por vía intranasal. Los tres grupos de ratones desarrollaron tumores que eran detectable
in vivo
por imágenes de bioluminiscencia dentro de las 6 semanas (Fig. 3A). Seis semanas después del tratamiento AdCre, los ratones se sacrificaron y se evaluó la carga tumoral y la morfología. Para confirmar el genotipo de los ratones y los tumores de pulmón, se realizó reacciones de PCR en ADN extraído de todo el pulmón de los ratones con cebadores específicos para el constructo RASLO, el borrado y el floxed queratina tipo dos cluster (Fig. 3B). Todos los ratones mostraron la presencia de RASLO construir, y como se esperaba solamente KII +/- y KII f /- mostraron la inserción del locus DEL, y exclusivamente a los ratones con el KII f /- alelo dio la banda de PCR esperado (Fig. 3B) . Se utilizaron tres medidas diferentes para cuantificar la carga tumoral de KII + /+, +/- y KII KII f /- de los animales. En primer lugar, se cuantificó la carga tumoral mediante la medición de la cantidad de ARNm de luciferasa en tumor teniendo pulmones medio de QRT-PCR (Fig. 3C). La expresión de luciferasa se puede correlacionar con la carga tumoral, ya que es co-expresada por el constructo RASLO. No se observó una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de mRNA de luciferasa entre los grupos. Esto indica que una expresión de la queratina reducido no conduce a una carga de tumor aumentado.
(A) Grupos de ratones transgénicos RASLO cruzó en diferentes alelos de racimo queratina II fueron anestesiados con ketamina /Rompun y 2 × 10
∧7 pfu AdCre se administraron en 6 semanas previamente. Para la detección de tumores, los ratones fueron inyectados i.p. con luciferina en 200 l de PBS y fotografiada con una cámara de IVIS-200 (Xenogen). Bioluminescense comparando representante de tipo salvaje (ctrl), RASLO transgénico con el tipo salvaje de la queratina locus (KII + /+), RASLO transgénicos heterocigotos con la queratina de la expresión en el grupo II (KII +/-) y de ratones transgénicos RASLO con una ronda y uno floxed Queratina grupo II alelo (KII f /-) se muestran aquí. Los diferentes grupos mostraron señales de bioluminiscencia con intensidad comparable. análisis (B) El alelo por PCR específica para el ADN aislado de tumores de pulmón crio-conservados de ratones RASLO para detectar la FLOX, DEL, y se realizaron alelos RASLO. nivel de expresión (C) de la luciferasa de ARNm se determinaron en los pulmones crio-conservado de QRT-PCR para estimar la carga de tumor. El nivel de expresión de ARN se normalizó a 18 s. (D) La cuantificación de la carga tumoral por área en tres secciones por pulmón. Tres secciones HE representativo por cada pulmón se analizaron con respecto al porcentaje del área tumoral (panel superior) y el tamaño del tumor (panel inferior). FFPE secciones se tiñeron para K8 /18 y la imagen con Pannoramic250 escáner de diapositivas (3DHistech). diámetro del tumor máxima de hasta treinta tumores tumorales representante por diapositiva se midió con el 3DHistech Pannoramic Visor y el diámetro máximo medio de comparar entre los diferentes genotipos. (F) tinción inmunohistoquímica para queratinas 8 y 18 en los tumores de RASLO KII f /- ratones. (GRAMO). La barra de escala representa 100 micras. Los tumores de tipo salvaje RASLO (izquierda) en comparación con KII - /- tumores de la derecha se muestran como manchas de HE (paneles superiores) y la queratina 8 y 18 valores (paneles inferiores) se representan como media +/- SEM. La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student: * p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representativos de tres experimentos independientes.
Además, se calculó la carga tumoral mediante la evaluación del% de la superficie pulmonar cubierta por tumor en tres secciones sagitales de los pulmones por dos observadores independientes cegados. Esto reveló que los tumores de tamaño comparable desarrollados en los ratones que llevan RASLO los diferentes genotipos de queratina (Fig. 3D). Además, el tamaño del tumor se evaluó midiendo el diámetro del tumor usando imágenes de cortes histológicos escaneados. Una comparación entre los diferentes genotipos no reveló diferencias significativas (fig. 3E). Estos datos sugieren que la ausencia de al menos un alelo de la agrupación queratina tipo II no afecta significativamente la biología del tumor en este modelo KRAS guiado de adenocarcinoma de pulmón.
La activación del constructo KRAS requiere la CRE eliminación mediada de un fragmento grande de ADN de 800 pb que incluye un codón de parada (Fig. 1A). Para eliminar todo el clúster queratina tipo II, un fragmento de ADN de 0,68 Mbs debe ser eliminado [10], [22]. Por lo tanto, no esperábamos que todos los tumores en RASLO × KIIf /- ratones sería completamente desprovisto de queratinas. Para visualizar los tumores en los pulmones de RASLO × KIIf /- ratones en los que el floxed KII-alelo se ha eliminado correctamente, teñidas secciones de parafina para las queratinas 8/18. Alrededor del 30% de los tumores carecía completamente la expresión de la queratina, lo que indica que la supresión mediada por cre-hecho de la agrupación KII no fue tan eficiente como la activación de la construcción KRAS (Fig. 3F). Morfológicamente, los tumores de queratina deficientes eran adenomas y adenocarcinomas papilares típicos indistinguibles de los tumores positivos de queratina vecinos en la misma diapositiva (Fig. 3F) o de tumores pulmonares KRAS-inducida de animales de tipo salvaje de queratina (Fig. 3G). Para examinar si la pérdida de queratina tuvo una influencia en la proliferación o la tasa de apoptosis en los tumores de pulmón impulsado KRAS, a fin de determinar las tasas de proliferación y las tasas de apoptosis por Ki67 y troceados tinción de caspasa 3, respectivamente, pero no observamos diferencias significativas (Fig. 4A, B) . En resumen, estos datos proporcionan pruebas de que la pérdida de expresión de la queratina no afecta el tamaño de las células tumorales de KRAS impulsado adenocarcinomas de pulmón murino y que la presencia de 30% de los tumores negativos de queratina no alteró la carga global de tumor, lo que sugiere que la pérdida de la expresión de la queratina no está directamente involucrado en el establecimiento de la celda pequeña y fenotipo agresivo de SCLC
(a) Ki-67 inmunohistoquímica de un KII -. /- tumor deficiente (comparar Figura 5 de la misma serie de secciones en serie). (B) Análisis formal de 6 zonas por pulmonar de seis Queratina de tipo salvaje y KII - /- tumores revela el índice de proliferación Ki-67 similares. Exfoliados caspasa 3 tinción sólo mostró células positivas simples (flecha roja) en la queratina en deficiente (- /-). Queratina y tumores que expresan (KII) guía empresas
Pérdida de la queratina no influir en la expresión de la EMT y neuroendocrino marcadores en tumores de pulmón
La reducción de la expresión de la queratina y la condensación en un patrón perinuclear puntúan es una característica de neuroendocrino pequeñas de cáncer de pulmón de células y es ampliamente utilizado como un marcador para la EMT en los adenocarcinomas. Aunque los tumores negativos de queratina que surge en el AdCre tratados con KRAS × KIIf /- ratones no difieren morfológicamente de sus tumores positivos de queratina vecinos, se investigó si los tumores negativos de queratina expresan marcadores adicionales asociados con la EMT y el fenotipo SCLC
la inmunohistoquímica reveló que la vimentina intermedia de filamentos de proteína de tipo III, que es con frecuencia hasta reguladas durante la transición epitelial a mesenquimal (EMT) después de la pérdida de la expresión de la queratina (Mani ua, 2008), no fue ni expresa en los tumores de queratina-positivos ni negativos al de la KRAS × KIIf /- ratones (Fig. 5). Por otra parte, la cromogranina A, CD56, y sinaptofisina, son marcadores inmunohistoquímicos normalmente expresadas en CNECP del pulmón [23], [24]. Sin embargo, tanto los tumores queratina-positivos y negativos en el KRAS × KIIf /- ratones no expresan ninguno de estos marcadores (Fig. 5). Los controles positivos para la especificidad de las tinciones se muestran en la figura S1. A continuación, analizó marcadores asociados con la pérdida de los contactos célula-célula durante la EMT. En particular, la pérdida de E-cadherina inducida por varios represores transcripcionales como el caracol, y la babosa [25] es típico de la EMT. Sin embargo, no hemos encontrado que los tumores de queratina deficientes sobreexpresado los represores transcripcionales caracol, barra o perdido la expresión de E-cadherina (Fig. 6).
Los ratones fueron anestesiados y 2 × 10
7 UFP adeno -CRE virus se pipeta en la nariz del ratón para ser inhalado. Los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas y se extrajeron los pulmones de los ratones y se fijaron con formalina y embebidos en parafina. Centros de salud integrados para K8 /18, vimentina, cromogranina A (cromo), CD56 y sinaptofisina (synapto) se muestran. Un aumento mayor de un tumor negativo de la queratina se muestra en la columna de la derecha y el área del recuadro de la izquierda.
Seis semanas después de la administración adeno-Cre, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los pulmones de los ratones y se fija con formalina y embebidos en parafina. Un mayor aumento de un tumor negativo queratina se muestra en la columna de la derecha y el área en caja a la izquierda. Se muestran tinciones de sección de un número de marcadores de EMT, es decir, E-cadherina, caracoles, babosas, y β-catenina.
Desarrollo y mantenimiento de las uniones adherentes depende de un complejo multiproteicos de β-catenina, α catenina y e-cadherina. Tras la activación de la señalización de Wnt, una proporción considerable de ß-catenina en que se transloca al núcleo para activar la expresión de genes asociados con EMT [26]. Estamos manchados de ß-catenina, pero no pudimos detectar ninguna expresión de ß-catenina nuclear de tipo salvaje queratina o tumores deficientes (Fig. 6). Ya no Anteriormente hemos demostrado en líneas celulares que carecen de la agrupación KII, NPV1 y JUP, se encuentran en la membrana [22] Hemos intentado manchar para JUP, y NPV1 en el material FFPE murino. En la figura S2 la tinción de la piel murina de tipo salvaje y KII + /+ para NPV1 se muestran. Pudimos detectar algunos tinción membranosa en la muestra de piel que sirvió como control positivo. Sin embargo, no vimos ninguna tinción membranosa en el tipo silvestre o KII - /- tumores. Además, teñidas RASLO wild-tip y los tumores con deficiencia de queratina durante pMAPK y CD44 y no observamos y la diferencia (Fig. S2). En resumen, la pérdida de queratina en nuestro modelo de tumor de pulmón KRAS no condujo al desarrollo de tumores con un pequeño fenotipo celular o la expresión de marcadores asociados con EMT. Estos datos indican que la pérdida de la queratina por sí mismo no es responsable de la aparición de la EMT o el desarrollo de una pequeña fenotipo celular en adenocarcinomas de pulmón en el modelo de ratón se presenta aquí.
Discusión
Pérdida de la expresión de la queratina es un sello distintivo de ambas pequeñas de cáncer de pulmón de células y EMT y se ha sugerido para mejorar la invasión y la metástasis. Además, en adenocarcinomas de pulmón que han sido tratados con inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR novedoso, la conversión a una pequeña fenotipo celular y EMT ha sido identificado como uno de los varios mecanismos de resistencia para evadir la terapia [8].
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