Crónica enfermedad > Cáncer > artículos del cáncer > PLOS ONE: La sobreexpresión de los genes piRNA vía en epitelial de los ovarios Cancer

PLOS ONE: La sobreexpresión de los genes piRNA vía en epitelial de los ovarios Cancer


Extracto

La importancia de la ARN-pío interactuar (piRNA) y la vía para el mantenimiento de las células germinales, la integridad del genoma, la metilación del ADN y el control retrotransposón plantea posibles funciones de esta vía en el cáncer. De hecho la expresión aberrante de ortólogos humanos y PIWI
Maelstrom
se ha observado en varios tipos de cáncer. En este estudio se analizó la expresión y función de los genes de la vía Pirna en el cáncer de ovario humano, basada en el trabajo reciente, que mostró una amplia expresión de genes de la vía Pirna en los mamíferos. Nuestro trabajo muestra que
PIWIL1
y
MAEL
expresión es significativamente mayor en EOC maligno (n = 25) en comparación con los tejidos tumorales benignas (n = 19) y el tejido ovárico normal (n = 8) . La expresión de
PIWIL3
es menor en los tejidos malignos y benignos en comparación con ovario normal. La secuenciación de
PIWIL1
transcripción reveló que en muchos tumores deleción del exón 17 conduce a la introducción de un codón de parada prematuro en el dominio PIWI, probablemente debido a un error de empalme.
In situ
hibridación en las secciones del tumor reveló que
L1
,
PIWIL1
,
2 Opiniones y
MAEL
se expresan específicamente en células epiteliales células (células cancerosas) del COE. Por otra parte,
piwil2
y
MAEL ¿Cuáles son co-expresados ​​en las células del estroma adyacente a las células tumorales. Desde
PIWIL1
y
MAEL ¿Cuáles son regulados hasta en EOC maligna y se expresa en las células epiteliales, se investigó si estos dos genes afectan la invasividad de las líneas celulares de cáncer de ovario que normalmente no expresan estos genes.
PIWIL1
y
MAEL
fueron transitoriamente sobre expresa en la línea celular de cáncer de ovario SKOV3, seguido de mediciones en tiempo real de invasión de células. Sorprendentemente, tanto
PIWIL1
y
MAEL
más de la expresión disminuye la capacidad de invasión de las células SKOV3. Nuestros resultados apoyan un creciente cuerpo de evidencia que muestra que los genes en esta vía están regulados por incremento en el cáncer. En el cáncer de ovario se muestra por primera vez que
Piwil1 Versión taquigráfica a menudo puede ser resultado anormal en el producto no funcional. En contraste con lo que se ha observado en otros tipos de células, encontramos que
PIWIL1
y
MAEL
tener un efecto represivo sobre la invasividad celular

Visto:. Lim SL, Ricciardelli C, Oehler MK, de Arao Tan IMD, Russell D, Grützner F (2014) La sobreexpresión de los genes piRNA vía en cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10.1371 /journal.pone.0099687

Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América

Recibido: Enero 16, 2014; Aceptado: 19-may de 2014; Publicado: 16 Junio ​​2014

Derechos de Autor © 2014 Lim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue financiado por la Universidad de Adelaida. F.G. está soportado por un arco (Australian Research Council) beca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal, y la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres en el mundo occidental [1]. La tasa de supervivencia relativa a cinco años para las mujeres con cáncer de ovario es sólo alrededor del 40% [1]. los cánceres de ovario son tumores heterogéneos que exhiben características morfológicas distintas, mutaciones genéticas y orígenes. Hay tres tipos principales de cáncer de ovario - epiteliales, células germinales y tumores estromales de los cordones sexuales. Los tumores de células germinales del ovario y tumores estromales de los cordones sexuales comprenden el 10% de los cánceres de ovario, y se derivan de las células germinales primitivas o células mesenquimales de ovario en el tejido derivado del sexo-espinal del ovario, respectivamente [2]. EOC representan más del 90% de los tumores malignos de ovario. Sobre la base de los EOC histología se clasifican en cuatro subtipos principales (seroso, mucinoso, endometrioide y carcinomas de células claras) con más del 70% de los casos diagnosticados como carcinomas serosos (SCS) [3].

Las alteraciones del paisaje epigenético tales como la hipometilación del ADN global y gen hipermetilación del ADN específicos se indican con frecuencia en las células de cáncer [4]. hipometilación del ADN global afecta en gran medida a las regiones intergénicas y intronic del genoma, especialmente repetir secuencias y elementos de transposición (TES), que representan aproximadamente el 55% del genoma humano [5], incluyendo el 17% de
L1
repite [ ,,,0],6]. En las células somáticas, la metilación del ADN de TEs es crucial para prevenir su expresión, que puede poner en peligro la integridad del genoma. Durante el desarrollo de células germinales, hay un período transitorio de la hipometilación del ADN global que resulta en la activación temporal de TEs [7].

La vía piRNA es evolutivamente muy conservada en metazoos y se compone de 21 a 26 nt piRNAs que se unen proteínas PIWI para mediar el control posterior a la traducción de la expresión de TE y juegan un papel en los cambios epigenéticos (tales como la metilación del ADN) a través de la interacción con otras proteínas (tales como MAEL o HP1) [8], [9]. En los mamíferos hay varios
pío como gratis (
Piwil
) genes (tres en ratones, cuatro de los seres humanos). Expresión de
Piwil
genes y Pirna vía asociada genes se ha demostrado en varias etapas de desarrollo de células germinales, en particular, en los testículos.
Piwil1 gratis (
Miwi
) ha sido previamente identificado como un gen que se expresa exclusivamente en los testículos del ratón y esencial para la espermatogénesis [10]. Más recientemente expresión de
Piwil1
también se ha demostrado en el ratón y ovario humano [11]. La mutación de
piwil2
,
Piwil4
y
Hoteles en Mael ratón conduce a fenotipos similares, incluyendo la eliminación de TE metilación del ADN y la esterilidad masculina [8]. Ahora hay cada vez más pruebas de la actividad piRNA también en el ovario de los mamíferos, sin embargo knock out experimentos del gen de la ruta piRNA en ratones hasta el momento sólo ha dado lugar a esterilidad masculina [12] - [14].

Existe una creciente evidencia de actividad de la vía piRNA en varios tipos de cáncer. La expresión de
PIWIL1
y
piwil2
se ha encontrado en una amplia gama de cánceres humanos tales como el estómago, mama, endometrio y el tracto gastrointestinal [15] - [18] y recientemente también en el carcinoma de ovario [19]. expresión de
aumento de PIWIL1
se asocia con el crecimiento tumoral mejorada [20] El aumento en los grados del tumor [21], los malos resultados de diagnóstico [22] y mortalidad [23].
piwil2
se expresa ampliamente en el seno en etapa temprana y cánceres de cuello uterino y células madre precancerosas implicados en la tumorigénesis [18]. El patrón de expresión de
PIWIL3
y
4
sólo se ha estudiado en los cánceres de colon [24].
Maelstrom gratis (
MAEL
) es un gen conocido cáncer de testículo [25].

Nuestro hallazgo de expresión en las células somáticas de ovario [11] junto con una disminución de la metilación del ADN en
L1
región promotora asociada con la progresión de los cánceres de cuello uterino y el útero [26] y un mal pronóstico en los carcinomas de ovario [27] nos llevó a investigar si los genes de la vía Pirna podrían desempeñar un papel en la EOC. En este estudio, se determinó la expresión de
PIWIL1 CD -
4 Opiniones y
Hoteles en MAEL 25 EOC, 19 muestras de tumores benignos y 8 tejidos ováricos normales. Encontramos significativamente elevada expresión de
PIWIL1
y
Hoteles en MAEL EOC en comparación con tejidos ováricos benignos y normales. Sin embargo,
PIWIL1
transcripciones en EOC puede no ser funcional debido a deleciones identificadas en el dominio PIWI de esta transcripción. Por otra parte, la sobreexpresión de
PIWIL1
y
MAEL
sugiere un papel de estos genes en la reducción de las células de cáncer de ovario invasividad
in vitro
.

Materiales y Métodos

tejidos

total RNA de testículo humano y los tejidos de ovario pre-menopausia se compraron de Stratagene (EE.UU.). tejidos ováricos malignos, benignos y normales (Tabla 1 y Tabla S3) se recogieron con el consentimiento informado por escrito del paciente y la aprobación del Comité de Ética del Hospital Royal Adelaide, Adelaide, Australia del Sur.

Cell líneas

líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3 y OVCAR3 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.), mientras que OVCAR5 se obtuvo del Dr. Thomas Hamilton (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA) Johnson et al cáncer Res 57: 850-856 1997. Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (2 mM), penicilina-estreptomicina (100 U /ml, 100μg /ml) (Sigma). células SKOV3 y OVCAR3 se complementaron con 5% de SFB (Invitrogen), mientras que las células OVCAR5 se complementaron con 10% de FBS y 7,5 g /ml de insulina. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una cámara húmeda con CO 2.

aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

Se aisló ARN de tejidos y líneas celulares utilizando reactivo 5%
TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se resuspendió en agua libre de nucleasa, y se almacenó a -80 ° C. ARN se trató con DNasa I (New England Biolabs) antes de la transcripción inversa. 1 g de RNA se utilizó para obtener ADNc usando el sistema Super Escritura III Síntesis de la primera cadena (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, el ARN se incubó con 1μl de 50 oligo mu M (dT)
20 y 1μl de dNTPs 10 mM durante 10 minutos a 65 ° C. Después de la incubación, se añadieron 4μl de tampón 5x RT, 2μl de ditiotreitol (DTT, 0,1 M), 1μl de RNaseOUT (40 U /l) y 1μl de enzima de Super Escritura III RT (200 U /l) y se incubó durante 50 minutos a 50 ° C. La reacción se terminó en 85 ° C durante 5 minutos. ADNc se almacenaron a -20 ° C.


análisis de expresión génica
RT-PCR se realizó para determinar el nivel de ARNm para los genes de la ruta cinco piRNA (Tabla S1) y actina beta (
ACTB
) en 52 muestras de pacientes y 3 líneas celulares de cáncer de ovario. Cada reacción de 25 l contenía 200 ng de cDNA, 5μl de 5x Go Taq verde Master Mix (Promega), 1μl de solución 5 mM dNTP (Roche), 0.5μl de cada cebador (20 pmol /l) y 0.5μl ADN Taq polimerasa. Las condiciones de PCR fueron las mismas para todos los genes, excepto que la temperatura de recocido (Tabla S1), y fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 30 segundos, hibridación a temperatura específica de genes durante 30 segundos ( Tabla S1), extensión a 72 ° C durante 1 min, 32 ciclos. PCR de
ACTB
control se realizó con 27 ciclos, seguido de 5 minutos de extensión final a 72 ° C. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio. intensidad de la banda se midió (Quantity One programa, la versión 4, Bio-Rad), y la intensidad relativa de cada gen se normalizó a la de
ACTB
. Los productos de PCR se confirmaron por secuenciación (kit de secuenciación de ciclo v3.1 Big Dye Terminator, Applied Biosystems). RT-PCR se realizó por triplicado para cada par de cebadores.

análisis de la expresión génica de Estadística

Los datos se presentan como expresión relativa mediana (cuartil primero a tercero cuartil). El nivel de transcripción de cada gen se normalizó en contra
ACTB
. pruebas de Shapiro-Wilk de Kolmogorov-Smirnov y sugirieron que el nivel de expresión de cada gen de todas las 52 muestras no se distribuye normalmente. Por lo tanto, una prueba de Kruskal-Wallis, que utiliza un método no paramétrico, se utilizó para comparar la expresión de genes de grupos malignos, benignos y normales. Se realizó la prueba de correlación de Spearman para investigar la correlación entre la edad del paciente y la consiguiente expresión génica. R-valor cercano a 1 indica una correlación positiva más fuerte, mientras que un R-valor cercano a -1 indica una fuerte correlación negativa. En las pruebas de Kruskal-Wallis y de Spearman, un valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo

ARN
hibridación in situ

Las sondas fueron marcadas con digoxigenina. 11-UTP (Roche Diagnostics) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Fijados con formalina secciones de tejido incluidas en parafina se deparaffinised en xileno y, posteriormente, se lava en etanol graduada. Todas las soluciones se prepararon de dietilo (DEPC) tratados con H
2O para inactivar la actividad RNasa. nucleoproteínas de ARNm unido se eliminaron mediante incubación con proteinasa K (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics) durante 30 minutos a 37 ° C. Los portaobjetos se lavaron con PBS 1x y acetilados (1 M trietanolamina /0,178% HCl /0,25% de anhídrido acético). Los portaobjetos se prehibridaron a 65 ° C durante 2 horas con tampón de prehibridación (solución al 50% de formamida desionizada /2x SSC /1x de Denhardt /0,005 M de tampón de fosfato /10% de sulfato de dextrano /1 mg /levadura ml ARN total /1 mg /esperma de salmón ml ADN) y se hibridaron con aproximadamente 200 ng de la sonda de cRNA en tampón de prehibridación durante una noche a 50 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se lavaron en 2x SSC, 1x SSC, SSC 0,5x y 0,1x SSC durante 15 minutos cada uno a 50 ° C. Para eliminar sondas de ARNc no unidos, el tejido se somete a la RNasa A (150μg /ml) la digestión durante 30 minutos a 37 ° C. sondas de ARNc Específicamente unidos se detectaron utilizando un anticuerpo anti-DIG acoplado a fosfatasa alcalina con cloruro de nitrobluetetrazolium /X-fosfato-5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (NBT /BCIP) (Roche Diagnostics) como sustrato cromogénico.

la clonación y la construcción de preparación para la invasión analiza

el
MAEL gratis (CCDS1257) y las secuencias de ADNc
PIWIL1 gratis (CCDS9268) se obtuvieron de la base de datos NCBI CCDS. secuencia de ADNc de longitud completa se amplificó usando el sistema Expand High Fidelity PCR (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se clonó en un vector de expresión de mamífero pcDNA3.1. Los ADN de plásmido que incluye pcDNA 3.1 (Invitrogen) o pEGFP-N1 vectores vacíos (Clontech) se transfectaron en células SKOV3 utilizando Lipofectamine LTX (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron las células SKOV3 debido a su endógeno
L1
niveles de expresión y el hecho de que no mostraron la expresión génica vía piRNA (Fig. 1C). Para cada transfección, 8 × 10
4 SKOV3 células fueron sembradas en una placa de 24 pocillos 14 horas antes de la transfección y se cultivaron en RPMI 1640/5% de FBS sin penicilina-estreptomicina. El plásmido de ADN (500 ng) se diluyó en 100 pl de medio Opti-MEM (Invitrogen) y se incubó con 0.5μl Plus reactivo (Invitrogen) y Lipofectamine 2μl LTX (Invitrogen) durante 30 minutos antes de ser añadido a cada pocillo. Después de 6 horas, el medio de cultivo celular se sustituyó por nuevo medio RPMI 1640/5% de medio FBS y se incubaron las células durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO
2 antes de la cosecha para
in vitro
invasión análisis. La transfección de pEGFP-N1 vectores vacíos en las células SKOV3 permitido la eficacia de transfección a medir, como las células transfectadas con éxito expresan la proteína GFP. El vector pEGFP-N1 se sometió a los mismos de crecimiento y transfección condiciones como se describe anteriormente, para determinar la eficacia de transfección que fue de aproximadamente 70% después de 24 hrs.

análisis RT-PCR de
PIWIL1-4
y
MAEL
expresión en (a) EOC malignos, cánceres ováricos benignos (B) y ovarios normales (C) líneas celulares de cáncer de ovario. Esta es una representación de 4 de cada 25 EOC maligno y 19 tejidos de cáncer de ovario benignos. El aumento de expresión de
PIWIL1, 2, 4 y

MAEL
, pero no
PIWIL3
, se encuentran en los cánceres malignos en comparación con los tumores benignos. Todos los ovarios normales muestran
piwil2
y
PIWIL4
expresión, pero sólo algunos tienen
PIWIL1, 3
y
MAEL
expresión. Sin endógena de
PIWIL1, 2, 4 y

MAEL
expresión se detecta en las células OVCAR3 y SKOV3. Óvulos * indica tejido de un 20 años de edad, ovarios antes de la menopausia, mientras que otros son de ovarios individuos de 44-76 años de edad.


in vitro
analiza la invasión con xCELLigence

invasión celular fue probado con monitoreo en tiempo real utilizando dispositivos ensayo de invasión de la CIM y el sistema xCELLigence DP (Roche Diagnostics) [28]. Brevemente, 4 horas antes de que el ensayo de invasión, una placa de CIM (Roche) se recubrió con 1:20 diluido factor de crecimiento reducido Matrigel matriz de la membrana basal (~450μg /ml) (BD Biosciences). Entonces, 40.000 células no transfectadas o transfectadas con el vector vacío (EV) o
MAEL
o
PIWIL1
vectores, fueron sembradas en cada pocillo recubierto. la actividad de las células se siguió durante un periodo de tiempo de 72 horas mediante la medición de la señal de impedancia en la placa de CIM. La actividad de las células se registró cada minuto en las primeras 12 horas y cada 5 minutos durante las siguientes 12 horas. Luego de 24 horas en adelante hasta el final del experimento, la actividad de células se registró cada 30 minutos. En cada placa CIM, se llevaron a cabo por triplicado de cada grupo para obtener la media y la desviación estándar. El experimento se repitió tres veces.


PIWIL1 Versión taquigráfica secuenciación

El dominio PIWI de
PIWIL1 Versión taquigráfica se amplificó por PCR y se clonaron productos de diferentes tamaños en pGEM-T fácil vector (Promega). Un total de 30 colonias positivas de diferentes bandas de PCR fueron seleccionados de cada reacción de ligación y ADN de los plásmidos se purificaron usando métodos estándar de lisis alcalina (Qiagen) [29]. 200 ng de plásmido de ADN fueron secuenciados (Big Dye Terminator v3.1 Ciclo de Secuenciación Kit, Applied Biosystems) usando SP6 y T7 cebadores universales.

Resultados

La expresión de genes de la vía Pirna se incrementa en maligna EOC en comparación con los tumores benignos o tejidos ováricos normales

vía de los genes se expresan constantemente Pirna en el ovario de mamíferos [11]. Con el fin de investigar un posible papel de esta vía en la EOC, se realizó un semi-cuantitativos RT-PCR para investigar la expresión de
PIWIL1
,
piwil2
,
PIWIL3
,
PIWIL4
y
MAEL Hoteles en etapa avanzada serosa EOC (n = 25), los tumores benignos de ovario (n = 19) y el tejido ovárico normal (n = 8) (Tabla 1, Tabla S3 y la Fig. 1A, B). análisis cuantitativo semi reveló que los niveles de expresión relativa de
PIWIL1
y
MAEL
fueron significativamente mayores en comparación con EOC maligna tejidos benignos y normales (Fig. 2A, B). Los niveles de expresión relativa de
piwil2
y
PIWIL4 Hoteles en grupos malignos no fueron significativamente diferentes a la de los tejidos ováricos benignos o normales (Fig. 2C, D). Sin embargo, la expresión de
piwil2
y
PIWIL4 ¿Cuáles son significativamente menor en tumores benignos comparación con el tejido ovárico normal, lo que sugiere una alteración de la expresión génica durante la progresión de EOC. La expresión relativa de
PIWIL3
es diferente a otro
PIWIL
genes de tal manera que la expresión de este gen es significativamente mayor en el ovario normal en comparación con ambos tejidos malignos y benignos (Fig. 2E) . Además, la expresión relativa de
PIWIL3
en ovario normal se correlaciona positivamente con la edad del paciente en los tejidos de ovario normales (n = 8) (r = 0,750, P = 0,05) (Tabla 2). En contraste con
PIWIL3
,
PIWIL1
expresión se correlaciona negativamente con la edad de los pacientes (r = -0,737, p = 0,037).
PIWIL1
se expresa en el crecimiento de los folículos en los ovarios antes de la menopausia, pero en este estudio la mitad de los ovarios probadas eran de mujeres menores de 50 años de edad y que puedan estar premenopáusicas
.
semi-cuantitativa RT-PCR análisis de la expresión de ARNm (con relación a
ACTB
) de (a)
PIWIL1
, (B)
MAEL
, (C)
piwil2
, (D)
PIWIL4
y (e)
PIWIL3
. (F) P-valor de cada grupo de comparación. EOC maligno (n = 25), benignos tejidos de cáncer de ovario (n = 19) y los ovarios normales (n = 8). Prueba de Kruskal-Wallis se realizó para comparar el nivel de expresión de genes entre los dos grupos. dot lleno indica media de cada grupo. * Indica 0,001 & lt; P & lt; 0,05; *** Indica P & lt; 0,001; NS: no significativo.


L1 y
Pirna genes de la ruta son sobreexpresado en células EOC

Para analizar el patrón de expresión de los genes de la vía y Pirna
L1 Hoteles en EOC, ARN
In situ
La hibridación se realizó en EOC maligno (n = 5) y los tumores ováricos benignos (n = 2) (Tabla 3, Fig. S1). Encontramos fuerte expresión de
L1
en las células epiteliales pero
L1
estaba ausente en las células del estroma en todas las muestras (Fig. 3A, E). También hemos observado que la expresión de
L1
es variable en diferentes pacientes (Fig. 3A). Fuerte expresión de
PIWIL1
se encuentra en las células epiteliales en todos los tejidos de EOC (Fig. 3B, F), mientras que
MAEL
y
piwil2
mostraron una fuerte expresión en las células epiteliales y las células del estroma de todos EOC examinados (Fig. 3C, G y D, H, respectivamente).


In situ análisis de
(A, A ', e)
L1
, (B, B ', F)
PIWIL1
, (C, C', G)
MAEL
, (D, D ', H)
Hoteles en piwil2 dos maligna EOC (AD SC3 de EH, mientras que a partir SC2). (A'-D ') imágenes amplificadores de los A-D, respectivamente. Fuerte expresión de genes de la vía Pirna y
L1
se encontró en el escamosas a cuboidal como las células epiteliales tanto de EOC maligno excepto
PIWIL1
que sólo expresa en SC2 pero no SC3.
L1
tiene la expresión irregular en algunos EOC de tal manera que algunas células epiteliales parecen tener más fuerte
L1
expresión en comparación con otros.
MAEL
y
piwil2
pero no
PIWIL1
también se expresa en las células del estroma en tanto EOC. (E'-H ') Los controles negativos con la sonda sentido de
L1
,
PIWIL1
,
MAEL
y
piwil2
respectivamente. Ep = células epiteliales; S = células del estroma. Barra de escala = 50 micras.

múltiple
PIWIL1 Versión taquigráfica existen variantes en las maligna EOC

La amplificación por PCR del dominio PIWI de EOC ADNc produjo dos bandas distintas en comparación con los ADNc de testículo normal o de ovario (Fig. 4), lo que sugiere la presencia de múltiples
PIWIL1
transcripción variantes en maligno EOC. Se extrajeron los productos de PCR de los testículos y EOC maligno, clonados y secuenciados. Múltiples alineamientos de secuencias de clon mostraron muchos cambios dentro del dominio PIWI a nivel de nucleótidos en comparación con el testículo y publicado
PIWIL1
secuencia de ADNc. cambios de pares de bases únicas se han identificado en
PIWIL1
transcripciones de los EOC malignos (Tabla S2). Además, la mayoría de estos clones tienen deleción del exón y intrones unspliced ​​que introducen codones de parada prematuros. Es importante destacar que una deleción de 75 nt que comprendía todo el exón 17 fue encontrado en la mayoría de los clones secuenciados en 5 de los 28 pacientes EOC (Fig. 4B). Además, algunos clones mostraron empalme parcial de los intrones 15 y 16 (Fig. 4B) de tal manera que 17 pb y 20 pb del extremo 5 'del intrón 15 y 16, respectivamente, son unspliced. Con el fin de confirmar que las mutaciones son debido al corte y empalme, el ADN genómico de muestras de tumor se aislaron y se secuenció en la región correspondiente. No se identificaron mutaciones entre los exones 15-18 (donde se produjeron los errores de empalme) en la genómica
PIWIL1
secuencia (Fig. S2). Con el fin de predecir si las alteraciones post-transcripcional anteriores afectan a la función PIWIL1, las secuencias se tradujeron y se compararon con el control (testículo cDNA) y la secuencia del péptido publicado (AAC97371.2). La pérdida de todo el exón 17 (73-nt supresión) en 11 clones introdujo un codón de parada prematuro en el dominio PIWI (Fig. S3). Del mismo modo, codones de parada se encontraron en clones que tienen intrones unspliced ​​(no mostrado).

(A)
PIWIL1
expresión en los tejidos de control (testículo humano, ovario normal (ov) 1, 2) y SC1 tejido EOC y 2. en el control positivo, una banda de 500 pb se amplificó, pero en SC1 maligno, se obtuvieron dos bandas. (B) de ADNc de alineación múltiple (parcial) que muestra que la mayoría de los clones tienen una deleción del exón 17 (ΔΔ3) y 3 clones tiene empalme parcial del intrón 15 y 16 (). PIWIL1_ccds: publicada ADNc de
PIWIL1 gratis (CCDS9268); Testis C1: testículo clon transcripción 1; B1-3, B6, B9-B14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: clones con
PIWIL1
transcripciones

Más de expresión de genes de la vía Pirna. reduce la invasividad
in vitro

con el fin de investigar el posible papel de los genes de la vía Pirna en la progresión del cáncer, de larga duración
PIWIL1
o
MAEL
en transcripciones se clonaron y se transfectaron de forma transitoria en la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 y se ensayó la capacidad de invasión después de 24 horas de la transfección. RT-PCR se realizó para validar la inserción de plásmidos en estas células. RT-PCR confirmó
GFP
,
PIWIL1
o
MAEL
más de expresión (Fig. S4A). La expresión de
MAEL
y
PIWIL1
construcciones se mantuvo alta en las células transfectadas 50 horas después de la transfección (Fig. S4A).
MAEL
,
PIWIL1
y vector vacío (EV) células transfectadas y las células SKOV3 no transfectadas se aplicaron al sistema xCELLigence para investigar su efecto sobre la invasión de células [30]. Sorprendentemente, la invasividad de
MAEL
y
PIWIL1
células transfectadas fue menor en comparación con las células no transfectadas o vector vacío (Fig. 5). invasividad de las células de cada grupo comenzó a llegar a una meseta después de 30 horas, de este modo se muestra la actividad de células única de las primeras 30 hrs. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de
PIWIL1
y
MAEL
tener un efecto represivo sobre la invasividad celular SKOV3.


PIWIL1
y
MAEL
células transfectadas tienen menor invasividad en comparación con las células no transfectadas y
Ev
células transfectadas. En cada experimento, cada grupo se realizó por triplicado y se repitió este experimento tres veces. Este es un gráfico de datos combinados de tres experimentos independientes para todos los grupos. Las barras de error representan la desviación estándar.
WT
indica células no transfectadas SKOV3; vector vacío (EV),
MAEL
y
PIWIL1
indican las células transfectadas con
MAEL
o
PIWIL1
vectores.
Ninguno
indica bien sin células.

Discusión

La vía piRNA es importante para TE silenciamiento, la regulación epigenética y células madre auto-renovación en una amplia gama de organismos [31], [32]. hipometilación del ADN global y desrepresión TE, como
L1, España es una característica común de los genomas del cáncer [33], [34] en los seres humanos
PIWIL1
y
2
sobreexpresión tiene ha observado en tumores de diversos tejidos [15] - [18], [21] - [23]. Sin embargo, todavía no está claro si los genes de la vía Pirna son expresados ​​diferencialmente en el cáncer de ovario o de tener un papel en la progresión del tumor de ovario. Se examinó la expresión de los genes de la vía Pirna
PIWIL1 CD -
4
,
MAEL
y
L1 Hoteles en EOC malignos, tumores benignos y los tejidos normales de ovario, y también investigó posibles funciones de los
PIWIL1
y
MAEL Hoteles en líneas celulares de cáncer de ovario

La expresión de
PIWIL1 CD -.
2
ha sido investigado en diversos tejidos cancerosos [15] - [18], [21], [23], [35], pero no
MAEL
,
PIWIL3
y

. Aunque la expresión de
piwil2
y
4
apareció alta en muestras de tumores de forma no significativa, probablemente debido al hecho de que
piwil2
y
PIWIL4
se expresa fuertemente en los tejidos ováricos normales (fig. 1B) y su expresión entre los tejidos malignos es muy variable. La expresión de
PIWIL1
y
sin embargo MAEL
es significativamente mayor en EOC maligno en comparación con los tumores benignos.
PIWIL1
y
MAEL, España, pero no
piwil2
y
4, España fueron significativamente hasta reguladas en comparación con ovarios normales. En contraste con
piwil2
y
4
que se expresan en todos los tejidos ováricos normales examinados, la expresión de
PIWIL1
y
MAEL
se encuentra sólo en un subconjunto de los tejidos ováricos normales de pacientes que tenían menos de 50 años de edad. En ovario normal,
PIWIL1
y
MAEL
se expresan en las células del cúmulo de folículos en crecimiento en humanos [11]. Los tejidos ováricos normales probados son de individuos de 44-76 años de edad, y la mitad de estas muestras se obtuvieron de individuos menores de 50 años de edad. Por lo tanto, la variable expresión de
PIWIL1
y
MAEL Hoteles en los ovarios normales podría explicarse por la diferencia en la abundancia de los folículos en crecimiento, que expresan genes de la vía Pirna a través de las muestras.


MAEL
que se conoce como un gen de cáncer /testículo tal como se expresa en los testículos y una serie de líneas celulares de cáncer [36]. Aquí se identificaron por primera vez la expresión aumentada de
Hoteles en MAEL EOC malignos y tumores ováricos benignos. Al igual que en PIWI, MAEL es esencial para asegurar la línea germinal adecuada diferenciación de células madre en
Drosophila
y otros vertebrados [37]. La sobreexpresión de genes de la vía Pirna en EOC puede indicar que algunas características de células madre están presentes en las células tumorales o de que la vía piRNA se ha activado, por ejemplo, por la actividad de retrotransposones. La expresión de estos genes también puede ser una firma de la presencia de células madre del cáncer de ovario [38].

La expresión de genes de la ruta en Pirna ovario normal y ciertos tipos de EOC puede proporcionar una nueva perspectiva sobre el origen de cáncer de ovarios. Las células somáticas del folículo de maduración pueden entran en contacto con la superficie del epitelio de ovario durante la ovulación o pueden estar presentes en el quiste de inclusión que se cree que desempeñan un papel en el origen del cáncer epitelial de ovario [3] Aunque la presencia de quistes de inclusión parece no per se aumenta el riesgo de desarrollar cáncer de ovario [39]. Hipometilación del
L1
región promotora se correlaciona con un aumento de L1

la expresión de ARNm, en tejidos de cáncer de mama malignos y líneas celulares [40], [41]. La expresión de
PIWIL
genes y
MAEL
tanto en ovario normal y maligno EOC se correlacionan con la expresión aumentada de elementos de repetición y plantea la posibilidad de que la vía piRNA puede haber sido provocada por la expresión de TE. Sin embargo, nos dimos cuenta de que
L1
expresión estaba ausente en los tumores malignos en etapa inicial (n = 6), pero está constantemente presente en todas las muestras de tumor etapa 3c. Esto proporciona alguna evidencia circunstancial de que la activación de los genes de la vía Pirna puede preceder a
L1
expresión durante la progresión tumoral. Esto es consistente con el trabajo en otros tumores que se correlacionan
L1
expresión con la progresión del cáncer [42].
Maelstrom
knock out resultados en la disminución de la metilación del ADN en las gónadas, pero no en tejido somático. En gónadas esto conduce a un aumento espectacular en la expresión elemento de transposición en las células germinales [43]. Nuestra observación de
MAEL
sobreexpresión en ausencia de detectable
L1
expresión en muestras de tumores en fase inicial se plantea la posibilidad de que no funcional
MAEL
pueden desempeñar un papel en la disminución de ADN metilación promover la posterior
L1
expresión.

a pesar de
PIWIL1 Versión taquigráfica nivel se incrementó significativamente en EOC maligno en comparación con los tejidos normales y benignos, la clonación y secuenciación de estas transcripciones sugiere que estos transcripciones pueden producir proteína PIWIL1 aberrante y no funcional. Las mutaciones múltiples se encontraron en
PIWIL1
transcripciones incluyendo intrones unspliced, la pérdida de los exones, así como cambios de pares de bases único. Solo par de bases cambios tal vez un resultado de la edición de ARN [44].

Enfermedades de sentido común

Enfermedad del corazón | Enfermedades artículos | Enfermedad pulmonar | las preguntas más frecuentes de salud | Salud mental | Diabetes | El sentido común de la Salud | Enfermedades comunes | senior Health | Primeros auxilios
Derechos de autor © Crónica enfermedad[www.enfermedad.cc]