Extracto
Antecedentes
elementos transponibles (TES), constituyen casi el 45% de todo el genoma y son parte de sofisticados sistemas de red de regulación que controlan los procesos de desarrollo en condiciones normales y patológicas. La maquinaria gen retroviral /retrotransposón se compone principalmente de largos períodos de Elementos Nuclear (líneas-1) y Retrovirus endógeno humano (HERV) que codifican para su propia transcriptasa inversa endógena (RT). Curiosamente, RT se expresa típicamente en altos niveles en células cancerosas. Estudios recientes indican que la inhibición de RT por inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTIs) induce la detención del crecimiento y la diferenciación celular
in vitro
y antagoniza el crecimiento de tumores humanos en el modelo animal. En el presente estudio analizamos la actividad anticancerígena de abacavir (ABC), un nucleósido inhibidor de la transcripción reversa (INTR), en líneas celulares de cáncer de próstata PC3 y LNCaP.
Principales conclusiones
ABC reduce significativamente el crecimiento celular, procesos de migración y la invasión, ralentiza considerablemente la fase S progresión, induce la senescencia y muerte celular en células de cáncer de próstata. En consonancia con estas observaciones, el análisis de microarrays de células PC3 muestra que ABC induce cambios específicos y dependientes de la dosis en la expresión génica, que implican múltiples vías celulares. Cabe destacar que, por cuantitativos PCR en tiempo real se encontró que los niveles de LINE-1 ORF1 y ORF2 de mRNA fueron significativamente hasta reguladas por el tratamiento ABC.
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran el potencial de ABC como contra el cáncer agente capaz de inducir la actividad antiproliferativa y desencadenar la senescencia en células de cáncer de próstata. Digno de mención, se muestra que provoca ABC sobre regulación de LINE-1 de expresión, lo que sugiere la participación de estos elementos en las modificaciones celulares observadas
Visto:. Carlini F, B Ridolfi, Molinari A, Parisi C, G Bozzuto , Toccacieli L, et al. (2010) La transcripción inversa inhibidor Abacavir Muestra Actividad anticáncer en líneas celulares de cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (12): e14221. doi: 10.1371 /journal.pone.0014221
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Febrero, 2010; Aceptado: 15 Noviembre 2010; Publicado: Diciembre 3, 2010
Derechos de Autor © 2010 Carlini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada por el Instituto Nacional de Salud en Roma (ISS), Ricerca Finalizzata 2004, el programa de colaboración ISS /NIH-EE.UU. y Ricerca Corrente 2007-2008, el ISS. Otras financiaciones son de Ministerio de Universidades e Investigación, Regione Campania, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) y los programas de doctorado: "Patología de la célula Transducción de Señales" (OMVG) de la Segunda Universidad de Nápoles y "Toxicología, Oncología y Patología molecular "de la Universidad de Cagliari (MR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad compleja y su variabilidad extrema fenotipo no se pueden describir de forma exhaustiva y se explican únicamente por las interacciones entre genes y medio ambiente. Inesperadamente, la realización del genoma humano revela que la verdadera complejidad del genoma tiene poco que ver con el número y la heterogeneidad de sus genes
.
Sólo el 2% de genoma humano codifica para proteínas, mientras que el 45% se compone de elementos transponibles (ET) [1]. Los TEs, inicialmente pensado para ser meros parásitos intracelulares, que se denominó egoísta o ADN "basura", hasta que nuevas investigaciones reveló cómo esta enorme cantidad de secuencias no codificantes de proteínas escalas con organismos complejidad, que juega un papel fundamental como parte del regulador kit de herramientas del genoma, mediante la alteración de la expresión génica y la evolución del genoma de conducción, así como el desarrollo de un organismo [2] - [10]. TEs puede separarse en dos clases principales: DNA-transposones (2,8%) y retrotransposones (42,2%). ADN transposones amplifican sin un intermediario de ARN, mientras que los retrotransposones se basan en un transcrito de ARN que la auto-replica con la ayuda de una transcriptasa inversa (RT).
RTs codificadas por largos períodos de Nuclear Element-1 (LINE-1 ) y retrovirus endógenos humanos (HERV) resultaron estar asociados con procesos patológicos y fisiológicos. En particular, se han encontrado altos niveles de expresión de RT en las células germinales, embriones, células indiferenciadas y transformadas, mientras que en tejidos no patológicos diferenciados que apenas se expresaban, lo que sugiere una correlación directa con el potencial proliferativo de la célula [11] - [17 ].
estudios previos han demostrado que una clase de inhibidores no nucleósidos de la RT (NNRTI), ampliamente utilizados en la terapia del SIDA, inhibe la actividad RT endógena en un número de líneas murinas y celulares de cáncer humano, la reducción de la célula tasa de crecimiento y inducir la diferenciación [18] - [20]. Además, los mismos efectos biológicos se reprodujeron en experimentos de interferencia de ARN con específica
si
RNA dirigidos contra LINE-1 y HERV-K. Estos resultados indican claramente que ambas clases de retroelements están vinculados en una red funcional, que participan en el crecimiento celular y la tumorigénesis, pero con funciones jerárquicas distintas, siendo LINE-1 capaz de controlar la expresión de HERV-K [21]. Estos estudios sugieren que endógeno no telomérica RT puede representar una nueva diana para el desarrollo de agentes contra el cáncer terapéuticas.
INNTI se unen a un bolsillo hidrófobo, cerca del sitio activo RT. La unión induce un cambio conformacional en la proteína, afectando a su afinidad por el sustrato y, en consecuencia, la inhibición de la actividad enzimática RT. NNRTIs se clasifican como inhibidores de la RT no competitivos alostéricos.
Otra clase de inhibidores de antirretrovirales que se dirigen a RT está representada por los inhibidores de la transcripción inversa análogos de nucleósidos (NRTI). En comparación con el NNRTIs, tienen un mecanismo de acción diferente. El NRTIs son análogos de nucleótidos que inhiben la transcripción inversa mediante su incorporación en el ADN recién sintetizado viral (ADNc) y la prevención de su alargamiento adicional. Se clasifican como inhibidores competitivos de sustrato no alostéricos. Entre estos, Abacavir (ABC) se utiliza con éxito en combinación con otros medicamentos antivirales en el tratamiento de la infección por VIH. Se convierte por enzimas celulares a la forma activa carbovir triphosphorilated, un análogo de dGTP. Con respecto a otros INTR, ABC muestra una afinidad muy baja para las ADN polimerasas celulares [22]. Además, Jones et al. [23] demostraron con un
in vitro
LINE-1 ensayo retrotransposition que NRTI tiene la capacidad de suprimir retrotransposition LINE-1, lo que indica la susceptibilidad de LINE-1 RT a esta clase de fármacos.
sobre la base de estas evidencias, hemos investigado la actividad antitumoral de ABC en el LNCaP dependiente de hormonas y líneas celulares de cáncer de próstata PC3 refractarios a las hormonas. Estas células metastásicas son generalmente supone que representan etapas tempranas y tardías de cáncer de próstata, respectivamente. Hasta ahora, el cáncer de próstata representa la cáncer no cutáneo más común en el hombre en los Estados Unidos [24]. El principal tratamiento es la ablación de andrógenos, pero después de una buena respuesta inicial la enfermedad progresa a cáncer de próstata refractario a las hormonas [25]. Se necesitan nuevas modalidades de terapia para prevenir o tratar esta forma más letal de cáncer de próstata.
Aquí demostramos que ABC induce una disminución significativa en la tasa de crecimiento de células y un retraso del ciclo celular en la fase S. Un alto porcentaje de células senescentes se observaron y muchos de ellos estaban comprometidos con la muerte. Pocas horas de exposición ABC redujo significativamente el potencial de la migración y la invasión de las células del cáncer de próstata. Por otra parte, un análisis de la expresión de todo el genoma en células PC3 reveló una regulación de genes dependiente de la dosis. En particular, ABC fue capaz de modular la expresión LINE-1 en ambas líneas celulares.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células y tratamientos
El cáncer de próstata líneas celulares humanas PC3 (ATCC CRL-1435) y LNCaP (ATCC CRL-1740) y la línea celular de fibroblastos humanos no transformadas WI-38 (ATCC CCL-75) se cultivaron de acuerdo a las recomendaciones de la ATCC. El abacavir se purificó a partir de tabletas disponibles comercialmente Ziagen (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC 27709) por extracción con metanol y el grado de purificación evaluados por HPLC. Para los experimentos de drogas, ABC se disolvió en medio FBS-libre y se utiliza a una concentración de 15 o 150 mM. medio fresco que contiene el fármaco-fue cambiado cada 48 h. Para las células de los experimentos de sincronización fueron tratados con 2 g afidicolina /ml durante 18 h, después se lavó dos veces con PBS y lanzado en medio fresco, que contiene o no ABC.
RT Ensayo de actividad
ensayos de actividad RT se llevaron a cabo mediante una modificación menor del método descrito por Mangiacasale et.al [18]. Las células (5 × 10
5-10
6) se lisaron en 40 l de tampón de lisis enfriado en hielo (10 mM Tris-HCl pH 7,5, mM de MgCl 1
2, mM EGTA 1 mM, PMSF 0,1 , β-mercaptoetanol 5 mM, CHAPS al 0,5%, glicerol al 10%). Después de tres ciclos de congelación-descongelación y-, se incubaron las células durante 30 min en hielo y se centrifugaron durante 30 min a 14 000 r.p.m. a 4 ° C. actividad RT se ensayó usando un sistema ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) en reacciones de 20 l que contenía 10 ng de MS2 ARN del fago (Roche Diagnostics) y 30 pmol de cebador inverso MS2 (véase más adelante) y sustituyendo RT comercial con extracto libre de células ( 24 g de proteína total). Las mezclas de reacción se incubaron a 55 ° C durante 1 h seguido de 5 min a 85 ° C. Un volumen de 1 l de
Escherichia coli
RNaseH (2 U /l) se añadió a cada muestra y se incubó adicionalmente a 37 ° C durante 20 min. Las reacciones de control se establecieron mediante la omisión extracto de células (control negativo), o la adición de 1 l de ThermoScript RT (Invitrogen) (15 U /l, control positivo). Un volumen de 2 l de cada reacción se mezcló con 30 pmol de cada uno de hacia adelante (5'-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3 ') y hacia atrás (5'-CACAGGTCAAACCTCCTAGGAATG-3') cebadores MS2 y amplificado por PCR usando el Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. El producto de amplificación es una DNA 112-bp fragmento spanning posiciona 21-132 en el extremo 5 'del ARN de MS2 (GenBank V00642). Los productos de PCR se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
Ensayo de proliferación celular
PC3, LNCaP y células WI-38 se sembraron a una densidad de 20.000 por pocillo en placas de 12 pocillos, se cultivaron durante 24 h y después se trató con ABC a una concentración de 15 o 150 mM. A 0, 24, 48, 72 y 96 h se contó el número de células azules-exclusión tripano en una cámara de Burker. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces por triplicado.
Análisis de Ciclo Celular
tratadas y células no tratadas se recogieron por tripsinización y se lavaron con PBS helado. tinción de ADN se realizó utilizando el ciclo de pruebas ™ PLUS DNA Reactivo Kit (Becton & amp; Dickinson). Las células fueron luego analizadas en un citómetro de flujo FACScan (Becton & amp; Dickinson).
La senescencia Determinación
El porcentaje de células senescentes se midió mediante la detección de la actividad β-galactosidasa a pH 6 con el Calbiochem Detección senescencia Equipo. Los datos fueron cuantificados a partir de más de 500 recuentos de células en tres experimentos independientes.
microscopía de fluorescencia
Para el análisis morfométrico de los núcleos, tratados y no tratados células fueron fijadas con paraformaldehído al 3% y se incubaron con Hoechst 33258 solución (1 mg /ml) durante 30 min a 37 ° C. Para la tinción de nucleolos, las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio de 12 mm se fijaron y se permeabilizaron con metanol a -20 ° C durante 10 min, se incubaron con suero antinuclear de un paciente autoinmune (amablemente proporcionado por el Dr. Maria Antonietta Amendolea) y luego incubadas con una cabra fluoresceína vinculado IgG anti-humana (Bio-Rad). Las muestras se analizaron por una cámara CCD Nikon equipado microscopio Optiphot (Tokio, Japón). El análisis morfométrico se realizó con el software Image J 1.37 (Wayne Rasband, NIH, EE.UU.). Para se aplicó la prueba t de Student el análisis estadístico.
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
tratadas y células PC3 no tratados se fijaron con glutaraldehído al 2% en tampón cacodilato 0,1 M pH 7,4 a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de la fijada con 1% OSO
4 en el mismo tampón, se deshidrataron a través de una serie de etanol, se secó con punto crítico de CO
2 y oro recubiertas por pulverización catódica. Las muestras fueron examinadas con un Cambridge Stereoscan 360 microscopio electrónico de barrido (Cambridge Instruments Ltd, Cambridge, UK).
Ensayos
migración celular y la invasión
Los ensayos se realizaron por una modificación del método descrito por Albini y colegas [26]. Para los ensayos de migración y la invasión, los filtros se utiliza 8,0 micras de poro (Falcon). Las células cosechadas, y se suspendieron en RPMI a una concentración de 1 × 10
6 células /ml, se añadieron a cada filtro y 3 ml de RPMI que contiene FBS al 10% se añadieron a la bien por debajo de la inserción. Para los filtros de ensayo de invasión se revistieron con Matrigel ™ (Sigma) diluido a 1 mg /ml en medio RPMI libre de suero. Las células se incubaron a 37 ° C durante 18 h. Posteriormente, el lado interior de la filtración se secó con un hisopo mojado para eliminar las células mientras que el lado exterior del inserto se aclaró con PBS y se tiñeron con violeta cristal al 0,25% (Sigma) durante 10 min. Los filtros se observan bajo un microscopio Nikon cámara CCD Optiphot equipada (Tokio, Japón) y el porcentaje de área ocupada por células migraron o invasores fue analizada por el software Optilab (Graftek Mirmande, Francia).
Análisis de microarrays
El ARN total se aisló utilizando RNasa Kit (Qiagen). Para cada muestra, 500 ng de ARN se sintetizaron a cRNA biotinilado usando Illumina de amplificación del ARN Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). ARN y ADNc concentración se determinó con un NanoDrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, EE.UU.) y su calidad se evaluó con un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italia). De cada muestra, repeticiones técnica se produjeron y 750 ng cRNA se hibridó durante 18 h para HumanRef-8 BeadChips expresión v2 (Illumina Inc., San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. archivos de intensidad se cargaron en el software Illumina BeadStudio 3.0.19.0 y normalizado con el algoritmo de promedio. Técnico repeticiones de cada muestra se agrupan y genes con una detección de valor de p & lt; 0,05 se consideraron como detectado. Los genes con Dif Puntuación de ± 40 (valor de p de 0,0001) fueron considerados como genes expresados diferencialmente. los datos de microarrays MIAME son compatibles y los datos brutos se han depositado en la base de datos ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae), con número de acceso:.-E-532 TABM
ingenio Pathway Análisis 7 (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) se utilizó para analizar la relación biológica de los genes expresados diferencialmente. Las funciones biológicas fueron evaluadas de acuerdo a las instrucciones del software. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para calcular un valor de p para determinar la probabilidad de que cada función biológica asignado a ese conjunto de datos se debe a la casualidad. A GO (Gene Ontología) de enriquecimiento de análisis también se realizó utilizando el software DAVID [27], [28].
RT Ensayo y cuantificación de LINE-1 mRNA expresión
El ARN total fue aislado de las células sin tratar y tratados con 15 y 150 mM ABC del 24, a 120 h. ARN se trató con DNasa TURBO (Ambion) para eliminar la contaminación de ADN genómico. cDNAs fueron sintetizados por el TaqMan de alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems). Cuantificación relativa reacciones de PCR se realizaron con la química TaqMan. LINE-1 transcripciones fueron detectados utilizando cebadores personalizados y FAM-MGB-sondas para LINE-1 ORF1 y ORF2 (PE Applied Biosystems), diseñado con el software de cebadores Express (Tabla S1). La base de datos de secuencia LINE-1 utilizado en este trabajo es la L1base (http://l1base.molgen.mpg.de) [29]. se informó el número de LINE-1 secuencias blanco de las sondas en la Tabla S1. Cada reacción se realizó en un volumen final de 25 l que contenía 1 l de cDNA y 12,5 l de TaqMan® PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems). Las amplificaciones se llevaron a cabo comenzando con una etapa de activación 2 min de AmpErase UNG a 50 ° C, 10 min paso plantilla de desnaturalización a 95 ° C, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. reactivo-Pre desarrollado TaqMan Ensayo para GAPDH (4310884E) se utilizó como control endógeno. La ausencia de amplificación de ARN transcrito a la no-inverso se confirmó para excluir la amplificación de ADN genómico. Las diferencias en la expresión génica se calcularon mediante el método estándar de 2
-ΔΔCt. Para se aplicó la prueba t de Student el análisis estadístico.
Resultados
Abacavir inhibe el crecimiento celular, afecta a la progresión del ciclo celular e induce la senescencia en líneas celulares de cáncer de próstata
En primer lugar, hemos evaluado actividad RT endógena en células de cáncer de próstata humano y en células de control no transformadas WI-38. extractos de células se utilizaron como fuente de RT para revertir transcribir un ARN sintético. Como se muestra en la Figura 1A, se encontró que la actividad RT en células PC3 y LNCaP, mientras que en las células WI-38 actividad RT estaba en un nivel indetectable.
Se detectó actividad (A) endógena RT en PC3, LNCaP y WI -38 células como se describe en materiales y métodos; (+) Reacción de control positivo con RT comercial. (B) El cáncer de próstata normales y células de fibroblastos humanos WI-38 fueron tratados con ABC en la concentración de 15 y 150 mM y se cultivaron a los puntos de tiempo indicados. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes; bares, ± SD.
Para analizar el efecto de ABC en la tasa de proliferación de las células, las células fueron cultivadas en presencia del fármaco en concentraciones de 15 y 150 mM. Una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis se observó en ambas líneas celulares (Figura 1B). En 15 mM ABC se reveló una reducción considerable en el crecimiento celular después de 72 y 96 h de tratamiento en PC3 y LNCaP, respectivamente. La concentración 150 mM inhibió fuertemente el crecimiento en ambas líneas celulares (Figura 1B). La citotoxicidad de ABC también se examinó en las células no transformadas WI-38. Curiosamente, no hemos encontrado una reducción significativa del crecimiento celular con 15 mM ABC ABC mientras que la concentración de 150 mM inducida solamente un 20% de inhibición del crecimiento celular después de 120 h (Figura 1B).
Para investigar si podía ABC afectar a la progresión del ciclo celular, las células de cáncer de próstata fueron tratados con 150 mM de ABC y se analizaron a diferentes puntos de tiempo de hasta 120 horas. En las células PC3 una muy alta acumulación de células en fase S fue visto después de 18 y 24 h de tratamiento (56,3 y 78,6% respectivamente). Este aumento fue seguido por un aumentar de células G2 /M que se convirtió en 23,4 a 26,9% de la población total a 96 y 120 h de tratamiento (Figura 2A, B). LNCaP células tratadas mostraron una acumulación predominantemente fase S alcanzando 40,5 a 54,3% después de 48 y 72 h de tratamiento, pero no se observó ningún incremento de la fase G2 /M. Más bien, la acumulación de la fase S parece permanecer constante en el tiempo (Figura 2A). Para caracterizar mejor la alteración de la fase S, las células se sincronizan en la fase S temprana al exponerlos a la afidicolina inhibidor de la síntesis de ADN. Después de la liberación del bloque de afidicolina, las células fueron tratadas con 150 mM ABC y se analizaron para la distribución del ciclo celular en diferentes puntos de tiempo. Figura 2C, muestra que 3 h después de la liberación tanto de las células de control sincronizado se mueve hacia el centro de fase S, representado por el pico central del gráfico, mientras que ABC células tratadas mostraron un retraso en la progresión evidente a través de la fase S. Después de 18 h, una gran cantidad de células tratadas PC3 todavía estaba presente a finales de S y G2 /M fase, mientras que LNCaP, como se esperaba, mostraron una tendencia a acumularse en la fase S (Figura 2C). Digno de mención, ABC fue capaz de alargar la fase S progresión también si se añaden en la fase S el medio, 3 h después de la liberación bloque de afidicolina (datos no mostrados). Todos juntos, estos datos apoyan la hipótesis de que ABC podría afectar específicamente la replicación del ADN.
(A) la distribución del ciclo celular de PC3 y LNCaP células expuestas a 150 mM ABC. Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados, se incubaron con yoduro de propidio y el contenido de ADN se analizó por citometría de flujo. Se dice que el porcentaje de células en cada fase. (Dakota del Norte, no se ha hecho). Los datos son representativos de cinco experimentos independientes. (B) Un experimento representativo de la progresión del ciclo celular en las células tratadas PC3. Las flechas indican la acumulación de células en fase G2 /M. células PC3 y LNCaP (C) se sincronizaron en fase temprana S por afidicolina y la distribución del ciclo celular se analizó en las células tratadas (150 M ABC) y sin tratar.
Junto con la inhibición de la proliferación, un incremento considerable de la muerte celular durante un período de 6 días se observó con 150 ABC mu M (Figura 3A, B). Para evaluar si estos fenómenos se asociaron con la inducción de apoptosis o senescencia, las células de cáncer de próstata fueron tratados con 150 mM ABC durante 5 días y se evaluaron cada 24 h para la externalización anexina, la condensación /fragmentación nuclear y la actividad ß-galactosidasa a pH 6. No aumento significativo de anexina se observó células positivas o núcleos apoptóticos en las muestras tratadas en cualquier punto de tiempo (datos no mostrados) mientras que la actividad ß-galactosidasa senescencia asociado se indujo significativamente por ABC y aumentaron con el tiempo, alcanzando aproximadamente 80% y 50% de células positivas a 5 días de tratamiento en PC3 y LNCaP, respectivamente (Figura 3C, D). Por otra parte, la comparación entre la senescencia celular y la cinética de muerte celular sugiere que los dos fenómenos están fuertemente asociados. Por el contrario, no se observó muerte celular ni las diferencias en nivel de senescencia en células WI-38 de control tratados con 150 mM de ABC, en comparación con las células no tratadas (datos no mostrados).
(A y B) de 5 x 10
4 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos con 150 M ABC. Después de 0, 2, 4 y 6 días se recogieron las células adherentes y flotantes y se resuspendieron en medio de cultivo que contiene 0,2% de azul de tripano para el recuento de células viables y la muerte. la actividad ß-galactosidasa (C y D) se evaluó en PC3 y LNCaP células tratadas con 150 mM ABC y analizada en diferentes puntos temporales.
Los cambios morfológicos de las células PC3 tratadas
PC3 Las células fueron analizadas a nivel morfológico. De acuerdo a la alteración del ciclo celular y la inducción de la senescencia, se observaron varias células cambios morfológicos después de la exposición a la droga en ambas dosis. En células PC3 microscopía electrónica de barrido tratados con 15 mM ABC que ya hemos mostrado una forma más aplanada (Figura 4A a, d) y un obstáculo en el proceso de división después de 48 h de exposición (Figura 4A b, e). Además, las células PC3 tratadas muestran la pérdida de microvellosidades superficie que sugieren un efecto del fármaco sobre la organización del citoesqueleto (Figura 4A c, f). A nivel nuclear, análisis morfológico destaca la presencia de bilobate y núcleos grandes, con un aumento del área nuclear cada vez más evidente a las 48 h de incubación con 15 mM ABC y 24 h después del tratamiento con 150 M ABC (Figura 4B). Morfométricos y análisis estadísticos indican que las áreas nucleares de aproximadamente el doble en 48 h con 150 M ABC (Tabla S2). A nivel nucleolar se encontraron modificaciones significativas en la estructura de las células expuestas durante 72 h a ambas dosis ABC. Además, las células tratadas PC3 nucleolos aparecen menos compacto y en algunos casos respecto dispersa con el control (Figura 4C).
(A) imagen SEM ilustran modificaciones que ocurren en las células PC3 tratadas con ABC 15 micras, con 48 h. (B) Los cambios morfológicos y análisis morfométrico de los núcleos teñidos con Hoechst. Las dosis y los puntos de tiempo se indican. (C) La inmunofluorescencia de nucleolos teñidas con suero humano anti-núcleo.
Abacavir inhibe la migración y la invasión
Dado que las células PC3 y LNCaP son de origen metastásico y poseen un potencial migratorio y la invasividad , se investigaron los efectos de ABC en los procesos de motilidad y la invasión. Las células se sembraron en transwell cámaras en la presencia o ausencia de 15 o 150 mM ABC, y se dejaron migrar durante 18 h a 37 ° C. Se observó una disminución dependiente de la dosis de la zona ocupada por la migración y la invasión de las células después del tratamiento ABC (Figura 5A, B). La migración celular se redujo significativamente en células de cáncer de próstata a los 15 y 150 mu M dosis ABC (p & lt; 0,001). la invasión de células Matrigel se inhibió significativamente sólo en la dosis más alta de ABC (Figura 5B).
PC3 y las células LNCaP fueron sembradas en la membrana en presencia o ausencia de Matrigel y se incubaron con 15 y 150 mM ABC durante 18 h. (A) imagen representativa de la migración y la invasión de células PC3 teñidas con cristal violeta. (B) Porcentaje de migración y la invasión a disminuir respecto a las células no tratadas analizados por software Optilab. (*) Corresponde a p & lt;. 0.001, calculado mediante la prueba de Mann-Whitney
Modificación de expresión de genes inducida por las células tratadas con abacavir en PC3
En el intento de encontrar una expresión genética Bajo los cambios morfológicos y funcionales observados en ABC tratada células PC3, cuatro réplicas biológicas de ambos tratados y se analizaron las células de control en una plataforma Illumina Microarray 48 h después del tratamiento.
el análisis de los datos de microarrays mostraron que 192 genes a cabo de 12605 detectados y 3246 de 12930, fueron expresados diferencialmente (p & lt; 0,0001). a los 15 y 150 concentraciones M ABC, respectivamente, la mayoría de los cuales dieron hasta reguladas (Figura 6 y Tabla S3)
(a) resumiendo tabla de los números de genes expresados diferencialmente y expresadas resultantes de microarrays de ensayo (cuatro repeticiones biológica para cada condición). (B) La comparación de los diez mejores funciones biológicas a los 15 y 150 mM ABC obtenida por análisis de IPA. En el eje y la significación estadística, expresado como -log valor de p /, se informa. P-valor umbral = 0,05 (línea amarilla). El número de los genes implicados en cada función se informó sobre la parte superior de cada barra. Diagrama (C) de Venn que muestra la fracción de los genes comunes expresados diferencialmente en las células PC3 a los 15 y 150 mM ABC.
Se realizó un análisis de la función de los genes expresados diferencialmente utilizando el sistema de Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Figura 6B). Curiosamente, el análisis comparativo de los diez mejores funciones biológicas muestra que las principales funciones celulares afectadas por el tratamiento fueron los mismos para las dos concentraciones, lo que indica un efecto específico y dependiente de la dosis de la droga. Las funciones descritas en la Figura 6B son coherentes y representativas de los cambios tanto morfológicos y funcionales observados a nivel fenotípico: recuperación de vías de la muerte celular, alteraciones del ciclo celular y la tasa de proliferación, cambios en la morfología celular. Otras funciones afectadas significativamente eran "ARN post-transcripcional modificaciones", "Expresión de Genes" y "ADN de replicación, recombinación y reparación". Genes agrupados en las diferentes funciones se enumeran en la Tabla S4.
Los conjuntos de datos obtenidos con las dos dosis se compararon sucesivamente en un diagrama de Venn y 144 genes resultaron ser compartido entre las dos listas (Figura 6C, el cuadro S5 ). Entre ellos, los más representados ontología de genes (GO) se identificaron utilizando la herramienta de DAVID "Tabla de funciones de anotación", incluyendo las tres categorías: los procesos biológicos, componentes celulares y moleculares funciones. grupos funcionales de anotación fueron identificados para cada categoría, con puntuaciones de enriquecimiento que van desde 1.33 a la 8,63 (Tabla 1). Curiosamente, el GO "Componente Celular" categoría identificó 20 genes todos ellos pertenecientes a los compartimentos nucleares y específicamente a la parte nuclear, la remodelación de la cromatina y términos complejos cromosómicas (Tabla 2).
Abacavir Modula LÍNEA -1 mRNA expresión
Debido a la evidencia sobre la relación entre la actividad RT, LINE-1 de expresión y el cáncer de reprogramación celular [18] - [21], se decidió investigar el efecto de ABC sobre la expresión de esta clase de retrotransposones. Específicamente, LINE-1 consisten de un 5 'UTR (región no traducida), dos marcos de lectura abierta (ORF1 y ORF2) y un 3' UTR que termina en una cola de poli (A). ORF1 codifica una proteína con capacidad de unión a ARN, mientras que ORF2 codifica una proteína con endonucleasa y revertir funciones de la transcriptasa [7]. Los ADNc obtenidos a partir de las células de cáncer de próstata, no tratados y tratados con las dos dosis de ABC y se recogieron a las 24, 48, 72, 96 y 120 h, fueron amplificados por PCR en tiempo real con los cebadores y sondas que reconocen regiones conservadas de LINE-1 ORF1 y ORF2 secuencias de codificación. Como se muestra en la Figura 7, se observó una dosis y dependiente del tiempo de incremento del nivel de expresión de mRNAs, ya sea en células PC3 y LNCaP, tanto para transcripciones ORF2 ORF1 y, lo que indica que LINE-1 podría desempeñar un papel en los cambios moleculares y funcionales observados en ABC tratamiento.
Los niveles relativos de transcritos LINE-1 mRNA (ORF1 y ORF2) en PC3 y las células LNCaP tratadas con 15 y 150 ABC mu M en diferentes puntos temporales. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los (*) y (**) símbolos denotan una diferencia significativa en comparación con las células no tratadas, con un valor de p & lt; 0,05 y. & Lt; 0,01, respectivamente
Discusión
Un gran número de la evidencia ha confirmado la asociación entre un alto nivel de expresión endógena RT y transformado fenotipo /tumoral de células [11], [17]. Estudios previos con inhibidores de la RT alostéricos, NNRTI, sugieren que la RT-LINE-1 codificada puede ser considerado como un objetivo molecular novedoso en la terapia del cáncer.
En este trabajo nos muestran la actividad antitumoral de Abacavir, una transcripción inversa análogos de nucleósido inhibidor (INTI) en PC3 y LNCaP líneas celulares de próstata humana de origen metastásico. Además, se presenta por primera vez que el tratamiento ABC puede modular la expresión de ARNm de LINE-1.
ABC reducido significativamente el crecimiento celular, la inducción de un retraso en la progresión de la fase S del ciclo celular en células de cáncer de próstata. Este lento conduce a la consiguiente detención en la fase G2 /M en células PC3 mientras que las células LNCaP se acumula en la fase S. El efecto sobre el ciclo celular se hizo evidentes pocas horas después del tratamiento y las células entrar progresivamente en un estado de senescencia. La aparición de los cambios morfológicos asociados con la senescencia y la expresión SA-β-gal aumentó gradualmente en células PC3 y LNCaP llegar a 80% y 50%, respectivamente, en 5 días con el resultado de la muerte celular.
Contrastando migración de células tumorales y la invasión es un tema central en el cáncer de próstata. Es bien sabido que la presencia de metástasis disminuye la probabilidad de supervivencia del paciente y que las opciones de tratamiento actualmente disponibles rara vez son capaces de curar las formas metastásicas.