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PLOS ONE: La variabilidad genética de la vía mTOR y cáncer de próstata de riesgo en el estudio prospectivo europeo sobre el Cáncer (EPIC)


Extracto

El mTOR (diana de la rapamicina en mamíferos) y la vía de transducción de señales integra diversas señales, regulación la biogénesis de ribosomas y la síntesis de proteínas en función de la energía y aminoácidos disponibles, y asegurar un acoplamiento apropiado de la proliferación celular con un aumento en el tamaño celular. Además, la evidencia reciente ha puesto de manifiesto una interacción entre las vías de mTOR y p53. Investigamos la variabilidad genética de 67 genes clave en la vía de mTOR y en los genes de la vía de p53 que interactúan con mTOR. Hemos probado la asociación de 1.084 SNPs marcado con el riesgo de cáncer de próstata en un estudio de 815 casos de cáncer de próstata y 1.266 controles anidados en el estudio prospectivo europeo sobre cáncer y nutrición (EPIC). Elegimos el SNP (n = 11) con la asociación más fuerte con el riesgo (p & lt; 0,01) y se intentó replicar su asociación en una serie adicional de 838 casos de cáncer de próstata y 943 controles de EPIC. En el análisis conjunto de la primera y segunda fase de dos SNPs de la
PRKCI
gen mostró una asociación con el riesgo de cáncer de próstata (O
IC del alelo = 0,85, 95% 0,78 a 0,94, p = 1,3 × 10
-3 para rs546950 y O
alelo = 0,84; IC del 95%: 0,76-0,93, p = 5,6 × 10
-4 para rs4955720). Se confirmó esto en un meta-análisis utilizando como establece la replicación de los datos de la segunda fase de nuestro estudio conjuntamente con la primera fase de los marcadores genéticos del cáncer de proyecto (CGEMS) Susceptibilidad. En conclusión, hemos observado una asociación con el riesgo de cáncer de próstata para los dos SNPs que pertenece a
PRKCI
, un gen que se sobreexpresa frecuentemente en diversos tumores, incluyendo el cáncer de próstata

Visto:. Campa D, Hüsing A, Stein A, Dostal L, Boeing H, Pischon T, et al. (2011) La variabilidad genética de la vía mTOR y cáncer de próstata de riesgo en el estudio prospectivo europeo sobre el Cáncer (EPIC). PLoS ONE 6 (2): e16914. doi: 10.1371 /journal.pone.0016914

Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América

Recibido: 6 Octubre 2010; Aceptado: 1 Enero 2011; Publicado: 23 Febrero 2011

Derechos de Autor © 2011 Campa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los resultados específicos de este estudio se obtuvieron con el apoyo financiero del Ejército de los EE.UU. de Investigación médica y el Comando de material (W81XWH-05-1-0156). http://cdmrp.army.mil/pcrp/default.shtml. El estudio EPIC fue financiado por el Programa "Europa contra el Cáncer" de la Comisión Europea (SANCO); Ligue contre le Cancer (Francia); Société 3M (Francia); Mutua General de Educación Nacional l'; Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Ayuda contra el Cáncer de Alemania; Centro Alemán de Investigación Oncológica; Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación; Sociedad Danesa del Cáncer; Fondo de Investigación en Salud (FIS) del Ministerio de Sanidad español; Los gobiernos regionales e instituciones de España participantes; Investigación del Cáncer del Reino Unido; Consejo de Investigación Médica, Reino Unido; Helénica Ministerio de Salud y Solidaridad Social; la Fundación Stavros Niarchos y la Fundación Helénica de la Salud; Asociación Italiana para la Investigación sobre el Cáncer; Consejo Nacional Italiano de Investigación; Ministerio holandés de Salud Pública, Bienestar y Deportes (VWS), Ministerio de Salud holandés, Países Bajos cáncer del Registro (NKR), Fondos de Investigación LK, los fondos de prevención holandeses, holandés ZON (Zorg Onderzoek Nederland), Fondo Mundial para la Investigación del Cáncer (WCRF) (El Países Bajos); Estadísticas Países Bajos; Sociedad Sueca del Cáncer; Consejo científico de Suecia; Junta de Skåne, Suecia; Noruego de Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Dentro del tejido de la próstata, se cree que los efectos promotores de tumores de las hormonas endógenas y factores de crecimiento que se asocia con la estimulación del crecimiento celular y la mitosis, y la inhibición de la apoptosis. Además de la señalización de IGF-I (pero también la insulina y otros factores de crecimiento), el crecimiento y la proliferación de las células son co-determinado por cantidades de aminoácidos esenciales energía y disponibles para la célula [1], [2],.

estudios recientes han demostrado que la mTOR (objetivo mamífero de la rapamicina) y la vía de transducción de señales integra estas diversas señales, la regulación de la biogénesis de ribosomas y la síntesis de proteínas en función de la energía y aminoácidos disponibles, y asegurar un acoplamiento apropiado de celular proliferación con el aumento de tamaño de la célula [1], [2]. La vía de mTOR se regula a través de una cascada de reacciones de fosforilación enzimática a través de quinasa fosfatidil-inositol-trifosfato (PI3K) /proteína quinasa B (PKB-AKT1), atípica la proteína quinasa C (aPKC), activada por AMP proteína quinasa (AMPK), hamartin /tuberina (codificada respectivamente por el complejo de esclerosis tuberosa-1 (
TSC1
) y 2 (
TSC2
) genes), ras-homólogo enriquecido en el cerebro (Rheb), proteína asociada reglamentación con mTOR (Raptor), y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR). la activación de mTOR a su vez conduce a la fosforilación de elementos intermedios que controlan directamente la biogénesis de ribosomas y la traducción de ARNm ribosomal para la síntesis de proteínas [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Figura S1 muestra un esquema simplificado de la vía mTOR

Esta vía incluye varios proto-oncogenes establecidos (
PI3K, AKT1
) y los genes supresores de tumores (
PTEN.
- que reduce la actividad de mTOR mediante la inhibición de
PI3K /AKT1 - TSC1, TSC2
). Estos genes están mutados a menudo o expresado de forma aberrante en tumores malignos humanos, incluyendo los tumores de próstata [9], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].

Además, la evidencia reciente ha señalado una interesante interacción entre las vías de mTOR y p53 (revisado por Levine et al., 2006) [24]. Hay dos conexiones principales entre estas vías, dando lugar a alteración de la respuesta a señales de estrés después de la activación de p53, a través de la activación de AMPK, TSC2 y una fosfatasa p53, compuesto de una subunidad alfa-4 y la subunidad catalítica de PP2A.

la hipótesis de que los genes en la vía de mTOR y los genes de la vía de p53 que se relacionan directamente con mTOR pueden estar implicados en el centro de la carcinogénesis de próstata, y que los alelos polimórficos en estos genes podrían modificar su expresión o actividad, lo que confiere susceptibilidad al cáncer de próstata alterado. SNPs en los genes pertenecientes a la vía mTOR ya se han estudiado en relación con el riesgo de cáncer, con algunos resultados prometedores [25], [26], [27].

En este informe se investigó la variabilidad genética de los 67 genes clave en las vías antes mencionadas. Hemos probado la asociación de 1.084 SNPs marcado con el riesgo de cáncer de próstata en un estudio de casos y controles anidado en el estudio prospectivo europeo sobre cáncer y nutrición (EPIC). A nuestro entender este es el primer informe sobre los polimorfismos de genes y éstos riesgo de cáncer de próstata.

Resultados

Resumen de las características de las poblaciones de estudio se muestran en la tabla 1. En la primera fase de este estudio se analizaron 1.084 SNPs en 67 genes implicados en la vía mTOR (como se resume en el cuadro complementario S1) en 815 casos de cáncer de próstata y 1.266 controles emparejados. Hemos replicado los mejores éxitos en una población independiente que consta de 838 casos de cáncer de próstata y 943 controles emparejados.

las tasas de éxito de Genotipado y de control de calidad

Hemos tenido 1.163 SNPs en nuestra matriz GoldenGate, de los cuales 30 se incluyeron como controles de calidad y 1.133 estaban en las regiones de genes candidatos de interés en este estudio. Treinta y cuatro SNPs se cayó porque tenían un tipo de referencia inferior al 75%, lo que suele ser indicativo de mala calidad genotipado. Once SNPs (1% del total) mostraron una fuerte salida de equilibrio de Hardy-Weinberg (p & lt; 10
-5) y por lo tanto no fueron analizados. Cuatro SNP fueron monomórficos en esta población. Esto dejó un total de 1.084 SNPs (96% de los seleccionados inicialmente) en los 67 genes candidatos para ser analizados

El tipo de referencia promedio de los 1.084 SNPs utilizados para el análisis estadístico fue del 99,8% (intervalo de 85,2%. - 100%).

se incluyeron treinta SNPs, que había sido previamente genotipo en las mismas muestras en el marco de un estudio diferente. La concordancia de los nuevos genotipos con los viejos genotipos fue del 100%.

incluyó inicialmente 2.099 muestras, y después de la eliminación de las muestras de sujetos con un tipo de referencia inferior al 75% (n = 39), teníamos un conjunto de datos que incluye 815 casos de cáncer de próstata y 1.239 controles. La densidad de incidencia de muestreo llevado a duplicar la selección de los 27 controles, para que 1.266 controles se incluyeron en los análisis condicionales.

duplicados de las muestras al azar (~ 5%) también fueron incluidos y la concordancia de sus genotipos fue de 100,0%.

principales efectos de SNPs genotipo

Once SNPs se asociaron significativamente con el riesgo de cáncer de próstata, en un umbral de p & lt; 0,01 (p
Trend & lt; 0,01 o p
2dF & lt; 0,01) ( rs520820 en
GADD45A
; rs546950 y rs4955720 en
PRKCI
; rs706711, rs831123 y rs13156223 en
PIK3R1
; rs6797860 en
TP63
; rs11763144 en
PRKAG2
; rs388372 en
rps6ka2
; rs13337626 en
TSC2
em; rs3783501 en
GADD45B
). cuadro complementario S2 muestra resultados detallados para los 1,084 SNPs.

Replicación

Estamos genotipo SNP las once de la primera fase de un conjunto adicional de 838 casos de cáncer de próstata y 943 controles emparejados. En la segunda fase rs546950 SNP en el
PRKCI
gen mostró una asociación estadísticamente significativa con el riesgo de cáncer de próstata, en el umbral convencional de p. & Lt; 0,05 (p
2dF = 0,02)

cuando se analizaron conjuntamente los resultados de los dos grupos de muestras, tanto
PRKCI
SNP mostraron una asociación con el riesgo (O
alelo = 0,84; IC del 95% = 0,76-0,93, p
2dF = 0,0028 , p
tendencia = 0,0007 para rs4955720; O
alelo = 0,86; IC del 95% = 0,78-0,95, p
2dF = 0,0014, p
tendencia = 0,0020 para rs546950). Resultados para la primera fase, el conjunto de replicación y para el análisis conjunto se muestran en la tabla 2.

Se calculó H
valores FEP para cada gen candidato por separado y para todo el estudio (mediante la adición el gen individual H
valores FEP; detalles se muestran en el cuadro complementario S3). El H
ef-ancha vía era 849. Por ello, utilizó una significación de p umbral de estudio a escala de 0,05 /849 = 5,9 × 10
-5. El uso de este umbral, no hay asociación significativa (p
Trend & lt; 5.9.x10
-5 o p
2dF & lt; 5,9 × 10
-5) se observaron entre cualquiera de los polimorfismos genotipo y el cáncer de próstata general
riesgo.
los dos SNPs en
PRKCI
también se genotipo en el contexto de los marcadores genéticos de susceptibilidad del cáncer de proyecto (CGEMS) (http://cgems.cancer.gov/), uno de los primeros estudios de asociación de genoma completo en la susceptibilidad al cáncer de próstata. Las asociaciones observadas en la primera fase de CGEMS (O
alelo = 0,85 p
tendencia = 0,0024 para rs4955720, O
alelo = 0,94 p
tendencia = 0,089 para rs546950) fueron similares a los observados en el presente informe. En un meta-análisis utilizando el incondicional O-estimación a partir de los datos de la segunda fase de nuestro estudio en conjunto con los resultados de CGEMS, los dos SNPs mostraron resultados muy similares a los obtenidos con los datos de EPIC solos (O
alelo = 0.91 , IC 95% 0,83 a 0,99, p = 0,029 para rs546950 y O
alelo = 0,87 IC, 95% desde 0,79 hasta 0,95, p = 0,002 para rs4955720). Un meta-análisis realizado teniendo en cuenta los datos conjuntos de la primera y segunda fase de nuestro estudio con los resultados de CGEMS mostró esencialmente los mismos resultados (O
alelo = 0,91, IC del 95% desde 0,84 hasta 0,98, p = 0,019 para rs546950 y OR
alelo = 0,85, IC 95%: 0,78-0,92, p = 0,00016 para rs4955720).

Efectos del genotipo SNPs en subgrupos de la enfermedad agresividad

Se analizaron las asociaciones de SNPs con cáncer de próstata riesgo mediante la agrupación de los casos de acuerdo con la agresividad de la enfermedad, pero no hemos observado estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) la heterogeneidad entre los estratos. Los resultados de los once SNPs que se genotipo en el conjunto completo de datos se muestran en la tabla suplementaria S4

Discusión

La vía mTOR está implicada en el desarrollo del tumor, y los análogos de la rapamicina -. Un antibiótico natural que interfiere específicamente con la acción de mTOR (a través de una proteína receptora adicional) - están mostrando una gran promesa como agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de ciertos tipos de tumores sólidos [28], [29], [30]. La hipótesis de que los genes pertenecientes a la vía mTOR pueden estar implicados en el centro de desarrollo de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, y que los alelos polimórficos de estos genes podrían afectar el riesgo de cáncer de próstata.

En este estudio, hemos capturado a fondo la variación genética común a través de 67 genes en la vía mTOR y hasta donde sabemos, esta es la evaluación más completa de variación común y la codificación de los genes de la vía mTOR en relación con el riesgo de cáncer de próstata. Encontramos una asociación de dos SNPs en el
PRKCI
gen, rs546950 y rs4955720, con una disminución del riesgo de cáncer de próstata. El primer SNP mostró una asociación en la primera proyección, en un conjunto de replicación y en un meta-análisis de la segunda fase con los datos de CGEMS, mientras que rs4955720 mostraron una asociación única en el conjunto de selección y en el meta-análisis. Puesto que los dos SNPs fueron seleccionados como etiquetado SNPs que no son fuertes en LD, sin embargo, no podemos descartar que pudieran reflejar la misma señal debido a una LD subyacente moderada (r
2 entre los dos SNPs es 0,53).

Una función de la variación genética en el
PRKCI
gen en la etiología del cáncer de próstata es convincente en vista de que la proteína quinasa C atípica lambda /ápice (aPKCλ /ι), codificada por el
PRKCI
gen , es una isozima de la proteína quinasa C, que desempeña funciones múltiples en el mantenimiento y crecimiento de las células epiteliales [31] celular, [32], [33], [34], [35], [36], [37]. Una de las funciones fisiológicas de aPKCλ /ι es mediar la insulina aumenta inducida en el transporte de glucosa. La insulina regula el transporte de glucosa a través de fosfatidil-inositol-trifosfato quinasa (PI3K). efectores distales de PI3K incluyen la proteína quinasa B (PKB /Akt) y aPKC isoformas ζ y λ /ι [38].

isoenzimas PKC también están involucrados en la proliferación celular, la supervivencia, la diferenciación y la apoptosis. Los estudios sobre pulmón, ovario, colon y cáncer de mama han demostrado una relación entre el /ι expresión y la progresión del cáncer aPKCλ y sugieren que aPKCλ /ι expresión pueden condicionar la supervivencia [21], [22], [23], [39], [40], [41], [42], [43]. Hay varios informes que muestran una mayor expresión aPKCλ /ι en tejidos de cáncer de próstata humano, pero la relación entre aPKCλ /ι y la progresión del cáncer de próstata sigue siendo poco clara [44], [45]. Además experimentos usando la línea celular de cáncer de próstata DU145 reveló que aPKCλ /ι está implicada en el crecimiento del cáncer de próstata, tanto
in vivo
y
in vitro
[46]. La sobreexpresión de aPKCλ /ι se puede explicar con una amplificación de la
PRCKI
gen, que se ha informado en el pulmón y el cáncer de ovario [22], [23], [39] o la amplificación del cromosoma 3q incluyendo el
PRCKI
gen que se ha informado en líneas celulares de cáncer de próstata [47]. Otra posibilidad es que aPKCλ /ι expresión es regulada a través de la activación de la transcripción de
PRCKI
promotor [48].

En este informe, se encontró que dos variantes alélicas de la
PRKCI
gen se asociaron a un nivel significativo-estudio a gota con una disminución del riesgo de cáncer de próstata. rs546950 y rs4955720 no están situados en la región codificante del gen y no es inmediatamente evidente cómo relacionar la variabilidad genética de la función del gen. Se realizaron búsquedas en bases de datos públicas para cualquier función notificados de los dos SNPs, pero no hemos encontrado evidencia que apunta a una expresión diferencial de genes o la estabilidad del ARNm. No hay ningún informe hasta la fecha ha sido publicada sobre cada SNP en relación con suceptibility enfermedad. También realizamos análisis in silico de los posibles cambios en los sitios de unión trasciption. Estos análisis predicen una unión a los alelos de los dos SNPs de diversos factores de transcripción diferencial. En particular MYOD1 se predice que se unen sólo a la menor alelo (A) de rs546950 y POU3F3 para el alelo menor (A) de rs4955720. Los dos factores de transcripción tienen efecto pro-diferenciación, anti-proliferación [49], [50]. El hecho de que ambos se unen a los alelos menores, de protección es intrigante, aunque MYOD1 y POU3F3 sólo se han informado para ejercer su función en el músculo y en el cerebro, respectivamente. rs546950 está situado en el primer intrón de
PRKCI
, muy cerca del comienzo del gen, por lo tanto, esto es consistente con un posible implicación en la regulación de la transcripción del gen. Puesto que el alelo variante ejerce un efecto protector sobre el riesgo de cáncer de próstata se puede plantear la hipótesis de que disminuye o aumenta la capacidad de los factores de transcripción de atar y de tal manera que resulta en una disminución de la expresión de genes, y por lo tanto reducir el riesgo de cáncer de próstata.

es más difícil entender la asociación entre rs4955720 y la disminución del riesgo de cáncer de próstata desde un punto de vista biológico. Sin embargo, en el análisis conjunto el valor p de este SNP fue el más importante de los dos. Este SNP se encuentra en el 3 'del gen, después de que el final de la última exón, y una posible función no es inmediatamente evidente. También es posible la unión diferencial con factores de transcripción parece ser menos relevante en este caso. rs4955720 podría estar en alto desequilibrio de ligamiento (LD) con otro SNP que afecta directamente a la transcripción y /o la función de
PRKCI
. Sin embargo, todo común conocido
PRKCI
SNPs en alto LD con rs4955720 están situados en intrones del gen, y no parecen funcionalmente relevante. En conclusión, es difícil de entender el mecanismo biológico que podría explicar la asociación de los dos polimorfismo con el riesgo de cáncer de próstata y se requieren estudios funcionales adicionales.

SNPs de algunos de los genes PI3K que investigamos aquí también fueron estudiados en el de mama y el cáncer de próstata Consorcio de cohortes (BPC3) (Koutros 2010). En ese estudio, rs7556371, un SNP de
PIK3C2B
, se demostró que se asocia con un mayor riesgo de cáncer de próstata. En nuestro estudio hemos genotipo rs4951384, rs7556371 que etiqueta (r
2 = 1), pero no se observó ninguna evidencia de asociación (cuadro complementario S2). Sin embargo, tiene que ser notado que el aumento de riesgo encontrado por Koutros et al era muy modesto y por lo tanto podría ser detectado solamente por un estudio con un gran tamaño de la muestra, tal como BPC3.
Enfoque de marcado
El intensiva SNP se usa, siempre cerca de un análisis exhaustivo de las asociaciones de riesgo de cáncer de próstata con variantes polimórficas comunes conocidos para cada uno de los loci estudiados posible mono-alélica (efecto principal). Tuvimos suficiente potencia (0,80 para el modelo codominante en el análisis conjunto) para detectar OR = 1,40 (u OR = 0,71 para las asociaciones con un menor riesgo) a alfa = 5,9 × 10
-5 (significación p-umbral de estudio a escala ) para un SNP con una frecuencia del alelo menor de 0,30.

a pesar de que más del 97% de los sujetos EPIC se estima que son de origen caucásico, diferencias en las frecuencias alélicas en toda Europa podrían, en teoría causa de confusión por la estratificación de la población. Sin embargo, no se observan grandes variaciones en las frecuencias alélicas entre los países para el SNP estudiado aquí (datos no mostrados).

Un posible inconveniente de este trabajo es el gran número de pruebas realizadas, aunque varios indicios sugieren un verdadero asociación: 1) que observamos asociaciones (p & lt; 0,05) en ambas fases del estudio, 2) después de corregir por el número de pruebas (n = 11) lleva a cabo en la segunda fase de la asociación entre rs546950 y el riesgo de cáncer de próstata sigue siendo significativa, 3 ) la asociación es biológicamente plausible y 4) el metanálisis CGEMS /EPIC (2.743 casos y 3.088 controles) mostró resultados muy similares a los obtenidos con los datos de EPIC sola (p = 0,002 para rs4955720 y p = 0,029 para rs546950.

en conclusión, hemos observado una asociación con el riesgo de cáncer de próstata para los dos SNPs que pertenece a
PRKCI
, un gen que se sobreexpresa frecuentemente en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata. Esta réplica de observación órdenes en un estudio más amplio .

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todos los participantes firmaron un consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por los comités de ética de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, y del colaborador instituciones responsables del reclutamiento de sujetos en cada uno de los centros de reclutamiento EPIC.

La cohorte EPIC

Una descripción muy detallada de la cohorte EPIC ha sido publicado en otra parte [51]. En pocas palabras, EPIC consiste en cerca de 370.000 mujeres y 150.000 hombres, 35-69 años de edad, reclutados entre 1992 y 2005 en 10 países de Europa occidental

La gran mayoría (& gt; 97%). De los sujetos reclutados en la cohorte EPIC son de origen europeo ( 'Europeo'). Todos los sujetos del estudio EPIC previsto mediciones antropométricas (altura, peso, y de cintura y cadera) y extensa, información cuestionario estandarizado sobre la historia clínica, la dieta, la actividad física, el tabaquismo y otros factores de estilo de vida. Alrededor de 260.000 mujeres y 140.000 hombres proporcionaron una muestra de sangre.

Los casos de cáncer que se presenta después de reclutamiento en la cohorte y la donación de sangre se identifican a través de los registros de cáncer locales y nacionales en 7 de los 10 países, y en Francia, Alemania, y Grecia por una combinación de contactos con los seguros nacionales de salud y /o seguimiento activo a través de los sujetos de estudio o sus familiares. Seguimiento de estado vital se logra a través de registro de vinculación con los registros de mortalidad.

Selección de casos y controles

Se seleccionaron sujetos de casos entre los hombres que desarrollaron cáncer de próstata después de la extracción de sangre. Se seleccionaron los sujetos de control (1-2 controles por caso) por muestreo al azar densidad de incidencia, haciendo coincidir los casos para el centro de reclutamiento, la edad a la donación de sangre y la duración del seguimiento. Un total de 815 casos de cáncer de próstata invasivo y 1.266 controles, para un total de 2.081 sujetos, fueron incluidos en la primera fase de este estudio. Cada control debería haber sido libre de cáncer hasta la duración del seguimiento del caso índice.

SNP selección

Para cada uno de los 67 genes candidatos se seleccionó una región genómica entre 5 kb 5 'del inicio de la primera exón conocido y 5 kb 3' del final de la última exón conocida. Una lista de los SNPs en todas las 67 regiones de genes fue compilado utilizando datos de HapMap (versión 22, basado en dbSNP versión 126 y NCBI genoma construir 36), y marcado SNPs fueron seleccionados mediante el uso del algoritmo Tagger [52], tal como se aplica en el Haploview software. Los parámetros utilizados para la selección Tagger eran alelo menor frecuencia ≥5% en los caucásicos, r mínimo
2 = 0,8 entre cada par de SNPs etiquetados y etiquetado, marcado por parejas (observamos significa un promedio r
2 entre el etiquetado SNPs y la SNPs que la etiqueta de 0,95). SNPs que se prevé que un mal desempeño con la tecnología de genotipificación de Illumina GoldenGate fueron reemplazados ya sea por SNPs en alto LD (r
2 = 0,8, calculado a partir de datos de HapMap), o se ha caído de la lista si ningún proxy estaba disponible. Esto nos dio una lista de 1.133 SNPs. Finalmente, para propósitos de control de calidad, agregamos 30 SNPs que había sido genotipo en las mismas muestras en un proyecto no relacionado.

Preparación de la muestra y genotipado

Se extrajo ADN de muestras de sangre en un instrumento Autopure (Qiagen, Hilden, Alemania) con Puregene química (Qiagen, Hilden, Alemania). El orden de los ADN de casos y controles fue al azar en placas de PCR con el fin de asegurar que un número igual de casos y controles se podría analizar de forma simultánea.

La genotipificación se llevó a cabo utilizando la tecnología de Illumina GoldenGate (San Diego, CA , EE.UU.), de acuerdo con el protocolo especificado por el fabricante.

filtrado de datos y análisis estadístico

Cualquier muestra donde mayor que 25% de los SNPs no tenía todos los SNPs establece en falta y estos sujetos fueron retirados del análisis. A continuación, los datos filtrados para eliminar el mal desempeño de SNPs: todos los SNPs que fallaron el 25% de las muestras o se fijaron más en falta, al igual que todos los SNPs que mostraron estadísticamente significativa (P & lt; 10
-5) desviaciones de equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) entre los controles
.
Se analizó la asociación entre el riesgo de cáncer de próstata y los genotipos para cada SNP mediante regresión logística condicional. Los genotipos fueron codificados ya sea como cargos de menor alelos (prueba de tendencia) o como dos variables indicadoras, uno de heterocigotos y homocigotos una para menores de alelo (dos grados de libertad de prueba).

También realizaron análisis de subgrupos de agresividad de la enfermedad (enfermedad agresiva se define como la extensión extra-prostática (fase C /D) o el grado histológico alto (puntuación de Gleason ≥8).

Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS 9.11.

para tener en cuenta el gran número de pruebas realizadas en este proyecto, se calcularon para cada gen el número de variables independientes y eficaces, H
eff, mediante el uso del enfoque SNP descomposición espectral [53]. Se obtuvo un gen en toda H
ef valor para cada gen y también un M
ef valor de todo el estudio, sumando el gen M
de la eFF.

replicación

Hemos replicado los SNPs mostrando las asociaciones más fuertes con el riesgo de cáncer de próstata (p
Trend & lt; 0,01 o p
2dF & lt; 0,01; n = 11) en un conjunto adicional de 838 casos y 943 controles seleccionados dentro de la cohorte EPIC. Toda la genotipificación adicional se llevó a cabo utilizando el ensayo de Taqman. Las sondas y cebadores Taqman MGB se compraron de Applied Biosystems (Foster City, CA) como ensayos de pre-diseñadas. La mezcla de reacción incluía 10 ng de ADN genómico, 10 pmol de cada cebador, 2 pmol de cada sonda y 2,5 l de 2x mezcla maestra (Applied Biosystems) en un volumen final de 5 l. El termociclado incluía 40 ciclos con 30 s a 95 ° C seguido de 60 s a 60 ° C. placas de PCR se leyeron en un instrumento ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems).

Todas las muestras que no dieron un resultado fiable en la primera ronda de genotipado se vuelven a enviar hasta dos rondas adicionales de genotipado. Los puntos de datos que aún no fueron llenadas después de este procedimiento se dejan en blanco. genotipos de control de calidad repetida (5% del total) mostraron una concordancia del 100,0%.

El análisis bioinformático

Los posibles sitios de unión de factores de transcripción dentro de la secuencia que abarca el estudio de dos a gota SNPs asociados significativamente se realizaron con MatInspector Profesional (http://genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl) [54].

Apoyo a la Información
Figura S1.
de dibujos animados de la vía mTOR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s001 gratis (PNG)
Tabla S1.
genes candidatos y sus SNPs
doi: 10.1371. /journal.pone.0016914.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
efectos principales de 1.084 SNPs genotipo en la primera fase. Las columnas de esta tabla muestran: gen nombre, número rs NCBI dbSNP, el número de casos y controles para cada uno de los tres genotipos, los odds ratios de heterocigotos, homocigotos para el alelo raro (se refiere a los homocigotos para el alelo común) y por alelo, con un intervalo de confianza del 95%, valor p de la prueba con dos variables indicadoras (2) prueba df, p-valor de la prueba de tendencia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s003 gratis (XLS)
cuadro S3.
H
ef para cada gen en el estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s004 gratis (XLS) sobre Table S4.
Los análisis de subgrupos de agresividad de la enfermedad. Las columnas de esta tabla muestran: el nombre de genes, NCBI dbSNP número rs, genotipos posibles, números de casos y controles para cada uno de los tres genotipos, odds ratio para los heterocigotos y para los homocigotos para el alelo raro (que se refiere a los homocigotos para el alelo común) , con un intervalo de confianza del 95%, el parámetro Q de Cochran, I
2 estadística, valor p de la prueba de heterogeneidad, p-valor de la prueba de tendencia para cada estrato, nombre del estrato
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s005 gratis (XLS)

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