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PLOS ONE: La vimentina es una novela terapéuticas contra el cáncer de destino; Perspectivas desde In vitro e in vivo de xenoinjerto en ratones Studies


Extracto

Antecedentes

La vimentina es un filamento intermedio mesenquimales ubicua apoyar la integridad mecano-estructural de las células quiescentes durante su participación en la adhesión, la migración, la supervivencia , y la célula a través de procesos de ensamblaje dinámico /desmontaje de señalización en las células activadas. sarcomas de tejidos blandos y algunos cánceres epiteliales que exhiben "transición epitelial a mesenquimal" fenotipos expresan vimentina. Witaferina-A, un compuesto bioactivo de origen natural, se pueden orientar molecularmente vimentina, por lo que tratamos de evaluar sus efectos sobre el crecimiento del tumor

e in vitro
in vivo
la aclaración de este modo el papel de vimentina en drogas las respuestas inducidas.

métodos y las conclusiones

witaferina-a marcada apoptosis y la escisión de la vimentina en las células tumorales que expresan vimentina, pero significativamente menor en las células mesenquimales normales suscitó. Esta respuesta proapoptótico fue abrogada después de caída vimentina o por el bloqueo de la degradación de la vimentina caspasa inducida por medio de inhibidores de caspasa o sobreexpresión de mutado vimentina caspasa-resistente. Pronunciadas efectos anti-angiogénicos de witaferina-A se demostró, con sólo efectos mínimos vistos en las células endoteliales no proliferativas. Por otra parte, witaferina-A bloqueó significativamente el crecimiento del sarcoma de tejido blando, recidiva local y metástasis en un panel de sarcoma de tejidos blandos experimentos de xenoinjertos. La apoptosis, disminución de la angiogénesis, y la degradación de vimentina se observa en todos los especímenes tratados witaferina-A.

Conclusiones

A la luz de estos resultados, la evaluación de witaferina-A, sus análogos, o cualquier otro anti enfoques terapéuticos vimentina en el sarcoma de tejidos blandos y "transición epitelial a mesenquimal" contextos clínicos se justifica

Visto:. Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, S Bolshakov, Liu J, et al. (2010) La vimentina es una novela terapéuticas contra el cáncer de destino; Revelaciones de
in vitro
y
En Vivo
xenoinjerto en ratones de Estudios. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10.1371 /journal.pone.0010105

Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América

Recibido: 26 Septiembre, 2009; Aceptó 3 de marzo de 2010; Publicado: 16 Abril 2010

Derechos de Autor © 2010 Lahat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el NCI /NIH R01 CA138345 subvención (DL) y una subvención de semillas Fundación Amschwand del cáncer del sarcoma (a SW). La caracterización de líneas de células MD Anderson Cancer Center y Plataformas citogenéticos son a la vez apoyado por una beca de apoyo del Centro del Cáncer del NCI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Compuesta por más de 50 subtipos histológicos, el sarcoma de tejidos blandos (STB) se pueden clasificar en dos grandes grupos: aquellos con alteraciones genéticas específicas (translocaciones o mutaciones puntuales) y cariotipos relativamente simples, y los que tienen complejo, aneuploides desequilibrada cariotipos [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Una mejor comprensión de las aberraciones moleculares conducir el inicio y la progresión de varios STS subtipos pertenecientes al primer grupo (por ejemplo, las mutaciones c-kit en tumores del estroma gastrointestinal [GIST] o el 17; 22 translocación que conduce a PDGF-B sobre-expresión en dermatofibrosarcoma protuberante; [DFSP]), ha dado lugar a aplicaciones clínicas de terapias dirigidas efectivas (por ejemplo, imatinib mesilato) mejoró significativamente con los resultados [6]. Tales avances terapéuticos son muy alentadores y ponen de manifiesto la necesidad de identificar otras nuevas dianas moleculares en subtipos adicionales STS

La mayoría de STS pertenecen al segundo grupo que alberga cariotipos aneuploides.; este grupo se compone principalmente de histiocitoma fibroso maligno (MFH, también denominado sarcoma pleomórfico [UPS] no clasificados), leiomiosarcomas, los tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST), y liposarcoma pleomórfico o indiferenciadas. Si bien la presentación y la enfermedad de las manifestaciones clínicas varían dependiendo del subtipo histológico específico, en su conjunto, estos STS cariotipo complejo tienen un mal pronóstico, con una supervivencia a los 5 años de menos del 50%. A pesar del control inicial local (realizado mediante cirugía con o sin radiación), la recurrencia local y sistémica propagación ocurren comúnmente y la falta de opciones terapéuticas eficaces en estos escenarios clínicos es el principal problema no resuelto en STS. En contraste con la simplicidad genética de STS en el primer grupo, la diversidad biológica y molecular de STS cariotipo complejo limita notablemente la identificación de aberraciones individuales y específicos "adicción oncogénica". Mientras que un reto, la aclaración de nuevas terapias que puedan tener utilidad para una amplia gama de STS cariotipo complejo es crucial.

Desde los años 1960 tempranos, plantas y microbios han dado varias pequeñas moléculas útiles, de origen natural, orgánico que tenga anti-cáncer propiedades [7], [8], [9], [10].
Withania somnifera gratis (Ashwagandha) es una planta medicinal utilizada comúnmente en la medicina tradicional de la India para el tratamiento de un amplio espectro de trastornos [11], [12], [13], [14], [15]. Witaferina-A (WFA), un C-28 de tipo lactona ergostane esteroide altamente oxigenada, es un compuesto bioactivo aislado de
Withania somnifera
. WFA exhibe diversas actividades farmacológicas, incluyendo antiinflamatorio, inmunomodulador efectos antiangiogénicos [15], [16], [17], [18]. Varias líneas de evidencia sugieren que WFA tiene propiedades anti-cáncer, que se manifiestan por la orientación directamente las células tumorales e indirectamente impidiendo [neovasculatura asociada al tumor [19], [20]. Estudios recientes han demostrado que la WFA suprime el crecimiento de las células de mama y cáncer de próstata humano '
in vitro
y
in vivo
mediante la inducción de la apoptosis marcada [19], [21], [22]. inducida por WFA citoesqueleto arquitectura alteración [23], [24], [25], reactiva la generación de especies de oxígeno [26], [27], la disfunción mitocondrial [26], y la inhibición proteosomal [21] también se han sugerido. Se encontraron células normales, nontumorigenic a ser más resistentes que las células tumorales a la apoptosis inducida por WFA [22]; selectividad para las células malignas sin dañar las células normales es una característica altamente deseable de potenciales agentes terapéuticos contra el cáncer.

Los mecanismos exactos de acción WFA no han sido concluyentemente definido. Se han propuesto varias dianas moleculares, incluyendo el factor de transcripción NF-kB [28], [29]; la molécula de señalización AKT [27]; las moléculas pro-apoptóticos PAR-4, FOXO-3, y Bim [22]; y los proteosomal β5 quimotripsina de subunidades [21]. Un reciente estudio utilizó un enfoque de química genética y proteómica de investigación [30], en el que se utilizó un análogo de la WFA biotinilado como sonda para tirar hacia abajo parejas de unión WFA en las células endoteliales. Esta estrategia resultó en la identificación de la vimentina, un filamento intermedio de tipo III, como una novela sustrato WFA. Además, se encontró vimentina-WFA modificado para provocar efectos pro-apoptóticos y antiangiogénicos significativos, mientras que desmontables vimentina dio lugar a disminución de la sensibilidad de la WFA. Estos experimentos ofrecen información sobre la actividad de la WFA y ponen de relieve la utilidad potencial de vimentina como diana terapéutica contra el cáncer novela.

STS son mesenquimales y por lo tanto todos expresan vimentina, independientemente de su subtipo histológico. En consecuencia, es plausible que las estrategias terapéuticas anti-vimentina podrían provocar efectos anti-STS en una amplia gama de STS. Esta hipótesis nos llevó a determinar el impacto de la WFA en el STS cariotipo complejo
in vitro
y
in vivo
. Utilizamos líneas celulares humanas que representan leiomiosarcoma, TMVNP, fibrosarcoma, y ​​UPS /liposarcoma pleomórfico para evaluar el impacto de la vimentina en la sensibilidad a la WFA. Nuestros resultados sugieren que STS son muy sensibles a WFA, un efecto que es mucho más pronunciada que en los cánceres epiteliales vimentina-negativas. WFA induce una degradación de la caspasa-dependiente de la vimentina, lo que resulta en la apoptosis independiente de anoikis marcada y efectos antiangiogénicos asociados-STS. Los resultados apoyan firmemente la evaluación de la WFA o sus análogos como una estrategia clínica novedoso para pacientes portadores de estas malignidades devastadoras.

Resultados

células del sarcoma son muy sensibles a la WFA

Para evaluar el efecto de la WFA en el STS cariotipo complejo se seleccionó un panel de líneas celulares humanas que representan STS fibrosarcoma (HT1080), leiomiosarcoma (SKLMS1), TMVNP (STS26T), y alto grado de sarcoma pleomórfico /liposarcoma (PLS-1). Esta última línea celular se ha establecido recientemente en nuestro laboratorio (ver Datos S1 y Figura S1 para más detalles). El tratamiento de las células anteriores con WFA resultó en una disminución significativa en el número de células unidas y marcados cambios morfológicos, incluyendo células de redondeo y la condensación nuclear (Figura 1A). Los efectos de la WFA se produjo a las 2 horas después de iniciado el tratamiento y fueron dosis-y tiempo-dependiente (Figura S2). ensayos de crecimiento celular demostraron una disminución inducida por la WFA, dependiente de la dosis en el crecimiento celular STS (Figura 1B). La media ± DE WFA IC
50 valores (después de 24 h de tratamiento) se registraron como 0,4 M ± 0,07, 0,41 M ± 0,03, 0,37 M ± 0,12, y 0,53 M ± 0,1, por HT1080, SKLMS1, STS26T, y PLS -1, respectivamente. Del mismo modo, las dosis bajas de WFA (0,5 M) inhibió notablemente la capacidad de formación de colonias de células STS (Figura 1C). Por último, el efecto de la WFA en la STS de crecimiento independiente del anclaje se investigó. Todas las células STS evaluados demostraron una capacidad de crecer en agar blando; este crecimiento fue abrogado después de 24 h de tratamiento WFA (0,5 M) (Figura 1D). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que las células STS humanos son muy sensibles a los efectos inhibidores del crecimiento de la WFA.


A)
tratamiento WFA (1 M /24 h) da lugar a notables cambios morfológicos, incluyendo células de redondeo y la condensación nuclear, en células de STS;
B)
ensayos MTS demuestran una disminución inducida por la WFA, dependiente de la dosis en el crecimiento celular STS;
C)
WFA (0,5 M /24 h) inhibe marcadamente STS capacidad de formación de colonias de células medida después de diez días;
D)
WFA (0,5 M /24 h) abroga STS crecimiento celular independiente del anclaje se mide después de tres semanas. Los gráficos representan la media de tres experimentos repetidos ± SD.

WFA induce la apoptosis en las células marcadas STS pero menos apoptosis en fibroblastos humanos normales y células myogenic

Para evaluar el efecto de la WFA en STS supervivencia celular, se realizaron análisis de Anexina V /FACS. STS células fueron tratadas con concentraciones crecientes de WFA (0-5 M) durante 4 horas y 24 h; una importante inducción de la apoptosis fue evidente incluso en el corto período de tiempo, especialmente cuando se utilizan dosis altas (& gt; 2,5 M, p & lt; 0,05; Figura 2A). Se observó un aumento de la dosis y dependiente del tiempo en la apoptosis de las células tumorales en todas las células ensayadas. La inducción de apoptosis también se reflejó en el aumento observado en la caspasa 3 y la escisión de PARP activada (Western blot [BM]; Figura 2B)


A)
Anexina-V /FACS análisis que demuestran marcado. WFA apoptosis inducida en células STS (barras negras representan las 4 h de tratamiento WFA y barras grises representan 24 h);
B)
WFA (1 M /24 h) induce la caspasa-3 (Casp-3) la escisión y activación de PARP en células STS (análisis WB);
C)
células STS son resistentes a la anoikis en comparación con los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). WFA (1 M /24 h) induce la apoptosis en las dos células unidas y STS flotantes;
D)
Transmisión microscopía electrónica (TEM) fotografías que representan STS apoptosis de las células (grande condensación de flecha nuclear, formación de ampollas en pequeña flecha citoplásmica) en respuesta a WFA. Necrosis se demuestra en las células STS flotante;
E)
NHDF son más resistentes a los efectos de la WFA (IC50: 3.7 M ± 0,15) en comparación con células STS. Los gráficos representan la media de tres experimentos repetidos ± SD.

A continuación, se evaluó si la apoptosis inducida por la WFA podría atribuirse a la pérdida de células tumorales de la adhesión y el desprendimiento de la placa de cultivo, lo que resulta en anoikis. Fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) se sometieron a apoptosis significativa cuando se cultivan en suspensión, mientras que las células STS fueron resistentes a la anoikis y se pudieron observar ningún aumento significativo en la apoptosis (Figura 2C). WFA aumento de la apoptosis de las células tanto STS adjuntos y flotantes.

apoptosis inducida por WFA se confirmó adicionalmente usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los signos de apoptosis, incluyendo condensación de cromatina y la contracción citoplasma, fueron evidentes dentro de 4 h. Después de 24 h, se observó marcada apoptosis, junto con la pérdida de la membrana nuclear y citoplásmica blebbing; estos efectos se observaron en ambas celdas STS adjuntos y flotantes. También se observaron células flotantes STS necróticas (~20-30% de las células flotantes en total).

Por último, se evaluó el efecto de la WFA en las células mesenquimales normales (Figura 2E y S3). Los cultivos primarios de células humanas y NHDF intestinales musculares lisas (HISMC) fueron tratados con dosis crecientes de WFA durante 24 h. Contrariamente a nuestras observaciones en células STS, disminuciones en el número de células y los cambios morfológicos fueron evidentes por microscopía sólo después de altas dosis de WFA (& gt; 2,5 M). Media ± SD WFA IC
50 valores fueron 3,7 ± 0,15 M y 3,2 M ± 0,21 para NHDF y HISMC, respectivamente. Estos valores fueron más de 9 veces mayores que las observadas en las células STS. Del mismo modo, WFA indujo una tasa significativamente menor de apoptosis en estas células normales (P & lt; 0,05). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que WFA es un compuesto potente proapoptótico. STS células son muy sensibles a la WFA, mientras que las células mesenquimales normales son más resistentes a sus efectos.

WFA abroga la migración celular y la invasión STS

Seguidamente, evaluó el efecto de la WFA sobre la migración celular y la STS invasión. STS células se trataron previamente con dosis bajas de WFA (0,5 M) durante 4 horas, momento en que WFA se retiró por lavado con cuidado y se llevó a cabo un ensayo de cero cicatrización de la herida. Se observó una marcada disminución en la migración (Figura S4A). Además, las cámaras de Boyden modificadas fueron utilizados para cuantificar el efecto de la WFA sobre la migración y la invasión. STS células fueron pretratadas con una dosis baja de WFA (0,5 M) durante 4 h. Después de la interrupción de la WFA, las células se lavaron y se contaron; Se utilizaron además sólo las células viables. WFA migración inhibió significativamente y la invasión en todas las células STS examinados (P & lt; 0,05; Figura S4B).

Una advertencia potencial de estos experimentos es que el impacto demostró podría reflejar los efectos antiapoptóticos o inhibidores de crecimiento de WFA en lugar de sus efectos directos sobre la motilidad y /o invasión. Para hacer frente a esta posibilidad, en conjunción con los experimentos anteriores, pretratados células STS con una dosis baja de WFA (0,5 M durante 4 h) o DMSO (control); en la interrupción del WFA, las células se lavaron y se contaron y se volvieron a sembraron células viables. Recuento celular al final del experimento reveló sólo una pequeña disminución (& lt; 10%) en el número de células tratadas con WFA viables en relación con el número de células de control tratadas con (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados sugieren que la WFA abroga la motilidad celular y la invasión STS.

WFA induce la degradación vimentina y vimentina caída disminuye la sensibilidad de las células a la WFA

Un reciente estudio de la vimentina identificado como el posible diana molecular WFA [30]. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la WFA en la expresión de vimentina y la degradación. tratamiento WFA resultó en niveles de vimentina de larga duración en disminución y aumento de la expresión de productos de degradación vimentina en todas las células STS prueba (Figura 3A). WFA efecto sobre la vimentina es dependiente de la dosis y el tiempo; Las concentraciones altas WFA como resultado la escisión vimentina después de sólo 4 horas de tratamiento, mientras que la degradación vimentina se nota después de 24 h con dosis más bajas.


A)
tratamiento WFA (5 M /4 h) los resultados en niveles disminuidos de longitud completa (FL) vimentina y aumento de la expresión de productos de degradación vimentina (VDP) en todos los STS ensayaron células. También se muestra un efecto dependiente de la dosis en las células WFA SKLMS1 tratados durante 4 h. la escisión vimentina se nota secundaria a bajas concentraciones WFA después de 24 h de tratamiento;
B)
anti-vimentina SmartPool siRNA (20 nM) produce una marcada disminución en la expresión de vimentina en células SKLMS1 (BM). Vimentina caída sustancial bloques WFA-inducidas (1 M /24 h) la apoptosis;
C)
vimentina endógena fue golpeado primero y diez en las células SKLMS1 utilizando oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidada anti-vimentina. Después de la precipitación, vimentina fue enérgicamente re-expresa en las células (WB). Similar a los resultados de siRNA desmontables, oligómeros de morfolino anti-vimentina significativamente bloques inducida por WFA (1 M /24 hr) de la apoptosis. Re-expresión de vimentina restaura la sensibilidad a SKLMS1 WFA;
D): perfil del STS células (SKLMS1 y pLS1) expresan niveles significativamente más altos de vimentina soluble en comparación con las células mesenquimales normales (células de músculo liso: HA-SMC y HC-SMC y fibroblastos: NHDF). (NT = no siRNA dirigido siRNA, Vim siRNA = anti-vimentina siRNA SmartPool; NT morfolino morfolino = no focalización; Vim KD = vimentina desmontables) guía empresas
Para determinar si el efecto de la WFA en las células STS es al menos parcialmente mediada a través de la vimentina, hemos optado por utilizar un enfoque vimentina caída. Anti-vimentina SmartPool siRNA provocó una disminución sustancial en la expresión de vimentina en células SKLMS1 (WB; Figura 3B). Vimentina desmontables
per se
no indujo la apoptosis significativa en las células STS, en comparación con el simulacro o no la orientación de la transfección de siRNA. Como era de esperar por los experimentos anteriores, el tratamiento WFA resultó en la apoptosis significativa en las células transfectadas siRNA simuladas y no director. Sin embargo, desmontables vimentina bloqueado sustancialmente la apoptosis inducida por la WFA. En conjunto, estos datos sugieren que la degradación inducida por la WFA vimentina es necesaria para lograr un efecto terapéutico mejorado.

Para confirmar el papel potencial de la vimentina en la apoptosis inducida por la WFA, se utilizó un enfoque experimental de rescate. vimentina endógena fue eliminado por vez primera en las células SKLMS1 utilizando oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidada anti-vimentina. Estos morfolinos objetivo vimentina pre-ARNm, permitiendo de este modo la re-expresión forzada de vimentina mediante la transfección de un constructo de vimentina resistente a la presencia continua de los oligómeros de morfolino. Después de la precipitación, vimentina fue enérgicamente re-expresa en las células (WB, Figura 3C); las células fueron tratadas con WFA o DMSO como control y se sometieron a análisis de Anexina V /FACS. Similar a los resultados de siRNA desmontables, el tratamiento oligómeros de morfolino anti-vimentina bloqueado significativamente la apoptosis inducida por WFA. Re-expresión de vimentina restaurado sensibilidad SKLMS1 a WFA (Figura 3C).

Tanto las células STS y células mesenquimales normales expresan vimentina. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2, WFA induce más significativos efectos pro-apoptóticos en células STS en comparación con las células normales mesenquimales (es decir, fibroblastos y células musculares). Los anteriores datos publicados anteriormente descritos (30) identificó WFA se unan a la vimentina tetramérica, soluble. Por lo tanto, tratamos de evaluar los niveles de esta fracción vimentina en células normales frente a STS. Como se muestra en la figura 3D, las células tumorales expresan niveles significativamente más altos de soluble, vimentina libre en comparación con células mesenquimales normales. Este hallazgo ofrece una posible explicación para nuestros efectos WFA diferenciales observados.

inducida por la degradación WFA vimentina es dependiente de caspasa
degradación
vimentina comúnmente se produce a través de la activación de la ruta de la caspasa. Para evaluar si la degradación inducida por la WFA vimentina es un resultado de la escisión de la caspasa, pretratados con STS Z-VAD (Promega, Madison, WI), un inhibidor de pan-caspasa, antes de la terapia WFA (durante 24 horas). Z-VAD pretratamiento dio lugar a disminución de la degradación vimentina en combinación con menores niveles de tanto la caspasa-3 y PARP activada escindido (Figura 4A). Además, Z-VAD pretratamiento abrogada significativamente la apoptosis inducida por WFA (después de 24 h de tratamiento WFA) en células STS (Figura 4B). A continuación, después de la caída vimentina utilizando oligonucleótidos de morfolino, se transfectaron células SKLMS1 para expresar ya sea vimentina de tipo salvaje o mutado vimentina en los sitios de escisión de caspasa (D85N y D259N). WFA (1 M) indujo la apoptosis en células marcada vimentina transfectadas de tipo salvaje en los que se observaron degradación vimentina y activación de la caspasa-3 (Figura 4C). Sin embargo, se observó una disminución significativa de la apoptosis inducida por WFA en células que expresan la vimentina mutado, y hemos observado una disminución dramática en tanto la degradación vimentina y activación de la caspasa-3 (Figura 4C). Tomados en conjunto, estos datos sugieren un posible círculo vicioso inducida por la WFA, en el que la unión al WFA vimentina provoca su degradación por las caspasas y dijo degradación da lugar a la activación de caspasas y apoptosis adicional.


A)
Pretreatement (4 h) de las células SKLMS1 con resultados en la disminución inducida por la WFA (24 h) la degradación de vimentina en conjunción con los niveles más bajos de ambos PARP exfoliados caspasa-3 y activado Z-VAD (un inhibidor pan-caspasa);
B)
Z-VAD (4 h) tratamiento previo abroga significativamente inducida por WFA 24 h) la apoptosis (en las células SKLMS1;
C)
vimentina derribado se transfectaron células SKLMS1 para expresar ya sea vimentina de tipo salvaje o mutado vimentina en los sitios de escisión de caspasa (D85N y D259N). WFA (1 M /24 hr) induce la apoptosis en células marcada vimentina transfectadas de tipo salvaje en el que se pueden detectar degradación vimentina y activación de la caspasa-3 (WB). Sin embargo, una disminución significativa de la apoptosis inducida por WFA en células que expresan la vimentina mutado, se observa, así como una disminución en la degradación tanto vimentina y activación de la caspasa-3. (WT = tipo salvaje Vim vimentina; Mut Vim = vimentina mutado; Vim FL = longitud completa vimentina; productos de degradación VDP = vimentina) guía empresas
inducida por WFA desregulaciones moleculares son, al menos en parte, mediados por la vimentina

se han propuesto varios mecanismos moleculares previamente que la base de WFA efectos anti-tumorigénicos incluida la inhibición de la fosforilación de AKT [27], la derogación de la función de NF-kappa B [20], [31], y la inhibición directa proteosomal [21] . En primer lugar, tratamos de evaluar si estas desregulaciones moleculares se producen en las células STS en respuesta al tratamiento WFA. Se observó una relación dosis-WFA y la disminución dependiente del tiempo en los niveles de pAKT, pero no los niveles totales de AKT, en células de STS (Figura 5A). Del mismo modo, una disminución dependiente de la dosis en NF-kappa B (p65) también se demostró, a pesar de esta disminución se produjo sólo después de 24 h de tratamiento. la actividad de NF-kappa B, por otra parte, ha demostrado ser inhibido temprano después del tratamiento, mecanismos distintos de la disminución de la expresión de proteína NF-kappa B que afecta a la actividad de NF-kappa B sugiere. Además, se encontró una dosis marcada y la acumulación dependiente del tiempo de ubiquitinated proteínas, el apoyo a la inhibición inducida por proteosomal WFA en estas células.


A)
tratamiento WFA induce una dosis y del tiempo - disminución dependiente de pAKT sin efecto en AKT total. Del mismo modo, una disminución dependiente de la dosis en la expresión de proteínas NF-kappa B (p65) también se ve, aunque esta disminución se produce sólo después de 24 h de tratamiento. la actividad de NF-kB en las células PLS1, como se representa en gráficos que representan los resultados de ensayo de luciferasa reportero, se muestra que se inhibe temprano después del tratamiento (4 h). También se muestra una marcada dosis y la acumulación dependiente del tiempo de ubiquitinated proteínas;
B)
vimentina caída en células SKLMS1 abroga WFA (2,5 M /24 h) inducida por la inhibición pAKT, NF-kB disminución de proteínas, y el aumento de los niveles de ubiquitinación de proteínas. Del mismo modo, los bloques vimentina desmontables WFA (1 M /4 h) inducida por la disminución en la actividad de NF-kB. Los gráficos representan la media de tres experimentos repetidos ± SD.

Nuestros resultados sugieren un papel fundamental para la vimentina en respuesta de las células a la WFA. Por lo tanto, tratamos de evaluar si los efectos de la WFA en estas diversas vías pueden, al menos en parte, estar mediadas a través de la vimentina. células SKLMS1 fueron transfectadas transitoriamente con siARN anti-vimentina o no la orientación siRNA y luego tratados con WFA. desmontables vimentina abrogada WFA inducida por la inhibición pAKT, NF-kB disminución de proteínas y la actividad de bloqueo, y el aumento de los niveles de ubiquitinación de proteínas (Figura 5B). Estos experimentos proporcionan evidencia adicional de que los efectos de la WFA están mediadas a través de vimentina y ponen de relieve nuevas funciones potenciales vimentina.

WFA induce la apoptosis en células endoteliales cultivadas en medios STS acondicionado

Análogo a tumores malignos sólidos, STS consisten tanto en células normales y tumorales asociadas con el tumor; STS crecimiento, la migración y difusión dependen de la diafonía entre estos dos compartimentos. STS son por lo general altamente vascular y la angiogénesis, lo que resulta en un mayor potencial metastásico. Los datos anteriores sugieren que podría albergar WFA propiedades antiangiogénicas [17], [30]. Para ampliar aún más estas observaciones iniciales y evaluar los posibles efectos antiangiogénicos de la WFA en el contexto del microambiente STS, se evaluó el efecto de la WFA en células endoteliales cultivadas en medio de controles periódicos (que carecen de factores angiogénicos, imitando las células endoteliales quiescentes) y en las células endoteliales cultivaron en medio STS acondicionado (CM; imitando la proliferación de células endoteliales angiogénicas). Se utilizó tanto endoteliales humanas (HDMEC) y las células endoteliales murinas (LEC) y observó una inhibición del crecimiento inducida por la WFA significativamente mayor en las células endoteliales cultivadas en STS-CM que en medio de control (media ± DE WFA IC
50: 0,42 M ± 0,16 vs. 1,4 M ± 0,04 en HDMEC y 0,38 M ± 0,09 vs. 2,3 M ± 0,1 en LEC; P & lt; 0,05, Figura 6A). Del mismo modo, WFA indujo mayores niveles de apoptosis en células endoteliales cultivadas en STS-CM que en medio de control (Figura 6B).


A)
una tasa significativamente mayor de inducida por la WFA (24 h inhibición del crecimiento) se observa en las células endoteliales (células endoteliales de los microvasos-HDMEC dérmicos humanos y endoteliales de pulmón murino células LEC) cultivadas en STS medio condicionado (CM) que en medio de control regular (RM);
B)
WFA (1 M /24 hr) induce mayores niveles de apoptosis en las células endoteliales cultivadas en STS-CM que en medio de control;
C)
WFA (1 M /24 h) induce tasas significativamente mayores de la degradación vimentina y activación de la caspasa-3 en las células endoteliales cultivadas en STS-CM que en las células endoteliales quiescentes;
D)
WFA (1 M) abroga la migración y la invasión de las células endoteliales cultivadas en STS-CM;
E)
WFA (2 mg /kg) se traduce en una disminución significativa en el número medio de CD31-positivo (rojo) los vasos sanguíneos en comparación con el tratamiento control DMSO en un
in vivo
ensayo de espuma de gel en . CD-31 (rojo) /TUNEL (verde) doble tinción revela la apoptosis de las células endoteliales en los ratones tratados con WFA. Los gráficos representan la media de tres experimentos repetidos ± SD. (Vim FL = longitud completa vimentina; VDP productos de degradación = vimentina) guía empresas
Las células endoteliales son de origen mesenquimal y por lo tanto expresan vimentina, por lo que se evaluó el efecto de la WFA en la expresión de vimentina y la escisión en ambos medios regulares y STS-CM. Curiosamente, WFA indujo tasas significativamente mayores de degradación vimentina y activación de la caspasa-3 en células endoteliales cultivadas en STS-CM que en las células endoteliales quiescentes (Figura 6C). A continuación, se evaluó el efecto de la WFA en la migración de células endoteliales y la invasión. Al igual que en el método experimental descrito previamente utilizado con células STS, se utilizaron células endoteliales viables pretratadas con corto plazo WFA (4 h) en ensayos de cámara de Boyden modificadas. Como se preveía, STS-CM mejorada migración de células endoteliales y la invasión. Más importante, WFA migración y la invasión de las células endoteliales cultivadas en STS-CM, pero no abrogó el de las cultivadas en un medio normal (Figura 6D).

Por último, para confirmar que se produce el efecto observado antiangiogénico WFA
in vivo
así, se realizó un ensayo de Gelfoam esponjas de Gelfoam angiogénesis se incubaron en la misión STS-CM y se implantaron subcutáneamente en los flancos de ratones SCID. Dos días después de la implantación, los ratones fueron tratados con inyecciones i.p. WFA (2 mg /kg; n = 4) o DMSO (n = 4) durante 10 días consecutivos; a la terminación del estudio, los Gelfoams se extirparon y se sometieron a análisis de IHC (Figura 6E). tratamiento WFA resultó en una disminución significativa en el número medio de vasos sanguíneos CD31-positivas en comparación con el tratamiento de control DMSO (41 ± 7,2 vs. 6 ± 5,3, respectivamente; P & lt; 0,05). CD-31 /TUNEL doble tinción reveló la apoptosis de las células endoteliales en los ratones tratados con WFA. Estos resultados sugieren que WFA potencialmente abroga el crecimiento celular, inhibe la migración y la invasión, e induce la apoptosis en células endoteliales en proliferación en el microambiente STS.

sensibilidad epiteliales de origen cánceres 'a WFA es mayor en células que muestran transición epitelial a mesenquimal ( EMT)

Nuestra hipótesis central es que se espera que las células que expresan vimentina para demostrar una mayor sensibilidad WFA. A diferencia de STS, los cánceres de origen epitelial más comunes no expresan naturalmente vimentina. Sin embargo, los datos sustanciales indican que tanto la invasión y la metástasis pueden depender fundamentalmente de la adquisición de un fenotipo "mesenquimales" por la célula de cáncer incipiente [32], [33], [34]. Una de las características de esta transición epitelial a mesenquimal, se induce la expresión de vimentina. Teniendo en cuenta esto, analizamos la expresión de vimentina en un panel de líneas celulares de carcinoma y se evaluó su respuesta a la WFA. Tres de las células (MCF7, HT29, y TMK1) exhibió ninguna expresión de ARNm de vimentina y proteína, y los otros dos (MDA231 y A549) expresaron vimentina (Figura 7A). Las células que expresan vimentina fueron significativamente más sensibles a la WFA que aquellos que no expresan vimentina (Media ± WFA IC
50 valores de las celdas MDA231 y A549 fueron de 1,3 M ± 0,42 y 1,8 M ± 0,37, respectivamente, y 2,9 M ± 0,31, 7,8 M ± 2,34, 3,1 ± 0,18 M en las células MCF-7 TMK1, HT29, y, respectivamente; P & lt; 0,05). Del mismo modo, WFA (1 M durante 24 h) provocó una tasa de apoptosis significativamente mayor en las células de carcinoma que expresan vimentina (P & lt; 0,05; Figura 7B). análisis WB reveló además productos de degradación de vimentina en MDA231 células en combinación con los niveles de caspasa-3 y PARP de expresión activado escindidos mejoradas (Figura 7C). En contraste, sólo una mínima o ninguna expresión de PARP escindida de caspasa-3 activada y se demostró en células MCF7 y HT29, respectivamente. Los datos presentados aquí apoyan aún más el papel de la vimentina como una diana molecular WFA, lo que sugiere la posible eficacia terapéutica de la WFA en cánceres epiteliales que exhiben fenotipos EMT.


A)
inducidas por WFA corresponde inhibición del crecimiento al nivel de expresión de vimentina en células de cáncer de origen epitelial;
B)
WFA (1 M durante 24 h) produce una tasa de apoptosis significativamente mayor en las células de carcinoma que expresan vimentina;
C)
WB análisis que demuestra la degradación de las células MDA231 vimentina en conjunción con los niveles de caspasa-3 y PARP expresión activada escindidos mejoradas.

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