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PLOS ONE: La zarzaparrilla (Smilax glabra rizoma) el extracto inhibe la migración y la invasión de células cancerosas mediante la supresión de TGF-β1


Extracto

La zarzaparrilla, también conocido como
Smilax glabra
Rizoma (SGR), se demostró que modular la inmunidad, proteger contra la lesión hepática, disminuir la glucosa en sangre y suprimir el cáncer. Sin embargo, sus efectos sobre la adhesión de células de cáncer, la migración y la invasión no estaban claros. En el presente estudio, se encontró que el sobrenadante del extracto soluble en agua de SGR (SW) podría favorecer la adhesión, inhibir la migración y la invasión de HepG2, MDA-MB-231 y las células T24
in vitro
, así como metástasis de supresión de las células MDA-MB-231
in vivo
. Resultados de F-actina y vinculina de doble tinción mostraron la adhesión focal mayor en las células tratadas con SW. el análisis de microarrays indica una represión de la señalización de TGF-β1 por tratamiento SW, que fue verificada por tiempo real de RT-PCR de los genes y la inmunotransferencia de proteínas TGFBR1 relacionadas con el TGF-β1. SW También se demostró que antagonizar la migración celular promovida por el TGF-β1. En conjunto, nuestro estudio revela una nueva función antitumoral de zarzaparrilla para contrarrestar la invasión de un subconjunto de células cancerosas mediante la inhibición de la señalización de TGF-β1

Visto:. Ella T, Zhao C, J Feng, Wang L, Qu L, colmillo K, et al. (2015) La zarzaparrilla (
Smilax glabra
Rizoma) el extracto inhibe la migración y la invasión de células cancerosas mediante la supresión de TGF-β1. PLoS ONE 10 (3): e0118287. doi: 10.1371 /journal.pone.0118287

Editor Académico: Jung weon Lee, de la Universidad Nacional de Seúl, Corea, República de

Recibido: 28 Junio, 2014; Aceptado: January 12, 2015; Publicado: 5 Marzo 2015

Derechos de Autor © 2015 Ella et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: datos de microarrays se sido depositado en el NCBI la Expresión génica Omnibus (GEO) (no la adhesión. GSE58201), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58201.

Financiación : la financiación fue proporcionada por el Programa Nacional de Investigación básica de China (2010CB529303, 2013CB910504), http://www.973.gov.cn/Default_3.aspx. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la zarzaparrilla, también conocidos como
Smilax glabra
Rizoma (SGR), es un suplemento dietético natural ampliamente utilizada en la alimentación de decisiones y el cuidado de la salud, sobre la base de su capacidad en desintoxicante, aliviar el calor y el alivio humedad [1,2]. Algunas bebidas que contienen SGR-, alimentos y suplementos dietéticos son adquiribles en el sudeste asiático y América del Norte. Los pacientes con dermatitis, la sífilis o la artritis gotosa en el sudeste de Asia se han beneficiado del tratamiento de la SGR que contienen mezclas de hierbas para una larga historia [3,4]. Actualmente también están creciendo las evidencias científicas que informaron su potencial terapéutico para el tratamiento de la artritis reumatoide [5], la inflamación [6], lesión hepática [1], la hiperinsulinemia [7] y el cáncer [8].

Las funciones de SGR se divide principalmente en cuatro aspectos, a saber, inmunomodulador, hepato-protector, tumoricida y otros. En el aspecto inmunomodulador, el extracto acuoso de SGR ejerce una marcada inhibición sobre cloruro de picrilo (PCL) - o las células rojas de la sangre de oveja (SRBC) inducida por hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) [6,9]. SGR actúa principalmente sobre la respuesta inmune celular (CIR), la fase efectora de DTH en lugar de la respuesta inmune humoral (HIR), confiriendo así SGR una ventaja superior a otros inmunosupresores en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del CIR mediada como la hepatitis y la artritis reumatoide [6,9 ]. Astilbina, uno de los compuestos bioactivos aislados de SGR, puede alterar la
in vivo
perfiles de citoquinas de los linfocitos y suprimir la migración de las células T activadas, por lo tanto aliviando la hipersensibilidad de contacto y DTH [10,11]. En el aspecto hepato-protector, astilbina facilita la apoptosis de los linfocitos T infiltrantes de hígado e inhibe la adhesión célula-matriz de esplenocitos para minimizar daños en el hígado [12,13]. Además, se podría mejorar la función hepática mediante la inversión de elevación de las transaminasas, la reducción de la producción de TNF-α y la reducción de la hepatotoxicidad de las células no parenquimatosas [12,14]. Taxifolina, otro compuesto aislado de SGR, se encontró que cambiar el metabolismo de lípidos para aliviar la carga de hígado [15,16]. La función de SGR también se extiende a otras funciones biológicas, incluyendo la represión de Helicobacter pylori actividad [17], la reducción de la glucosa en la sangre [2] y la reducción de la actividad del VIH-1 integrasa [18]. Todos estos hallazgos apuntan a la potencial multifuncional de la SGR.

En el aspecto contra el cáncer, se encontró que la ingesta de una fórmula a base de hierbas que contiene SGR para extender el tiempo sostenido para aliviar el dolor, mejorar la calidad de vida del paciente y prolongar largo supervivencia a largo plazo de los pacientes con carcinoma hepático [19]. Otra inyección que contiene SGR-fue descubierto para disminuir el crecimiento tumoral a dosis relativamente altas en modelos de ratones [20]. Se encontraron los extractos de las SGR para promover la apoptosis en el cáncer hepático humano HepG2 y células HepG3 [8,21] cáncer colorrectal humano HT-29,. También hay varios indicios que indican las posibles funciones de SGR en el control de la adhesión celular y la migración. Astilbina puede suprimir la adhesión de esplenocitos a la matriz extracelular en modelos de ratones con lesión de hígado [14], y bloquear la adhesión intercelular entre las células Jurkat T humanas y ECV-304 células [13]. Además, el ácido 5-O-caffeoylshikimic, taxifolina y astilbina de SGR inhibieron la migración y adhesión de los macrófagos [22]. No obstante, el papel directo de extracto de SGR en la invasividad de las células cancerosas no está clara y la base mecánica es insuficiente. En el presente estudio, se evaluaron los efectos del sobrenadante del extracto soluble en agua de SGR (SW) en la adhesión, migración e invasión de tres líneas celulares de cáncer, y exploramos el posible mecanismo.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

estudio en animales fue aprobado por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad de Pekín hospital Cancer & amp; Instituto y realizado a lo largo de las directrices de bienestar animal institucional establecidos concordantes con las directrices de los Estados Unidos (NIH Publication#85-23, revisada en 1985).

Materiales

Matrigel fue adquirido de BD Biosciences (San José, CALIFORNIA). Los anticuerpos para vinculina y TGFBRI se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y Bioworld (Beijing, China), respectivamente. TGF-β1 fue de Sigma-Aldrich.

Preparación de SGR extraer

SGR se obtuvieron de Ben Cao Yuan Colmillo Pharmaceutical Co. (Pekín, China). Los procedimientos para la preparación del sobrenadante de extracto soluble en agua de SGR (SW) se han descrito anteriormente [23]. El porcentaje de rendimiento de SW fue 7,27% (g /g). El disolvente para la preparación de SW (solución madre) fue del 3% de DMSO en PBS, y el DMSO en la solución del SW de trabajo fue inferior al 0,15% (v /v).

Cultivo de células

se obtuvieron HepG2, MDA-MB-231 y T24 células de ATCC (Rockville, MD) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) más 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Todos los reactivos para el cultivo se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA).

adhesión celular ensayo

Las células se sembraron en placas de 6 cm y se cultivaron con medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS ). Matrigel fue de 1: 100 diluidos con medio RPMI 1640 libre de suero y agregados en placa de 96 pocillos para permitir a la capa durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, las células se tripsinizaron y se recogió en medio libre de suero suplementado con dosis indicadas de SW. Después de fármaco pre-tratamiento para 15 min (para las células T24) o 30 min (para las células MDA-MB-231 y HepG2), la suspensión celular fue luego complementado con 0,5% de FBS antes de ser sembradas en placas de 96 pocillos matrigel pre-recubierto a la densidad de 2 × 10
4 por pocillo y se dejaron adherir durante 2 h. Después de eliminar las células no adherentes por PBS, las células adherentes se fotografiaron con el sistema CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Nueve campos microscópicos de cada pocillo fueron capturados al azar y las células se contaron usando software Image Pro Plus.

Transwell migración /invasión de ensayo

Para el ensayo de la migración, las células fueron sembradas en placas de 10 cm. Al día siguiente, se recogieron las células en medio libre de suero y se divide en tres partes iguales. Después de cada parte se complementó con dosis indicadas de SW, se añadió un medio de suspensión de células en el pocillo superior del inserto Transwell (Corning Inc, Corning, NY) a la densidad de 1 x 10
4 (para las células T24 y HepG2 ) o 5 × 10
3 (para células MDA-MB-231) por pocillo. El pocillo inferior se añadió con RPMI 1640 que contiene 10% de medio FBS como atractores quimiotácticos. La mitad restante de suspensión de células se siembran a continuación en placas de 96 pocillos para el ensayo de viabilidad. Después de la incubación de 12 h de, las células que han penetrado en el lado inferior de la membrana transwell se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron bajo el microscopio. 14 campos microscópicos fueron capturados y se contaron al azar. Para evaluar el efecto de TGF-β1 en la migración de células, las células se mueren de inanición con RPMI 1640 que contenía 0,5% de FBS durante 24 h y luego se recogieron por tripsinización. La suspensión celular se divide en cuatro partes iguales y cada parte se complementó con disolvente, 5 ng /ml de TGF-β1, 1,5 g /l SW SW o más TGF-β1. Después de la adición de medio de suspensión celular que contiene el fármaco en el pocillo superior de transwell inserto, se añadió la suspensión celular restante en placas de 96 pocillos. Ambas placas se incubaron durante 12 h. Las placas Transwell fueron utilizados para el ensayo de migración y las placas de 96 pocillos para el ensayo de la viabilidad celular. Para el ensayo de invasión, una capa de matrigel (dilución 1: 4 en medio libre de suero) fue pre-recubierto en el pozo superior de transwell inserto antes de la adición de las células, y las células se incubaron durante 36 h antes de la tinción con cristal violeta. Los procedimientos de descanso fueron los mismos que ensayo de migración.

herida de la célula de ensayo de curación

Dos líneas paralelas se dibujan en la parte posterior de las placas de 12 pocillos con un rotulador antes de la siembra de células. Al día siguiente, el medio de cultivo se retiró y se reemplazó por 0,5% de FBS /RPMI 1640 medio. 24 horas más tarde, una línea recta que la herida era perpendicular a las líneas paralelas se dibuja a través de la capa de células vinculada con puntas de pipeta. Por lo tanto, se marcó la brecha de la herida entre dos líneas paralelas. Después de retirar las células flotantes con PBS, se añadieron indicaron dosis de SW en cada pocillo. Se tomaron fotos de la brecha marcada cada 6-8 h hasta que la herida se cerró. Las lagunas de la herida se cuantificaron por medios digitales utilizando software Image Pro Plus.

Animal modelo

7 a 8 semanas de edad, hembra /ratones Balb c desnudos (Vital River Laboratories, Pekín, China) eran inyectado a través de la vena de la cola con 1 x 10
6 MDA-MB-231 células. Al día siguiente, los ratones (n = 8 para cada grupo) se administraron por vía oral con 72,7 mg SW (preparado en PBS, es igual a 1 g de SGR) o PBS por día. Después de dos semanas, los ratones se mantuvieron durante otras 3 semanas antes de ser sacrificado por los pulmones y la recolección de hígado. Hematoxilina y eosina (H & amp; E). La tinción se utilizan para controlar y contar focos metastásicos en el pulmón o el hígado

Medición de la proliferación celular

Las células tratadas con SW o disolvente se sembraron en 96 pocillos placas y se incuba. tasa de confluencia celular se cuantificó usando el sistema de CloneSelect Imager.

Western blot

Las células expuestas a SW para los tiempos indicados se recogieron en tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), NaCl 150 mM , 2 mM EDTA, 1% SDS, ditiotreitol 2 mM (DTT) y 1 × proteasa cóctel inhibidor (Roche, Mannhelm, Alemania) y después se sonicaron durante 30 s en hielo. La concentración de proteína se determinó mediante kit de BCA (Pierce, Rockford, IL). Los lisados ​​celulares (30 g por muestra) se separaron en 8% -15% de SDS-PAGE antes de ser electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con 5% de leche sin grasa en 0,1% de Tween 20 /TBS (TBST), las membranas se sondearon con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C y luego se volvieron a sondar con anticuerpos secundarios marcados con HRP durante 45 min a temperatura ambiente (RT). Las señales se detectaron mediante un sistema de quimioluminiscencia mejorada de Pierce (Rockford, IL).

inmunofluorescencia

Las células se sembraron en cubreobjetos esterilizados. , Se añadió día siguiente SW y las células se incubaron durante el tiempo indicado. Al final del experimento, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 20 min a RT antes de ser permeabilizadas con 0,1% Triton-X-100 en PBS durante 4 min. Después de bloquear con 5% de BSA /PBS durante 1 h, las células se incubaron con anticuerpo anti-vinculina (1: 100) durante la noche a 4 ° C y mezclas de entonces TRITC-anti-ratón conjugado segundo anticuerpo y con faloidina marcada con FITC (Sigma) durante 1 h a TA. Los núcleos se tiñeron con DAPI antes de capturar imágenes a través de Leica TCS SP5 microscopio confocal láser.

Análisis de adhesión focal

La intensidad de la señal de vinculina y el área de adhesión focal se analizaron mediante Adobe Photoshop CS5 y el software Image Pro Plus. En primer lugar, las imágenes teñidas con Vinculina se de-saturado, se invierte y des-divulgadas usando el software Photoshop para producir huellas de adhesión. A continuación, estas huellas que contiene vinculina-se seleccionaron adicionalmente por umbralización en Image Pro Plus software. A través de la calibración, el área y la intensidad de las huellas que contiene vinculin-se cuantificó usando el comando "recuento /tamaño". Un total de 50 células fueron analizados en cada grupo.

Análisis de microarrays y en tiempo real de RT-PCR

Se extrajo ARN de las células HepG2 tratadas con SW (1,5 g /l) utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) y se sintetizó ADNc utilizando el sistema de la transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI). Perfiles de expresión génica fueron examinados por Shanghai Corporación de Biotecnología (Shanghai, China) utilizando microarrays de Affymetrix 1.0st gen humano. los datos de microarrays se ha depositado en el NCBI la Expresión Génica Omnibus (GEO) (no la adhesión. GSE58201). Después robusta gama Multi-Media de normalización (RMA),
P
valor & lt; 0,05 y el umbral & gt veces de cambio; 1.5, se identificaron como alteraciones estadísticamente significativas. KEGG, GO y Gene Tarjetas (http://www.genecards.org/) se utilizaron para seleccionar a cabo los genes que se relacionan con la adhesión celular, la migración y la invasión. A continuación, estos genes se pusieron en la base de datos STRING para la señalización de búsqueda vía. Real-time RT-PCR se utilizó para validar los resultados de los microarrays y llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SYBR, TOYOBO). Los niveles de expresión de todos los genes se normalizaron a través de
GAPDH
gen y la 2
-ΔΔCT método se utilizó para calcular la expresión génica relativa. Los cebadores para tiempo real RT-PCR (
TGFBR1
, adelante, 5'-CCTGGGATTTATAGCAGCAGAC-3 ', inversa, 5'-TGACACCAACCAGAGCTGAG-3';
NTS
, hacia adelante, 5 ' -ATTAGTAAAGCACATGTTCC-3 ', inversa, 5'-CTCCCAGTGTTGAAAAGCCC-3';
ID1
, adelante, 5'-GAGCTGAACTCGGAATCCGAAG-3 ', inversa, 5'-GATCGTCCGCAGGAACGCATGC-3';
ID2
, adelante, 5'-TCAGCCTGCATCACCAGAGA-3 ', inversa, 5'-CTGCAAGGACAGGATGCTGATA-3';
ID3
, adelante, 5'-CTGAGCTTGCTGGACGACA-3 ', inversa, 5'-ATGTAGTCGATGACGCGCTGTA-3') fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, china).

El análisis estadístico

El análisis de datos se realizó con el programa SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). prueba de la t de Student de dos colas y ANOVA se utilizaron para determinar la significación de las diferencias entre los diferentes grupos experimentales.

Resultados

SW aumenta la adhesión celular

Para probar el efecto de SW en la capacidad de las células cancerosas para unirse a la matriz extracelular, se realizó ensayo de adhesión celular usando la línea celular de hepatoma HepG2 (Fig. 1A), línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 (Fig. 1B) y la línea celular de cáncer de vejiga T24 (Fig. 1C). Se encontró que la adhesión de células HepG2 a matrigel se incrementó en 0,7 g /l de SW (Fig. 1A), mientras que el efecto de misma concentración de SW en la adhesión de células MDA-MB-231 fue marginal (Fig. 1B) . Por el contrario, el aumento de la adherencia fue más evidente en las células T24 y la adhesión más alta se consigue por un precio tan bajo como 0,07 mg /l de SW (Fig 1C).

paneles de la izquierda:. HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) y las células T24 (C) se trataron previamente con dosis indicadas de SW para 15 o 30 min antes de la siembra en los pocillos matrigel recubierto, y 2 h más tarde, se contaron las células adheridas después de retirar las células flotantes por PBS. Se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 200 micras. paneles de la derecha: la cuantificación de los datos en el panel de la izquierda, se muestran los resultados fueron compuestas de tres experimentos de forma independiente con triplicado. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur.

SW inhibe la migración de células de cáncer

A continuación, se realizó un
in vitro
ensayo de cero en. Las células se pre-incubaron en medio FBS al 0,5% durante 24 h antes de la introducción de cero con el fin de excluir el impacto de la FBS sobre la proliferación celular. La cicatrización de la herida se controló a intervalos regulares hasta que se cerró. Hemos observado que SW llevó a una ralentización de la migración en HepG2, MDA-MB-231 y las células T24 (Fig. 2A, B y C), con células MDA-MB-231 que muestra el efecto inhibidor más evidente (Fig. 2B ). Nos dimos cuenta de que requiere un tiempo diferente para diferentes líneas de células para curar las heridas. Además, la misma concentración de SW exhibió distinta inhibición de la cicatrización de heridas en diferentes líneas celulares. Esto podría explicarse por la especificidad linaje celular en la migración. Teniendo en cuenta la rugosidad y la subjetividad del ensayo cero, que también se utiliza transwell ensayo de migración. Las células que tuvieron éxito en exprimir a través de los micro-orificios de la membrana de base en el grupo de SW-tratados fueron marcadamente inferiores a las de grupo de control (Fig. 3A, B y C, los paneles izquierdo y medio), con poca influencia sobre la viabilidad celular (Fig. 3A, B y C, paneles de la derecha). Estos resultados apuntan a la acción inhibitoria de SW en la migración de células de cáncer.


in vitro
ensayo de rayado se utiliza para evaluar el efecto de SW en la migración de las células HepG2 (A), MDA-MB -231 (B) y T24 células (C). Imágenes representativas se muestran en el panel izquierdo; cuantificación de los datos en el panel de la izquierda se muestra en el panel derecho, se muestra estaban compuestas resultados de tres experimentos de forma independiente con muestras paralelas por triplicado. El índice de migración representa la velocidad de migración en relación con el grupo control. Columnas, significan; barras, SD.

HepG2 (A), las células T24 (B) y MDA-MB-231 (C) se sembraron en el inserto transwell en presencia de dosis indicadas de SW para 12 h. Las células que llegan a la parte inferior de la membrana Transwell fueron teñidas e imágenes representativas se muestran en el panel superior. Barra de escala, 200 micras. Los datos de panel de la izquierda se cuantificaron y se muestran en el panel central, y la viabilidad celular se reflejó en la tasa confluencia de células en el panel derecho. Mostrados han sido compuestas resultados de dos experimentos de forma independiente. Columnas, significan; bares, SD; NS: no significativo estadísticamente.

SW inhibe la invasión de células de cáncer de
in vitro
y metástasis
in vivo

También probamos el efecto de SW en la invasión de células cancerosas. Sin embargo, se utilizó el mismo dispositivo transwell más la carga de una capa de matrigel sobre la membrana base. Como era de esperar, el tratamiento SW impidió las tres líneas celulares de invadir a través de la matrigel para llegar a la parte inferior de la membrana base (Fig. 4A, panel superior y el panel inferior izquierdo). Además, 36 h de exposición a las dosis indicadas de SW ejerce inhibición insignificante sobre la proliferación celular (Fig. 4A, panel inferior derecho). A fin de evaluar el efecto de SW sobre la metástasis
in vivo
, se utilizó MDA-MB-231 modelo de ratón metastásico. Como se muestra en la Fig. 4B, la administración oral de SW para 2 semanas disminuyó notablemente el número de focos metastásicos de pulmón. No se observaron focos metastásicos hepáticos en ambos grupos (S1 Fig.) guía
(A) Las cámaras transwell se pre-recubrieron con 60 l de dilución matrigel (1: 4 en medio libre de suero). antes de la siembra de células. Las células se incubaron con dosis indicadas de SW para 36 h antes de la tinción. Imágenes representativas se muestran en el panel superior. Barra de escala, 200 micras. Los datos de la migración y la viabilidad celular se cuantificó y se muestran, respectivamente, en el panel inferior, muestra fueron compuestas resultados de dos experimentos de forma independiente con triplicado. Columnas, significan; bares, SD; NS, no estadísticamente significativa. (B) Panel izquierdo: imágenes representativas de H & amp; E tejidos del pulmón teñidas en PBS y el grupo tratado con SW. pulmones embebidos en parafina se seccionaron en intervalos y & gt 30-M; 10 células cancerosas MDA-MB-231 fueron identificados como focos metastásicos. Magnificación, 4 × (superior) y 20 × (inferior). Panel derecho: cuantificación de focos metastásicos de pulmón en PBS y SW-grupo tratado con ratones (n = 8 para cada grupo). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur.

SW aumenta la adhesión focal

Se informó de que el número y tamaño de las adhesiones focales fueron inversamente proporcional a la velocidad de migración [24]. Para ello se realizó la tinción fluorescente dual de F-actina y vinculina para evaluar el efecto, si lo hay, de SGR en la adhesión focal [20,24,25]. Después de la exposición a SW durante 0,5 h, las células HepG2 y T24 comenzaron a exhibir la señal más fuerte vinculina principalmente alrededor de la periferia de la célula, que muestra una forma de fascículos o similar a detectar similar (Fig. 5A). En consecuencia, las fibras de estrés grandes de todo el cuerpo de la célula se perdieron, con fibras de actina F desplazando gradualmente hacia la periferia celular y la co-localización de allí con vinculina también. Se cuantificaron las áreas e intensidades fluorescentes de sitios de adhesión. Como se muestra en la Fig. 5B, el área de adhesión por célula elevado en 0.5 h y alcanzó meseta a 1 h en células HepG2 SW-tratada, mientras que ya logra pico a 0,5 h después del tratamiento SW en células T24. Se obtuvieron resultados similares en la intensidad de cuantificación (Fig. 5C).

células (A) HepG2 y T24 fueron tratados con SW (3,5 g /l) durante los tiempos indicados y luego inmuno-teñidas con F-actina (FITC -phalloidin) y vinculina (rojo). Los núcleos se counterstained por DAPI (azul). Se muestran imágenes representativas. Barra de escala, 100 micras. (B) La zona de sitios de adhesión por célula (donde F-actina y se fusionaron vinculina). Se muestran los resultados fueron compuestas de dos experimentos de forma independiente (n = 50 células). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. (C) La intensidad de fluorescencia de vinculina en los parches de adhesión por célula. Se muestran los resultados fueron compuestas de dos experimentos de forma independiente (n = 50 células). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur.

SW antagonizar inducida por TGF-β1 sobre regulación de genes relacionados con la capacidad de invasión

Para obtener una comprensión más profunda de la posible mecanismo que subyace a todos estos resultados, se realizó un análisis de microarrays de expresión génica con células HepG2 tratadas con SW. Encontramos había 118 genes con más de 1,5 veces el cambio de expresión en las células tratadas con SW, algunos de ellos estaban relacionados con la motilidad celular, el metabolismo y el estrés oxidativo (Fig. 6A). A continuación, analizamos un subconjunto de genes asociados con la invasión de células usando la base de datos de cadena. Como se muestra en la Fig. 6B, la mayoría de estos 12 genes fueron directa o indirectamente regulada por la vía de TGF-β1, lo que indica que la vía TGF-β1 podría estar involucrado en fenotipos SW-regulado. Real-time RT-PCR se realizó con los niveles de expresión de los genes evaluados de 5, es decir,
TGFBR1
,
NTS
,
ID1
,
ID2
, y
ID3 Hoteles en células HepG2 y T24 tratadas con TGF-β1 con o sin SW. SW sola disminución de los niveles de
NTS
,
ID1
,
ID2
, y
ID3 Hoteles en células HepG2 y
TGFBR1
,
NTS
,
ID1
, y
ID2
en células T24. Por otra parte, el TGF-β1 significativamente elevados niveles de mRNA de estos genes en ambas líneas celulares (Fig. 6C), confirmando que estos genes son aguas abajo de la señalización de TGF-β1. Sin embargo incremento, inducido por el TGF-β1 mayoría de la expresión génica fue contrarrestado por el tratamiento concomitante con SW, a excepción de
ID1 Hoteles en células HepG2 (Fig. 6C). Además, observamos los niveles de proteína hasta reguladas de TGFBR1 en las células HepG2 y T24 tratadas con TGF-β1, que fue revertida por SW (Fig. 6D). Para confirmar aún más el efecto inhibidor de SW en la señalización de TGF-β1, se evaluó el efecto de SW sobre la migración inducida por TGF-β1. Como se muestra en la Fig. 7, la migración promovida TGF-β1-fue marcadamente abrogada por SW en HepG2, MDA-MB-231 y las células T24, mientras que la viabilidad celular no se vio afectada por SW (Fig. 7A, B y C).

(A ) el mapa de calor de enriquecimiento funcional de genes expresados ​​differentialy a partir del resultado de chips HepG2. Cluster 3.0 y el software TreeView se utilizaron para generar el mapa de calor. Rojo: la regulación frente a significar; verde: regulación a la baja frente a significar. (B) La red de regulación entre los genes relacionados con la adherencia, la migración y la invasión en (A) usando la base de datos de cadena. (C) en tiempo real de verificación de RT-PCR de los genes en HepG2 y células T24 tratadas con TGF-β1 con o sin SW. Mostrados han sido compuestas resultados de tres experimentos de forma independiente con triplicado. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. (D) Efecto de SW en TGF-β1 inducida por la sobre regulación de TGFBR1 se evaluó por inmunotransferencia. Mostrados han sido los resultados representativos de 3 experimentos independientes.

HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) y las células T24 (C) se sembraron en los insertos transwell en presencia de TGF-β1 además SW. 12 h después, las células se tiñeron y se imaginó. Imágenes representativas se muestran en el panel izquierdo. Barra de escala, 100 micras. Los datos de la migración se cuantificaron y se muestran en el panel central. La viabilidad celular se refleja en la tasa confluencia de células en el panel derecho. Se muestran los resultados fueron compuestas de dos experimentos de forma independiente con triplicado. Columnas, significan; bares, SD; NS: no significativo estadísticamente.

Discusión

SGR, también conocida como zarzaparrilla, se informó a mostrar potencial contra el cáncer [8,21]. Varios SGR que contienen fórmulas a base de hierbas utilizados en el sudeste asiático se ha demostrado que inhibe el cáncer
in vitro
y
in vivo
[20,26]. La mayoría de los estudios anteriores se centraron en el efecto inhibidor de SGR en el crecimiento de células de cáncer, y sólo unos pocos evaluó su efecto sobre la invasividad de las células cancerosas. Una fórmula de hierbas que contiene SGR-fue mostrado para suprimir la metástasis de carcinoma de pulmón [27]. Los compuestos aislados de SGR, es decir, 5-O-caffeoylshikimic ácido, taxifolina y astilbina, demostraron tener efecto inhibidor sobre la adhesión y /o migración de células del sistema inmune [22]. En el estudio anterior, encontramos la inhibición del crecimiento celular de las SGR era un efecto relativamente a largo plazo (& gt; 24 h) en dosis altas [21]. En el presente estudio, hemos, por primera vez, informó el efecto inhibidor del extracto de SGR en la invasividad de las tres células de cáncer, probablemente a través de la supresión de la vía de TGF-β1. Se debe mencionar que todos los
in vitro
experimentos se realizaron con dosis bajas de SW dentro de corto plazo para reducir al mínimo el sesgo resultado de la inhibición del crecimiento inducida por SW.

adhesión focal es la estructura básica unidad de módulo de la adhesión celular, cualquier cambio en su estructura o composición podría influir en la fuerza de adhesión de las células en todo el [24,25]. La formación de adhesión focal pasa por varias etapas, incluyendo la adhesión naciente, complejo focal y la adhesión a continuación focal [25]. se informó el tamaño y la madurez de las adhesiones focales que se correlaciona inversamente con la velocidad de migración de las células [24]. En el presente estudio, se observó un cambio gradual de los parches de adherencia desde el cuerpo celular de perímetro celular en las células HepG2 y T24 SW-tratada, con fuerte señal vinculina y tamaño de adhesión más grande en la corteza celular. Este fenómeno era, al menos en parte, debido a un cambio espacio y dirigida al sitio de las proteínas relacionadas con la adhesión, sobre todo en células T24. adherencias periféricas grandes y firmes Curiosamente, inducidas por el SW se parecían a las quinasa de adhesión focal (FAK) células deficientes [25,28]. Además, las células que carecen de cualquiera de las fosfatasas de tirosina quinasas como SHP-2 o el Src también exhibió un patrón de adhesión similares [24,29]. Por lo tanto, un deterioro de la vía FAK-Src podría mediar este efecto SW-inducida, lo que requiere una mayor investigación.

El resultado indicó chip de una represión de la señalización de TGF-β1 en las células tratadas con SW. Los genes incluidos
HMOX1
[30,31],
PSAT1
[32],
TGFBR1
[33],
EDNRA
[34,35],
NTS
[36,37],
ID1
[38,39],
ID2
[40,41] y
ID3
[42,43 ], todos ellos relacionados con la adhesión celular, la migración y la invasión, o bien fueron reguladas directa o indirectamente por vía de señalización de TGF-β1. La inactivación de dominio quinasa de TGFBR1 podría prevenir la señalización de TGF-β1 se propague hacia abajo [33]. Mientras tanto, la derogación de la señalización de TGF-β1 utilizando TGFBR dominante negativa podría bloquear el interruptor de transición epitelio-mesenquimal (EMT)
in vivo
[44], lo que sugiere que la supresión de TGFBR podría proporcionar un medio viable para reprimir la señalización de TGF-β1 . En el presente estudio, inducida por TGF-β1 TGFBR1 fue disminuida por SW. Además, SW abrogada impulso inducida por TGF-β1 en la migración, confirmando el efecto inhibidor de SW en vía de TGF-β1.

Se debe mencionar que no se encontró la señalización de TGF-β1 para aumentar la adhesión celular y promover la adhesión focal [45], por lo tanto, la adhesión celular inducida por SW y adhesión focal pueden basarse en mecanismos distintos. Esto plantea la posibilidad de que la invasividad de células de cáncer SW-inhibida podría ser los efectos integrados de varios eventos de señalización. Otras vías también se predijo a ser afectados por SW en el análisis de microarrays, tales como el metabolismo y el estrés oxidativo. Estudios recientes ponen de relieve las contribuciones del metabolismo desregulado y el estrés oxidativo a la invasión de células de cáncer [46,47]. Ya sea SW podría utilizar estas vías para regular la invasividad de células de cáncer merece investigación adicional.

Juntos, encontramos SGR podría promover la adhesión celular, posiblemente por el aumento del tamaño y la fuerza de las adhesiones focales, e inhibir la migración y la invasión de HepG2, MDA células -MB-231 y T24. La represión de la señalización de TGF-β1 en parte contribuye a la inhibición de la migración inducida por SW. Aunque estos resultados se obtuvieron a partir de un subconjunto de líneas celulares de cáncer, la función novedosa contra el cáncer de SGR puede proporcionar una posible base molecular para su aplicación clínica futuro en el tratamiento del cáncer.

información de apoyo
S1 Fig. Sin focos metastásicos se observó en el hígado de ratones
imágenes representativas de H & amp;. E manchadas tejidos hepáticos en PBS y el grupo tratado con SW. hígados embebidos en parafina se seccionaron en intervalos de 30 mm y se identificaron 10 células cancerosas MDA-MB-231 como focos metastásicos. Barra de escala, 200 mm, ampliación, × 10
doi:. 10.1371 /journal.pone.0118287.s001 gratis (TIF)

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