Extracto
El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. El pronóstico sigue siendo pésimo con poco avance en el tratamiento. La metformina es un fármaco ampliamente utilizado para el tratamiento de la diabetes tipo II. datos epidemiológicos recientes revelaron que la administración oral de metformina se asocia con un riesgo reducido de cáncer de páncreas, lo que sugiere su potencial como un nuevo fármaco para esta enfermedad. Muchos estudios han demostrado la
in vitro
acción anticancerígena de la metformina, pero las concentraciones normalmente utilizadas eran mucho más alta que la
in vivo
concentraciones en plasma y tejidos obtenidos con dosis terapéuticas recomendadas de metformina, y baja concentraciones de metformina tuvieron poco efecto sobre la proliferación de células de cáncer pancreático. Se examinó el efecto de bajas concentraciones de metformina en diferentes subpoblaciones de células de cáncer de páncreas y se encontró que éstos inhiben selectivamente la proliferación de CD133
+ pero no CD24
+ CD44
+ células
+ ESA. También se examinó el efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la invasión celular y
la formación de tumores in vivo, lo que demuestra
in vitro
y
in vivo
acción anticancerígena en. La metformina se asoció con una reducción de fosfo-Erk y fosfo-mTOR independiente de Akt y fosforilación de AMPK. CD133
+ se consideran células de cáncer pancreático a ser células madre de cáncer que contribuyen a la recurrencia, metástasis y resistencia a las terapias adyuvantes en el cáncer de páncreas. Nuestros resultados proporcionan una base para la combinación de metformina con las terapias actuales para mejorar el pronóstico de esta enfermedad
Visto:. Gou S, P Cui, Li X, P Shi, Liu Wang T, C (2013) Las bajas concentraciones La metformina de forma selectiva inhibición de CD133
+ proliferación celular en el cáncer de páncreas y tienen acción contra el cáncer. PLoS ONE 8 (5): e63969. doi: 10.1371 /journal.pone.0063969
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: 10 Febrero, 2013; Aceptado: April 10, 2013; Publicado: May 8, 2013
Derechos de Autor © 2013 Gou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.001.064) (página web: http://www.nsfc.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los más agresivos de tumores malignos sólidos. Cada año, 43.920 pacientes se les diagnostica la enfermedad, dando como resultado 37.390 muertes por año en los Estados Unidos y hacer que el cáncer de páncreas la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en hombres y mujeres [1]. Ha habido poco avance en el tratamiento y el pronóstico sigue siendo pésimo [2], [3], [4], [5], con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo alrededor del 3% y una supervivencia media de menos de 6 meses. Entre los pacientes que se someten a una resección potencialmente curativa, 5 años de supervivencia es inferior al 24%, debido a la recurrencia local y metástasis [1], [6], [7]. se necesitan estrategias terapéuticas novedosas, por tanto, urgente para esta enfermedad altamente maligno.
La metformina es un fármaco ampliamente utilizado para el tratamiento de la diabetes tipo II. Recientemente, los datos epidemiológicos revelaron que la metformina, pero no otros fármacos antidiabéticos, disminuye la incidencia de cáncer de páncreas en pacientes con diabetes mellitus [8], [9]. Curiosamente, no hubo correlación entre el efecto protector y los niveles de azúcar en la sangre de los pacientes [9]. Un efecto protector también se observó en un modelo de hámster tumorigénesis grasa de cáncer de páncreas usando N-nitrosobis- (2-oxopropil) amina [10]. Varios
in vitro
estudios han establecido una acción directa de la metformina en muchos tipos de células cancerosas, incluyendo los de cáncer de páncreas [11], [12]. por lo tanto, la metformina puede ser un agente terapéutico potencial en el tratamiento de cáncer de páncreas, aunque su mecanismo de acción contra el cáncer es ambigua.
in vitro
experimentos han revelado un efecto dependiente de la dosis de metformina sobre la proliferación de células cancerosas. Las concentraciones normalmente utilizadas en este tipo de estudios son 5-30 mM, que son mucho más altas que las concentraciones plasmáticas y tisulares medidos en individuos que han recibido dosis terapéuticas recomendadas, y menos de 1 mM de metformina tiene poco efecto sobre la proliferación de células de cáncer [13] , [14].
a continuación, se muestra que las concentraciones bajas de metformina tienen efectos en diferentes subpoblaciones de células de cáncer de páncreas, según su expresión diferencial de los marcadores de superficie. CD133
+ y CD24
+ CD44
+ ESA
+ células se consideran las células madre del cáncer de páncreas, y la proliferación de CD133
+ pero no CD24
+ CD44
+ ESA
+ células se inhibió selectivamente por bajas concentraciones de metformina. La metformina se asoció con reducciones de fosfo-ERK y fosfo-mTOR independiente de Akt y fosforilación de AMPK. Aunque baja concentración de metformina no tuvo ningún efecto sobre la capacidad proliferativa de las células de cáncer de páncreas en general, su
in vitro
capacidades invasivas y
in vivo
el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas fueron significativamente inhibido.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Se obtuvieron células SW1990 AsPC-1 y de la American Type Culture Collection. 1 ASPC células de adenocarcinoma pancreático se derivaron de la ascitis de 62 años de edad, paciente de raza caucásica con adenocarcinoma de páncreas; células de adenocarcinoma pancreático SW1990 se derivaron de la metástasis en el bazo de un 56 años de edad, paciente de sexo masculino de raza caucásica con adenocarcinoma de páncreas. Ambos tipos de células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Billings, MT) y penicilina /estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C con 5% CO
2.
citometría de flujo
Para la detección de marcadores de superficie, las células se resuspendieron en solución salina equilibrada de Hank 100 l con 1% de FBS (Gibco). Para el aislamiento de CD133
+ células para análisis de transferencia Western, las células se resuspendieron en solución salina equilibrada de Hank 100 l con 1% de FBS. se añadió Fc de unión a receptor inhibidor (eBioscience, Inc., San Diego, CA) y la muestra se incubó durante 5 min a 4 ° C. Después de dos lavados, anti-CD133 isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Biorbyt, Cambridge, Reino Unido), anti-CD24 FITC (eBioscience), anti-CD44 PE-Cy5 (eBioscience) o Anti-ESA PE (eBioscience) se añadió y la muestra se incubó durante 30 min a 4 ° C. Después de dos lavados, las proporciones de las células de la subpoblación que expresaban los diferentes marcadores de superficie se determinaron utilizando un sistema de FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) y clasificación de células de CD133
+ células se realizó utilizando un sistema de FACSAria (BD Biosciences) . dispersión lateral y perfiles de dispersión frontal se utilizan para eliminar los dobletes de células.
Para el análisis de la apoptosis, las células fueron tratadas durante 48 h con metformina (0,2 mM durante AsPC-1, 0,1 mm para SW1990) o sin metformina. En primer lugar, las muestras se incubaron con el receptor Fc inhibidor de la unión durante 5 min a 4 ° C, luego se añadió anti-CD133 FITC y la muestra se incubó durante 30 min a 4 ° C. Después de dos lavados, Anexina V APC y yoduro de propidio etiquetado se realizó para citometría de flujo, que se realizó utilizando un kit de ensayo de Anexina V de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el análisis del ciclo celular, las células fueron tratadas durante 48 h con metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) o sin metformina. Después de fijar las células en 70% de metanol, se añadió inhibidor de la unión al receptor de Fc y la muestra se incubó durante 5 min a 4 ° C. Después, se añadió anti-CD133 FITC y la muestra se incubó durante 30 min a 4 ° C. Después de dos lavados, la muestra se trató con RNasa y se expone a yoduro de propidio para citometría de flujo.
proliferación de las células de ensayo
Ensayos de proliferación celular se realizaron utilizando CCK-8 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se cultivaron en 100 l de DMEM suplementado con 10% FBS. Después de 24 h, las células sembradas se trataron con 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 o 0,50 mM metformina añadió al medio de cultivo, o no recibió metformina. En los puntos de tiempo indicados, el medio se cambió por 110 l DMEM con CCK-8 de reactivo y se incubaron las células durante 2 h. Se midió la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector automático de microplacas.
Crecimiento curva
Primero, las células se cultivaron en DMEM libre de suero durante 12 h. Después las células se separan por tripsinización y se sembraron en placas de seis pocillos en DMEM suplementado con 10% FBS con metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) o sin metformina a una concentración de 1 × 10
3 células /pocillo. El número de células se evaluó siguiente tratamiento con tripsina; muestras de células se contaron en un hemocitómetro en intervalos de 24 horas. Los resultados se representan como una curva de crecimiento.
invasión de la célula de ensayo
Un ensayo de invasión de células se realizó en un pocillos 24 cámara Transwell (Corning, Inc., Corning, NY). En primer lugar, la pieza de inserción de membrana de poro de policarbonato 8 m se revistió con 100 l de Matrigel (BD Biosciences). Antes de que se realiza el ensayo, las células fueron tratadas con metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) durante 48 h o no dan metformina. Las cámaras se colocan entonces en placas de 24 pocillos; 1 × 10
4 células en DMEM suplementado con 0,2% de FBS se colocaron en cada cámara superior, y DMEM suplementado con 10% FBS con metformina (mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990 0.2) o sin metformina se añadió a las cámaras inferiores. Después de la incubación a 37 ° C durante 48 h, las células que habían invadido hacia el lado opuesto de la superficie de la membrana se tiñeron con cristal violeta.
xenoinjerto experimento
Mujer
nu
/
nu
ratones se obtuvieron del Centro Experimental de Animales de Union hospital, Wuhan, china. Para cada experimento, los ratones se distribuyeron al azar en grupos iguales (cuatro ratones por grupo) que eran sin tratar o tratados con metformina. Para los grupos tratados, /L de la metformina se diluyó 800 mg en el agua de bebida cada día durante la duración del experimento; 72 h más tarde, la población de células de cáncer pancreático se inyectaron en el flanco derecho de cada ratón. Los tumores se midieron cada 3 días después de que el volumen inicial de la inyección y tumor (V) se calculó de acuerdo con V = (longitud x anchura
2) /2. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal del Hospital Unión, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (Permiso Número: 2009-096).
Western Blot
citometría de flujo ordenadas las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en tampón RIPA, 1 mM PMSF, 1 mM Na
3Vo
4, y 1 × proteasa cóctel inhibidor de 3 min en hielo. El lisado se centrifugó a 14.000 × g durante 15 min a 4 ° C y el sobrenadante se utilizó para el Western Blot. Proteína lisados se hirvieron en tampón de carga (Beyotime, Jiangsu, China), se resolvieron por electroforesis en geles de 8% de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). Membranas se probaron durante la noche a 4 ° C con AMPKα, fosfo-AMPKα (Thr172), Akt, fosfo-Akt (Thr308), ERK1 /2, fosfo-ERK (Thr202 /Tyr204), mTOR, y fosfo-mTOR (Ser2448) primaria anticuerpo (Señalización celular, Danvers, MA), con β-actina (Señalización celular) como el control. se utilizó peroxidasa de rábano conjugada IgG (Beyotime) para detectar proteínas específicas. Por último, la inmunodetección se realizó utilizando sustratos quimioluminiscentes (Amersham Pharmacia Biotech).
estadístico El análisis
Para citometría de flujo y ensayos de invasión celular, se realizaron experimentos por triplicado. El experimento de xenoinjerto se realizó por cuadruplicado. Para los ensayos de proliferación celular y curvas de crecimiento, los experimentos se realizaron en seis. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar, se analizan mediante análisis unidireccional de varianza y luego se compararon entre los grupos utilizando de Student no pareada
t
alltests. Un umbral de significación de
P Hotel & lt; 0,05 se utilizó. Los datos fueron analizados con el programa SPSS v.11 software estadístico (SPSS, Inc.).
Resultados
Las bajas concentraciones de metformina no inhibieron la proliferación de células de cáncer de páncreas
Para investigar el efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la proliferación de células de cáncer pancreático, se realizó un ensayo de CCK-8 utilizando células AsPC-1 y SW1990. La metformina se ha demostrado que tiene poco efecto sobre la proliferación de células de cáncer pancreático a bajas concentraciones. Como se muestra en la Fig. 1, en las presentes células estudio fueron tratados con metformina 0,01-0,2 mM durante 72 h, pero su supervivencia no fue inhibida.
células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con diferentes concentraciones de metformina durante 72 h y números de células viables se determinaron por CCK-8 ensayo. Los resultados se presentan como la proporción de células viables con relación al control. No se observó ninguna diferencia en células viables entre las células tratadas con bajas concentraciones de metformina (≤0.5 mM) y los controles. Las barras de error representan la desviación estándar.
Las bajas concentraciones de metformina disminuyó la proporción de CD133
+ células
Para investigar el efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la proliferación de diferentes subpoblaciones de las células de cáncer de páncreas, se realizó un ensayo de citometría de flujo usando células AsPC-1 y SW1990. Las células fueron tratadas con metformina 0,01 hasta 0,2 mM durante 72 h y su expresión de marcadores de superficie analizaron. Como se muestra en la Fig. 2, las concentraciones bajas de metformina disminuyó CD133
+ células en una forma dependiente de la dosis, pero no afectó CD24
+, CD44
+, la ESA
+ o CD24
+ CD44
+ ESA
+ células (CD24
+ CD44
+ ESA
+ células no son detectables entre las células ASPC-1).
células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con diferentes concentraciones de metformina de 72 h y las proporciones de células que expresan diferentes marcadores de superficie se determinaron por citometría de flujo. Los resultados se presentan como las proporciones de los diferentes subpoblaciones de células. Las proporciones de CD24
+, CD44
+, la ESA
+ y CD24
+ CD44
+ ESA
+ células (detectables sólo en las células SW1990) no fueron alterados por el tratamiento con bajas concentraciones de metformina (≤0.2 mM). La proporción de CD133
+ células se redujo de una manera dependiente de la dosis; metformina 0,2 mM durante AsPC-1 en las células y metformina 0,1 mM para las células SW1990 disminuyó la proporción de CD133
+ células a la mitad. Las barras de error representan la desviación estándar.
*
P Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el control) guía empresas
concentraciones bajas de metformina inhibe la proliferación de CD133
+ células por G1 detención /S
Para investigar el efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la proliferación de CD133
+ células del cáncer pancreático, AsPC-1 y SW1990 células fueron tratadas con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente. El número de células se contaron cada 24 horas y citometría de flujo se llevó a cabo para determinar el número y las proporciones de CD133
+ y CD133
- células en los puntos de tiempo indicados. Como se muestra en la Fig. 3, la proliferación de CD133
+ células fue inhibida selectivamente. análisis de apoptosis y el ciclo celular se realizaron 48 h después de las células fueron tratadas con metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) o sin metformina; estas bajas concentraciones apoptosis inducida en ninguno CD133
+ células
+ CD133, pero ni el ciclo celular de la CD133
+ células se vio alterada por el tratamiento. metformina Baja concentración aumentó la proporción de CD133
+ células en la fase G0 /G1 y la disminución de la de las células en fase S de manera significativa. El CD133
- ciclo celular no se vio afectada (Fig. 4)
A, las curvas de crecimiento de células de cáncer de páncreas tratados con concentraciones bajas de metformina.. células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente, y sus números contados en cada punto de tiempo. Los resultados se presentan como el incremento veces en relación a 0 h. B, Efecto de concentraciones bajas de metformina sobre la proporción de CD133
+ células. células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente, y la proporción de CD133 se determinó
+ células en cada punto de tiempo. La proporción de CD133
+ células disminuyó gradualmente. C, curvas de crecimiento para CD133
+ y CD133
- células de cáncer de páncreas tratados con concentraciones bajas de metformina. El número total de células de cáncer pancreático y las proporciones de CD133
+ y CD133
- células fueron determinados en cada punto de tiempo. Los resultados se presentan como el incremento veces en relación a 0 h. La proliferación de CD133
+ células fue inhibida selectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar.
A, Efecto de concentraciones bajas de metformina sobre la apoptosis en el cáncer de páncreas. células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente, durante 72 h y la proporción de células apoptóticas se determinaron por citometría de flujo. No se observaron diferencias significativas entre las células y los controles tratados. B, Efecto de concentraciones bajas de la metformina sobre el ciclo celular en el cáncer de páncreas. células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente, durante 72 h y la proporción de células en cada fase del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo. Una disminución de células en fase S total y un aumento de la fase G0 /G1 sugieren G1 detención /S en CD133
+ células. Las barras de error representan la desviación estándar.
*
P
. & Lt; 0,05
Las bajas concentraciones de metformina inhibió la invasión de células de cáncer de páncreas
Un ensayo Transwell se llevó a cabo para examinar el efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la invasión de células de cáncer de páncreas. El tratamiento con metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) disminuyó el número de células que invadió al lado opuesto de la membrana de la cámara Transwell comparación con las células que no recibieron metformina (Fig. 5B), lo que sugiere que la baja concentración de metformina inhibe la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas.
Efecto de concentraciones bajas de metformina sobre la invasión en el cáncer de páncreas. células ASPC-1 y SW1990 se incubaron con 0,2 mM o metformina 0,1 mM, respectivamente, durante 72 h y la invasión de células se determinó por ensayo Transwell. Las bajas concentraciones de metformina reduce la invasión de células de cáncer de páncreas. Las barras de error representan la desviación estándar.
*
P
. & Lt; 0,05
La administración oral de metformina inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas in vivo
Para investigar el efecto de la baja dosis de metformina en cáncer de páncreas
in vivo
, los experimentos de xenoinjertos utilizando
nu
/
nu
se llevaron a cabo los ratones. Para los ratones tratados con metformina, la cantidad de fármaco diluido en el agua de bebida era equivalente a una dosis humana de 20 mg /kg por la normalización y la superficie total; la concentración en plasma de la metformina en los ratones fue de alrededor de 0,02 mM. Los ratones se sacrificaron 18 (ASPC-1 células) o 24 (células SW1990) días después de que fueron inyectados con células de cáncer pancreático (5 × 10
6 para las células ASPC-1, 1 × 10
7 para las células SW1990) . El crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas se inhibió significativamente por el tratamiento con metformina (Fig. 6).
A, de xenoinjerto en el sacrificio. Ochocientos miligramos por litro de metformina se diluyó en el agua potable de
nu
/
nu ratones
72 h antes de la inyección de las células de cáncer de páncreas. Se sacrificaron los ratones 18 ó 24 días después de la implantación. Los xenoinjertos de ratones tratados con metformina oral fueron mucho menores que los de los ratones no tratados. B, Efecto de la administración oral de metformina sobre el crecimiento de xenoinjertos. Ochocientos miligramos por litro de metformina se diluyó en el agua potable de
nu
/
nu ratones
72 h antes de la inyección de las células de cáncer de páncreas. Los tumores se midieron cada 3 días después de que el volumen de inyección y tumor (V) se calculó de acuerdo con V = (longitud x anchura
2) /2. el crecimiento de xenoinjerto se inhibió significativamente por la administración oral de metformina. Las barras de error representan la desviación estándar.
*
P
. & Lt; 0,05
Las bajas concentraciones de metformina inhibió la fosforilación de mTOR independiente de Akt y fosforilación de AMPK en CD133
+ células
Para identificar posibles determinantes moleculares de los efectos de la metformina sobre CD133
+, evaluamos la activación de AMPK, Erk y Akt - tres quinasas que están posiblemente involucrados en estos efectos. mTOR, que está fosforilado por AMPK, Erk, y Akt, también se evaluó. Después del tratamiento con metformina durante 4 h (0,2 mm para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990), reducciones de fosfo-ERK y fosfo-mTOR se observaron en CD133 células
+, lo que sugiere un requisito para la inhibición de ERK y mTOR por la acción antiproliferativa de la metformina. No se observó ningún cambio significativo de fosfo-AMPKα, mientras fosfo-Akt aumentó después del tratamiento con metformina, lo que sugiere que el efecto inhibidor de la metformina sobre mTOR era independiente de AMPK y la fosforilación de Akt (Fig. 7).
pancreático las células cancerosas fueron tratados con metformina para 4 h (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) y CD133
+ células se clasificaron por citometría de flujo. La expresión de AMPKα, Akt, ERK1 /2, y mTOR y la fosforilación de CD133
+ células fueron evaluadas por Western Blot y los resultados fueron cuantificados usando ImageJ V.1.46r (National Institutes of Health). Se observaron disminuciones significativas de fosfato ERK1 /2 y la expresión de fosfo-mTOR y un aumento significativo de la expresión de fosfo-Akt en las células tratadas con metformina. Las barras de error representan la desviación estándar.
*
P
. & Lt; 0,05
Discusión
La metformina reduce la producción de glucosa hepática y aumenta la sensibilidad a la insulina y la utilización de la glucosa por los músculos y adipocitos, lo que resulta en disminución de la insulinemia y la mejora de la sensibilidad a la insulina en pacientes diabéticos. Es el fármaco antidiabético más frecuentemente prescrito para la diabetes tipo II [15] y también se utiliza para otras enfermedades que presentan resistencia a la insulina, como el síndrome de ovario poliquístico [16], enfermedad del hígado graso no alcohólico [17] y la pubertad prematura [18] . Recientemente, se ha ganado la atención por su posible eficacia como un medicamento contra el cáncer. En un trabajo pionero, Evans et al. primero demostró en 2005 que el tomar la metformina puede estar asociada con un menor riesgo de cáncer en pacientes con diabetes tipo II [19]. En 2009, un estudio de casos y controles se centra en el efecto de las terapias antidiabéticas sobre el riesgo de cáncer de páncreas fue publicado por Li et al. y demostró que la metformina disminuyó significativamente el riesgo de cáncer de páncreas, con una razón de posibilidades de 0,38 [9]. La eficacia de la metformina en la disminución de la incidencia de cáncer de páncreas ha sido apoyada por otros estudios epidemiológicos y en animales [8], [10].
A pesar de que el mecanismo antidiabético metformina de la acción sigue siendo incierta, la activación de AMP-activated proteína quinasa (AMPK) ha sido ampliamente aceptada como un posible mecanismo. AMPK es una enzima importante que participa en la señalización de insulina, el metabolismo de la glucosa y de las grasas, y la producción de glucosa por las células hepáticas. Muchos estudios celulares se han centrado en la AMPK y moléculas relacionadas y han puesto de manifiesto una acción anticancerígena de metformina
in vitro
[12], [20], [21]. Un estudio reciente demostró también la acción antitumoral de la metformina sobre las células madre del cáncer de páncreas [13]. Es de destacar que la mayoría de estos experimentos utilizaron concentraciones de metformina (típicamente 5 a 30 mM) que son mucho más altas que las dosis terapéuticas recomendadas para el uso clínico. Cuando las concentraciones se redujeron al mismo orden que la que se encuentra en el plasma y tejidos de los individuos que reciben dosis terapéuticas, no se observó inhibición de la proliferación celular. Nuestros datos muestran que la proliferación de células de cáncer pancreático no es inhibida por la metformina menos de 0,5 mM
mayoría de los tumores, como el cáncer de páncreas, son heterogéneas.; es decir, que comprenden células de diferentes características fenotípicas y biológicos. La hipótesis de las células madre de cáncer sugiere que sólo una pequeña subpoblación de células, definido como células madre de cáncer, tiene la capacidad de dar lugar a todos los tipos de células que se encuentran en una muestra de cáncer particular. cáncer de células madre juegan un papel clave en el proceso tumoral, el crecimiento, la invasión, metástasis, recurrencia y resistencia a la terapia adyuvante del cáncer [22], [23]. Por lo tanto, se sospecha que las concentraciones bajas de metformina pueden afectar a las células madre del cáncer de páncreas y las células cancerosas no madre de manera diferente, lo que podría explicar de la droga
in vivo
acción anticancerígena y la inconsistencia de
in vitro
y
in vivo
resultados. Debido a CD133
+ y CD24
+ CD44
+ ESA
+ células se han documentado que las células madre del cáncer de páncreas [24], [25], [26], se determinó el efecto de la baja concentraciones de metformina en estas subpoblaciones, lo que demuestra una proporción reducida de CD133
+ células. Teniendo en cuenta el pequeño efecto de bajas concentraciones de metformina sobre la proliferación de células de cáncer de páncreas en general, se puede inferir que la proliferación de CD133
+ células, pero no CD24
+, CD44
+, la ESA
+ o CD24
+ CD44
+ ESA
+ células, se inhibió de forma selectiva. Hermann et al. demostrado que CD133
+ y CD24
+ CD44
+ ESA
+ células se superponen pero no eran idénticos en las células L3.6pl derivados de COLO 357 células de cáncer de páncreas [25]. Nuestros resultados mostraron que CD133
+ células, pero no CD24
+ CD44
+ ESA
+ células son detectables entre las células AsPC-1. En cuanto a las células SW1990, CD24
+ CD44
+ ESA
+ células, lo que representó el 5,46% de todas las células, eran insensibles a la metformina, lo que sugiere que las características biológicas de CD133
+ y CD24
+ CD44
+ ESA
+ células se diferencian. Se determinó además la proporción de CD133
+ células cada 24 horas durante 5 días después del tratamiento de las células de cáncer de páncreas con bajas concentraciones de metformina y las curvas de crecimiento producidos tanto para CD133
+ y CD133
- células. La inhibición selectiva de CD133
+ células era evidente. La acumulación de
in vitro
evidencia sugiere que altas concentraciones de metformina pueden ejercer un efecto antitumoral mediante la inducción de la apoptosis y /o la detención del ciclo celular, pero hay pocos datos publicados para las bajas concentraciones. Por lo tanto, también investigó el efecto de la baja concentración de metformina en la apoptosis y el ciclo celular. La apoptosis, que se ha documentado que es importante en la acción antitumoral de la metformina, se indujo en ninguno CD133
+ ni CD133
- células. G1 /S detención fue inducida en CD133
+ pero no en CD133
- células. G1 detención /S puede por lo tanto juegan un papel clave en la inhibición selectiva de CD133
+ células.
A continuación, realizamos
in vitro e
in vivo
experimentos a verificar la acción contra el cáncer de bajas concentraciones de metformina en el cáncer de páncreas. Se utilizaron células de cáncer de páncreas tratados con metformina durante 72 h para los ensayos de invasión celular debido a que el tratamiento disminuyó la proporción de CD133
+ células a la mitad. La metformina se diluyó en el agua potable de
nu
/
nu ratones
72 h antes del experimento xenoinjerto para alcanzar una concentración plasmática en estado estacionario de acuerdo con la farmacocinética de metformina [27]. Tanto el ensayo de invasión in vitro y el ensayo de xenoinjerto in vivo apoyan la acción anticancerígena de bajo metformina concentración. Las diferencias de los volúmenes tumorales SW1990 xenoinjertos no fueron estadísticamente significativas en el día 21 (
P = 0,062
) o el día 24 (
P = 0,055
). Esto puede ser debido al tamaño pequeño de la muestra. Teniendo en cuenta el pequeño efecto de la metformina sobre la proliferación de CD133
- células y el papel clave de las células madre del cáncer en la progresión tumoral, invasión y metástasis [28], [29], que tentativamente sugieren que la inhibición selectiva de CD133
+ células contribuye significativamente a la in vitro e in vivo efecto anticancerígeno de la metformina en.
a continuación se evaluó la expresión de moléculas que pueden determinar la acción anticancerígena de la metformina sobre CD133
+ células del cáncer pancreático. La activación de mTOR es regulada por factores de crecimiento y nutrientes, y se regula el crecimiento celular mediante el control de la traducción del ARNm, la biogénesis de ribosomas, la autofagia, y el metabolismo de [30]. Muchos objetivos de mTOR quinasa se sobreexpresa o mutados en el cáncer, que se correlaciona con la progresión del cáncer, pronóstico adverso, y la resistencia a la quimioterapia [31]. En los últimos años, mTOR se encontró que juegan un papel importante en el mantenimiento de células madre del cáncer [32], [33]. Por lo tanto, mTOR ha sido considerada como una diana terapéutica en el cáncer que puede ser objetivo de la metformina [34], [35]. Un efecto inhibidor de la metformina sobre la fosforilación de mTOR, que se ha informado en las células cancerosas, incluyendo los del cáncer de páncreas [36], [37], se observó en CD133
+ células de cáncer pancreático en este estudio. Aunque la metformina se ha documentado para inducir la activación de AMPK en células de cáncer pancreático, no se observó este fenómeno, que puede ser debido a la baja concentración de metformina utilizada en este estudio [36]. Erk y Akt son otras dos mediadores de la mTOR en células de cáncer. La mutación de K-Ras, la mutación predominante en el cáncer de páncreas, conduce a la activación aberrante de ERK en las células de cáncer de páncreas, que a su vez conduce a la activación de mTOR [38]. Hemos demostrado la concordancia de la actividad inhibidora de la metformina sobre Erk y mTOR en CD133
+ células, lo que nos lleva a sugerir que la abrogación de Erk dependientes de la activación de mTOR desempeña un papel importante en la acción anticancerígena de la metformina. Recientemente, un efecto inhibidor selectivo similar de la metformina sobre CD133
+ células de cáncer debido a la inhibición inducida por la metformina de Akt se documentó en glioblastoma [39]. En contraste, nuestros resultados demuestran que la activación inducida por la metformina de Akt en CD133
+ células de cáncer pancreático. Nosotros sugerimos que tentativamente dos mecanismos pueden contribuir a la activación de Akt en CD133
+ células del cáncer pancreático. En primer lugar, la metformina induce re-expresión de miR-200 en el cáncer de páncreas [13]. FOG2 reprime PI3K mediante la unión de la subunidad p85 y miR-200 activa la ruta de señalización de PI3K /Akt, mediante la anulación FOG2 [40]. En segundo lugar, la inhibición dependiente de Erk de mTOR puede mediar un bucle de realimentación que aumenta la fosforilación de Akt [41].
En conclusión, nuestros resultados revelan que bajas concentraciones de metformina, del mismo orden como los medidos en el plasma y los tejidos de los individuos que han recibido una dosis terapéutica recomendada de metformina, inhibe selectivamente la proliferación de CD133
+ células de cáncer de páncreas y tiene una acción anticancerígena tanto
in vitro
y
in vivo
. El efecto de antiproliferación de la metformina sobre CD133
+ células de cáncer pancreático puede ser debido a la inhibición de Akt independiente de la fosforilación de mTOR.