Extracto
Antecedentes
Una gran cantidad de pruebas obtenidas mediante modelos de ratones indica que las células CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras (Treg) mantener periférica tolerancia a antígenos propios y también inhiben las respuestas inmunes anti-tumorales. Hasta la fecha no existe información limitada acerca de CD4
+ respuestas de células T en pacientes con cáncer colorrectal (CCR). Hemos establecido para medir las respuestas de células T a un antígeno asociado a tumor y examinar si Treg inciden en esas respuestas inmunitarias antitumorales en pacientes con CCR.
Metodología y Principales conclusiones
Treg se identificaron y caracterizado como CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ usando citometría de flujo. Un aumento de la frecuencia de Treg se demostró en los dos nodos sanguíneos y linfáticos mesentéricos periférica de pacientes con cáncer colorrectal (CRC), en comparación con cualquiera de los controles sanos o pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). El agotamiento de Treg a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con CRC desenmascarado CD4
+ respuestas de células T, como se observa por la liberación de IFN, al antígeno asociado a tumor 5T4, mientras que no se observó ningún efecto en un grupo de control emparejados por edad sana .
Conclusiones /Importancia
en conjunto, estos datos demuestran que Treg capaz de inhibir las respuestas inmunes específicas de antígeno asociados a tumores se enriquecen en pacientes con CCR. Estos resultados apoyan una justificación para la manipulación de Treg para mejorar la inmunoterapia del cáncer
Visto:. Clarke SL, Betts GJ, Planta A, Wright KL, El-Shanawany TM, Harrop R, et al. (2006) CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células reguladoras T Suprimir antitumorales la respuesta inmune en pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 1 (1): E129. doi: 10.1371 /journal.pone.0000129
Editor Académico: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Septiembre, 2006; Aceptado: 14 Noviembre 2006; Publicado: December 27, 2006
Derechos de Autor © 2006 Clarke et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de la caridad del cáncer Tenovus, Cardiff, y una pequeña concesión de una subvención de Cardiff y Vale NHS Trust. KLW fue financiado por una subvención del proyecto Wellcome Trust y la Asociación Internacional de Investigación del Cáncer. AMG es un investigador senior MRC
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el cuarto más comúnmente. diagnosticado una enfermedad maligna con un estimado de 1 millón de nuevos casos y más de 500 000 muertes al año en todo el mundo [1]. El tratamiento actual de pacientes con CRC gira en torno a la escisión del tumor primario y los ganglios linfáticos locales y el uso selectivo de 5-fluorouracilo (5FU; inhibe la timidilato sintasa) quimioterapia basada en [2]. Los recientes avances en las imágenes preoperatorias, la técnica quirúrgica y el uso de quimioterapia neoadyuvante han mejorado los resultados, pero el cáncer colorrectal sigue siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales con el 40-50% de los pacientes que se someten a una operación potencialmente curativa, sufriendo recaída o muerte por enfermedad metastásica.
estadiaje clínico-patológico de la enfermedad se correlaciona fuertemente con el pronóstico. Curiosamente, la mejora de los resultados clínicos también se asocia con la presencia de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), sobre todo si los linfocitos invaden los elementos glandulares del tumor [3], [4]. Esto sugiere que las respuestas inmunes anti-tumorales pueden incidir en el crecimiento del tumor primario, y pueden tener un papel importante en el control de la enfermedad metastásica. La evidencia indirecta de la importancia de la respuesta inmune en pacientes con cáncer es la asociación epidemiológica en algunas poblaciones entre un aumento de la incidencia de tumores y después de trasplante de órganos inmunosupresión [5].
Mucho interés ha surgido recientemente en el papel de una de origen natural de la población de CD4
+ CD25
+ células T reguladoras (Treg), caracterizados por la expresión del factor de transcripción-cabeza de horquilla FOXP3, y aumento de los niveles de los marcadores de superficie CD45RO, CTLA-4, y GITR [6 ], [7], [8]. Treg han demostrado controlar las respuestas específicas autoantígeno en la periferia, y por lo tanto puede jugar un papel en el control de las respuestas inmunes anti-tumorales. Varios grupos incluyendo el nuestro, han demostrado que el agotamiento de Treg promueve la generación de respuestas inmunes anti-tumorales y de rechazo de tumores en modelos murinos (revisado en [9]). No hay evidencia que sugiera que estas respuestas protectoras encauzar antígenos específicos de tumores ambos, así como antígenos tumorales compartidos [10], [11].
Más recientemente, varios estudios han observado un aumento de la frecuencia de células CD4
+
+ células CD25 T en la sangre periférica de pacientes con varios tipos de cáncer, aunque la mayoría de estos estudios no confirmó que se trataba de Treg mediante la tinción de FOXP3 (revisado en [9]). La presencia de FOXP3
+ Treg en el TIL de cáncer de ovario ha, sin embargo, ha identificado como un factor de riesgo independiente de peor pronóstico. Por otra parte, después de la purificación de la ascitis tumorales, éstas Treg, se mostró a suprimir las respuestas de células T específicas de Her2-
in vitro
[12].
El antígeno onco-fetal humano, 5T4, es una de 72 kDa glicoproteína rica en leucina de membrana que se expresa en altos niveles en la placenta y también en una amplia gama de carcinomas humanos, incluyendo colorrectal, gástrico, renal y de ovario, pero raramente en tejidos normales [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. En este estudio se prueba la hipótesis de que Treg se desarrollan en pacientes con CRC que suprimen la respuesta inmune 5T4-específicas. Las muestras de pacientes con CCR o EII y controles sanos fueron examinados para hacer frente a tres preguntas: es la frecuencia de Treg (CD25
hiCD4
+ FOXP3
+ células T) se incrementó en nodos sanguíneos o linfáticos de pacientes con CRC; se pueden identificar respuestas de células T antitumorales a 5T4 en pacientes con CRC; y no Treg incidir en estas respuestas inmunitarias antitumorales?
Métodos Barcelona Grupos
ejemplo
pacientes
CRC fueron identificados a partir de las reuniones del equipo multidisciplinario con la primera presentación de un adenocarcinoma y no hay metástasis a distancia reportados en las imágenes de la sección transversal (estadio TNM I-III; etapa A-C de Duke). Los pacientes con EII (colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn) asistir a la clínica o sometidos a resección quirúrgica electiva fueron reclutados para el estudio. la aprobación del comité de ética local se concedió para el estudio por el Comité de Ética de Investigación Local Bro Taf.
Antígenos
derivado proteico purificado (PPD) (Statens Serum Institut, Dinamarca), hemaglutinina (HA) era una especie de regalo del Dr. John Skehel (RMIN, Mill Hill), 5T4 fue producida como se ha descrito anteriormente [19] (Oxford Biomedica). Todos los antígenos se utilizaron a una concentración final de 1 mg /ml.
Purificación de linfocitos
30-50 ml de sangre se extrajo de los pacientes o los controles y heparinizada (10 U /ml). PBMCs fueron extraídos por centrifugación sobre LymphoprepTM (Axis-Shield, Oslo, Noruega). Las células se lavaron dos veces en RPMI antes de su uso posterior. Los ganglios linfáticos fueron disecados de especímenes frescos dentro de los 30 minutos de la cirugía, se lavan en RPMI, puré por un colador celular estéril y se recogió por centrifugación.
Flujo de análisis de citometría de los linfocitos de los ganglios linfáticos y sanguíneos
Las muestras se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia a CD4 (clon RPA-T4), CD25 (clon M-A251), CD45RO (UCHL1 clon) y CTLA4 (clon BNI3) (BD Pharmingen), CD4 (clon S3.5) (Caltag ) y CD25 (clon 4E3) (Miltenyi Biotec). Todo tinción se realizó en tampón fosfato salino (PBS), 2,5% de FCS, EDTA 5 mM y la tinción intracelular se realizó utilizando el Cytofix, kit Cytoperm (BD Pharmingen). tinción de FOXP3 se realizó utilizando el kit de FITC anti-humana tinción FOXP3 (clon PCH101) (71 a 5776 eBioscience). Los linfocitos fueron cerrada en adelante y perfiles de dispersión lateral. Todo citometría de flujo se realizó en un BD FacsCalibur y analizados utilizando el programa de análisis v3.1 Cumbre (build 839 DakoCytomation, Fort Collins, Colorado).
CD4
+ CD25
hi add-back experimentos
purificada PBMC se enriquece de CD4
+ células y luego se separa en CD4
+ CD25
hI y CD4
+ CD25
- fracciones usando perlas magnéticas (Miltenyi CD4
+ CD25
+ kit de aislamiento de regulación). La citometría de flujo de cada fracción mostró que la rigurosidad de CD25
+ selección de la celda por el Miltenyi CD4
+ CD25
+ kit de aislamiento de regulación y anti-CD25 perlas de Miltenyi era comparable. Un ensayo de proliferación se creó utilizando 2x10
4 CD4
+ CD25
- las células, que se activa con 0,5 mg /ml de anti-CD3 (clon OKT3) unido a la placa (eBioscience) y 1 g de lucha contra /ml solubles -CD28 (clon 28.2) (BD Pharmingen) anticuerpos en RPMI 1640 suplementado con FCS tratado con calor al 10%, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. CD4
+ CD25
- células se activan por sí solo o en presencia de CD4
+ CD25
HI en células diferentes proporciones de 01:01, 1:0.1, 1:0.01 y 1:0.001 CD4
+ CD25
-:CD4
+ CD25
hi células. La proliferación se midió en el día 3 mediante la adición de 0.037 MBq /pocillo (1 Ci) de [
metilo
3H] -timidina (Amersham Biosciences) durante las últimas 18 horas de cultivo. Las células se recogieron sobre filtros de impresos Filtermat A (Wallac, Turku, Finlandia proveedor Perkin Elmer) usando un recolector de células Tomtek. Una vez que los filtros estaban secos, Meltilex Se añadieron unas láminas de centelleo de fusión-en (Wallac) y los filtros se leyeron usando un centelleo líquido Microbeta Trilux y contador de luminiscencia 1450 (Wallac).
ensayos ELISPOT de IFN-γ
los anticuerpos se obtuvieron de Mabtech (Natka, Suecia) y el ELISPOT fue desarrollado usando el kit de sustrato de fosfatasa alcalina de Bio-Rad (Hercules, California). El efecto de agotamiento de Treg en la producción de IFN-γ específica de antígeno se evaluó en ensayos paralelos. CD25
hi células se agotaron usando separación magnética con microperlas MAC CD25 (Miltenyi Biotec, Alemania). Brevemente, 1,5 x 10
7 PBMC se incubaron con 15 l de cuentas anti-CD25 recubiertas en el volumen total de reacción de 150 l de tampón (1 x PBS, BSA al 0,5%, EDTA 5 mM) a 4 ° C durante 15 min . perlas en exceso se eliminan mediante lavado y las CMSP estaban deterioradas una columna MS. La columna se lavó con 3 x 1 ml lavados en tampón. La eficacia de la depleción se confirmó mediante citometría de flujo. Los ensayos se establecieron utilizando 3,5 × 10
5 no empobrecido o CD25
células agotadas-hi en RPMI 1640 suplementado con 5% de FCS tratado con calor, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 2 mM L piruvato de sodio -glutamine y 1 mM por pocillo de una placa de filtración de 96 pocillos de polímero con respaldo (MAIP-S-4510) (Millipore, Moslheim, Francia) en un volumen de reacción total de 100 l /pocillo. Las concentraciones de anticuerpos utilizadas y las etapas de lavado fueron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, todas las incubaciones de anticuerpos fueron con 50 l /pocillo. El método ha sido descrito previamente [20]. PPD, HA y 5T4 se ensayaron en pocillos por duplicado, después de haber sido añadido a una concentración final de 1 g /ml, y se compararon con los pocillos de control sin proteínas. La placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO
2 para 18 h. Las células T activadas se enumeraron en el nivel de una sola célula mediante el recuento del número de puntos por pocillo usando un lector de ELISPOT automatizado (Cadama). Los respondedores fueron identificados como que tiene al menos 5 células formadoras de puntos (SFC) por 10
6 PBMC, después de restar el fondo, y un aumento de al menos 50% por encima del fondo.
El análisis estadístico
Flujo de datos de citometría se analizó utilizando el estudiante no apareado
t-test
(GraphPad Prism versión 2.0 (GraphPad software). la proporción de pacientes con cáncer y controles sanos de montaje de una respuesta a 5T4 se comparó utilizando una cerrada método de formulario para la comparación de las diferencias y el cálculo de los intervalos de confianza [21].
Resultados
Definición de la población humana Treg
Uso de los estrictos parámetros de compuerta reportados recientemente [8], eran Treg identificadas como células CD4 positivas con más brillante tinción CD25 que la de la población CD4-negativas (Fig 1a). la frecuencia de Treg se calculó como el porcentaje de CD4
+ CD25
células hI de la CD4
+ población, y fue en el rango de 0,09 a 1,44% de CD4
+ en las células PBMC de controles sanos emparejados por edad. de acuerdo con los informes anteriores, la gran mayoría de las células CD4
+ CD25
hi células eran positiva para CTLA4 y expresó CD45RO (& gt; 97%) [6], [7], [8]. El CD25
hi población se analizó adicionalmente por la expresión de FOXP3. Como se muestra en la Figura 1b, más del 95% de las células CD4
+ CD25
FOXP3 células hi expresado, en comparación con aproximadamente el 30% de las células CD4
+ CD25
int células. Este patrón de tinción fue la misma para ambos controles sanos y pacientes con CRC. la expresión de FOXP3 era insignificante en las células CD4
+ CD25
- células (Figura 1b)
(A) CD4
+ CD25
-., CD4
+ CD25
se identificaron
+ CD25
hi células CD4 int y como se muestra. CD4
+ CD25
hi células son aquellos en los que la expresión de CD25 fue más alta que en el CD4
- población. (B) la expresión de FOXP3 dentro de cada población se evaluó mediante tinción intracelular. (C) recién aislados CD4
+ CD25
- células T (2 × 10
4 células /pocillo) se cultivaron solas (CD25 /baja) o con CD4
+ CD25
hi células T a varias relaciones, y se estimularon con unido a la placa anti-CD3 y anti-CD28 soluble. La proliferación se evaluó mediante (
3H) -timidina. Los resultados representan la media de pocillos por triplicado con desviación estándar, a partir de un ensayo representativo.
Para confirmar el fenotipo reguladora de esta población de CD4
+ CD25
hi células, su capacidad para suprimir la activación de las células CD4
+ CD25
- las células se evaluó mediante un co-cultivo
in vitro
ensayo de proliferación in. CD4
+ CD25
- y CD4
+ CD25
hi células fueron separadas de las CMSP, tal como se describe en los métodos. La adición de CD4
+ CD25
células HI para policlonal estimulado CD4
+ células T suprime claramente la proliferación de CD4
+ CD25
- células T y, según lo informado por otros, esta supresión fue dependiente de la dosis [8], [22], [23] (Figura 1c).
CRC pacientes han aumentado el número de Treg en la sangre periférica
El Treg se definieron fenotípicamente como se describe anteriormente . La Figura 2a muestra las frecuencias de Treg en las PBMCs de pacientes con CRC (n = 12, rango de edad 58-80 años) en comparación con los controles sanos de la misma edad (n = 11, rango de edad 48-93 años) y los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (n = 22, rango de edad 19-80 años). En todos los grupos, la frecuencia de Treg era menos de 2% de CD4
+ células T. Sin embargo, la frecuencia media en pacientes con CRC (1,13%) se incrementó significativamente en comparación con los grupos de control (pacientes con EII 0,56%, controles sanos 0,46%). No hubo diferencia significativa en la frecuencia de Treg en los controles sanos y los pacientes con EII.
(A) recién aisladas PBMC de 12 pacientes con CRC, 11 controles sanos emparejados por edad y 22 pacientes con EII se tiñeron con anticuerpos frente a CD4 y CD25. Usando la estrategia gating indica en la Figura 1, se enumeraron Treg. (B) mesentéricas muestras de ganglios linfáticos (LN) se obtuvieron de muestras quirúrgicas de 8 CRC y 7 pacientes con EII y marcadas y que el anterior. Los datos muestran que el porcentaje de CD4
+ células que eran CD25
hola en cada muestra. Cada símbolo representa un paciente. Los valores de p se calcularon usando de un estudiante no apareado
t-test
.
CRC pacientes han aumentado el número de Treg en los ganglios linfáticos mesentéricos
Obtención de control de los ganglios linfáticos de sujetos sin enfermedad abdominal no fue posible. pacientes con EII ofrecen un grupo control de la enfermedad del colon a los pacientes con CRC, las últimas áreas también a menudo demuestran de inflamación alrededor del tumor. Además, los resultados de PBMCs no demostraron una alteración significativa en las frecuencias de Treg en pacientes con EII en comparación con los controles sanos. Por lo tanto, hemos considerado razonable utilizar los ganglios linfáticos mesentéricos obtenidos a partir de pacientes con EII se someten a cirugía como un grupo de control en el que examinar Treg en el tejido linfoide secundario.
ganglios linfáticos frescas se obtuvieron de las muestras resecado quirúrgicamente y se prepararon como se describe en los métodos. Las frecuencias de Treg en los ganglios linfáticos mesentéricos obtenidos de pacientes con CRC (n = 8), y los pacientes con EII (n = 7) se compararon (Figura 2b). pacientes con CRC de nuevo mostraron un aumento significativo en la frecuencia de Treg, lo que refleja el aumento ya se ha descrito en la sangre periférica. El derivado de ganglio linfático CD25
hi Treg tenía el mismo fenotipo a los encontrados en la sangre (datos no mostrados). No se observó ninguna diferencia en la proporción global de CD4
+ o CD8
+ células T (datos no mostrados).
Los pacientes con CCR no metastásico demuestran vigorosas CD4
+ respuestas de células T recordar antígenos
PBMCs fueron purificados de pacientes con CRC (n = 14) antes de la cirugía y la CD4 específica
+ respuesta de células T a la retirada de control antígenos PPD y HA medido por la liberación de IFN-γ. Estos resultados se compararon con los controles emparejados por edad sanos (n = 11) (Figura 3). CD4 y CD8 experimentos de reducción confirmaron que se trataba de CD4
+ respuestas de células T (datos no mostrados). No hubo evidencia de que los pacientes fueron inmunosuprimidos; todos los sujetos respondieron a por lo menos un antígeno. La proliferación celular también se evaluó en experimentos paralelos como una medida de la activación de células T, y de nuevo no se encontraron pruebas de la inmunosupresión antes de la cirugía (datos no mostrados).
Whole PBMC de 11 controles de la misma edad y 14 CRC los pacientes fueron evaluados para las respuestas a los antígenos PPD y HA, medido por el IFN-γ ELISPOT. Purificada PBMC se añadieron a 3,5 × 10
5 células /pocillo, y se incubaron durante 18 horas en presencia de cualquiera de 1 mg /ml de PPD, 1 mg /ml de HA o sin antígeno. Los pocillos se establecieron por duplicado. Menos del 5 células formadoras de manchas /10
6 PBMC se consideró negativo.
Treg tienen un marcado efecto sobre la respuesta inmune anti-tumorales en la sangre de pacientes con CCR
Una serie de ensayos se realizaron en pacientes con CRC (n = 14) y controles de la misma edad (n = 11) para determinar si la supresión de CD25
células hi altera la respuesta inmune a antígenos de memoria y el antígeno asociado a tumor 5T4. Hemos optimizado un sistema de aislamiento diseñado específicamente para agotar sólo los CD25
células hi de nuestras muestras como se indica en los métodos (Figura 4a). PBMCs recién aislados-se utilizaron en
ex vivo
ensayos ELISPOT de IFN-gamma como se describe anteriormente para determinar las respuestas a los antígenos de recuerdo y el antígeno tumoral 5T4, antes y después de agotamiento de Treg. En general, el agotamiento de Treg no cubierto algunas respuestas recordar antígenos en pacientes y controles (Figura 4B) de CRC. Sin embargo, en el caso del antígeno asociado a tumor 5T4, hubo una notable diferencia entre los controles y los pacientes de CRC. Un 5T4-específica
ex vivo
respuesta se encontró en 1/11 de los controles sanos y el agotamiento de Treg mejorado esta respuesta. Mientras que el agotamiento de Treg aumenta la respuesta 5T4-específico en 1/14 de los pacientes con CRC, el agotamiento de esta población dio lugar a la
Red de desenmascaramiento una respuesta 5T4 en 5/14 de los pacientes analizados (95% intervalo de confianza para diferencias emparejadas es -0,83 a -0,22 revela una diferencia significativa en las respuestas entre 5T4 CRC pacientes y controles sanos). Estos datos sugieren que Treg suprimen la respuesta inmune anti-5T4 específicamente en pacientes con cáncer colorrectal. Estos seis pacientes que demostraron respuestas 5T4 mejoradas tenían frecuencias Treg similares en la sangre periférica (rango de 0,82 a 2,35% media 1,14%) a las frecuencias medidas en toda la población CRC (media de 1,13%). Mientras que el IFN-γ-lanzamiento, medida directamente
ex vivo, respuestas anti-5T4 habilitados para ser detectados, no encontramos respuestas proliferativas a vigorosas 5T4, ya sea en pacientes con CRC o controles. Sin embargo, con varias rondas de re-estimulación y la adición de IL-2, hemos crecido las líneas 5T4-específica restringidos por HLA-DR (datos no mostrados).
(A) PBMC se purificaron y dos Las muestras preparadas: CMSP conjunto y PBMC agotado de CD25
hi células. (B) Total PBMC y CD25
hi-agotado PBMC de 11 controles emparejados por edad (barras blancas) y 14 pacientes con CRC (barras sólidas) fueron creados en paralelo en un ensayo ELISPOT de IFN-gamma (3,5 × 10
5 células /pocillo) con PPD (gráfico superior), HA (gráfico central) o 5T4 (gráfico inferior). El número de respondedores se muestra para cada antígeno. En cada caso, el porcentaje de la izquierda es la frecuencia de respondedores que aumentaron después de la depleción de Treg (Aumento), el porcentaje en el medio es la frecuencia de los no respondedores que tenían una respuesta después de la depleción (nueva respuesta) ya la derecha el frecuencia de respondedores que mostraron una disminución o ningún cambio en la respuesta después de la depleción Treg (disminución /NC). El 95% Intervalo de confianza para las diferencias pareadas de proporciones entre los pacientes y los controles es -0,83 a -0,22 revela una diferencia significativa para 5T4 respuestas. (C) Los 6 pacientes de CRC con respuestas a 5T4 se muestran en más detalle. Las barras representan las células formadoras de puntos /10
6 PBMC después de la sustracción de manchas de fondo, toda PBMC (gris claro) y PBMC CD25
empobrecido-hi (gris oscuro). La respuesta se observó sólo en CD25
hi-agotado PBMC de los pacientes 1-5, mientras que se observó una respuesta en ambas poblaciones PBMC de paciente 6. En todos los ensayos, los pozos se establecieron por duplicado.
Discusión
Se comparó la frecuencia de definir cuidadosamente CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras (Treg) en pacientes con CRC controles emparejados por edad sanos y pacientes con EII. CRC pacientes tienen una mayor frecuencia de Treg y no hay evidencia de que estos antitumorales respuestas inmunitarias diana Treg.
Se evaluó si los números mejoradas de Treg en pacientes con CRC correlacionados con la inmunosupresión general. Una combinación de ELISPOT ensayos y ensayos de proliferación de IFN-γ para monitorear las respuestas a la retirada antígenos PPD y HA, demostró respuestas igualmente robustas en pacientes con CRC y controles sanos, lo que indica que la respuesta inmune a los antígenos no tumorales son intacta en pacientes con CRC.
el patrón de reactividad inmune era notablemente diferente entre pacientes con CRC y controles sanos cuando la respuesta inmune a el antígeno onco-fetal asociada a tumores, 5T4, se compararon. Se observaron respuestas 5T4-específicas en una proporción de controles sanos, pero estas respuestas fueron en gran parte inalterada por el agotamiento de Treg. En contraste, se detectó una respuesta 5T4-específico en más de un tercio de los pacientes con CRC sólo después de la eliminación de Treg, lo que sugiere que los pacientes Treg en CRC suprimen la respuesta inmune específica del tumor. Este grupo de pacientes con CRC que demostraron respuestas anti-5T4 tras el agotamiento de Treg parecía tener frecuencias Treg similares en comparación con el grupo global CRC, aunque serán necesarios estudios más amplios para confirmar esto. Desde 5T4-respuestas no fueron desenmascarados por el agotamiento de Treg en controles sanos, estos datos también indican que las células Treg capaces de suprimir respuestas-5T4 específica desarrollan en respuesta al tumor. El mecanismo preciso por el cual esto ocurre no es clara en la actualidad, pero es posible que el entorno de citoquinas dentro del tumor promueve la generación de Treg reconocimiento de antígenos asociados a tumores. Informes recientes indican un papel de TGF en la expansión de Treg [24], [25]. En un modelo de tumor roedor se ha demostrado que sólo las células dendríticas (DC) de tumor de soporte pero no animales libres de tumor promover la proliferación de Treg. Curiosamente países en desarrollo de animales libres de tumor podría ampliar Treg, pero sólo si pre-incubaron con sobrenadantes de células tumorales. Estos efectos podrían ser inhibidos
in vitro
utilizando anticuerpos anti-TGF [26]. En conjunto, estos datos sugieren que Treg requiere tanto una estimulación y citocinas específicas de antígeno tumoral, tales como TGF con el fin de proliferar y suprimir las respuestas inmunes anti-tumorales.
5T4 es un candidato atractivo para vacunas contra el cáncer, ya que es se expresa en muchos tumores epiteliales. Sin embargo, este estudio sugiere que Treg reconocen el antígeno y, posiblemente, juegan un papel en la supresión de las respuestas anti-tumorales, presumiblemente en detrimento de la persona. Otros dos estudios han demostrado que Treg reconocer antígenos tumorales (LAGE-1 y RTA-1) en sujetos con melanoma [27], [28]. Es importante asegurar que las estrategias de vacunas que utilizan antígenos asociados a tumores no aumentar el brazo regulador del sistema inmune inhibiendo de este modo el potencial de inmunidad anti-tumor. Un enfoque puede ser para agotar Treg antes de la vacunación, como se ha demostrado recientemente para el carcinoma de células renales [29]. Será, por tanto, de gran interés para determinar en futuros estudios si una estrategia de este tipo dará lugar a respuestas clínicas medibles en pacientes con CCR.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer al Prof. Robert Newcombe, Departamento de Epidemiología, estadística y Salud Pública, Universidad de Cardiff para el asesoramiento estadístico.