Extracto
Se comparó el crecimiento de células de cáncer de pulmón en un
ex vivo en tres dimensiones (3D) modelo de pulmón y la cultura 2D para determinar qué imita mejor el crecimiento del cáncer de pulmón en pacientes . A549 células fueron cultivadas en un
ex vivo
pulmón modelo 3D y 2D en cultivo durante 15 días. Se midió el tamaño y la formación de nódulos tumorales y las células se cuentan después de 15 días. También teñidas las células /tejidos para Ki-67, y la caspasa-3. Se midió la metaloproteinasa de matriz (MMP) los niveles en el medio acondicionado y en el plasma sanguíneo de pacientes con adenocarcinoma de pulmón. nódulos tumorales organizadas con espacio vascular intacto formado en el
ex vivo
pulmón modelo 3D, pero no en la cultura 2D. Proliferación y apoptosis fueron mayores en el
ex vivo
modelo 3D de pulmón en comparación con la cultura 2D. Después de 15 días, había significativamente más células en el cultivo 2D que el modelo 3D. MMP-1, MMP-9 y MMP-10 fueron significativamente mayores en el
ex vivo
pulmón modelo 3D. No hubo producción de MMP-9 en la cultura 2D. Las muestras de los pacientes contenían MMP-1, MMP-2, MMP-9 y MMP-10. Las células de cáncer de pulmón humano cultivadas en
ex vivo
Formulario tipo de nódulos perfusable 3D que crecen con el tiempo. También produjo las MMP que no se hayan producido en la cultura 2D, pero vistos en pacientes con cáncer de pulmón humano. El
ex vivo
pulmón modelo 3D puede imitar más de cerca el desarrollo de la biología del cáncer de pulmón humano de la cultura 2D
Visto:. Mishra DK, Sakamoto JH, Thrall MJ, Baird BN, Blackmon SH , Ferrari M, et al. (2012) Las células de cáncer de pulmón humanas cultivadas en una Produce
Ex Vivo
pulmón modelo 3D metaloproteinasas de la matriz no se producen en Cultura 2D. PLoS ONE 7 (9): e45308. doi: 10.1371 /journal.pone.0045308
Editor: C. Effie Tsilibary, Centro Nacional de Investigación Científica Demokritos, Grecia
Recibido: 8 de Mayo, 2012; Aceptado: August 20, 2012; Publicado: 17 Septiembre 2012
Copyright: © Mishra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
conflicto de intereses:. los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos. MPK ha presentado una solicitud de patente para el modelo pulmonar ex vivo en 3D. La patente se titula "células neoplásicas cultivadas en biomatriz descelularizado." Contiene creación de la matriz descelularizado y creciendo las células neoplásicas en la matriz descelularizado en un biorreactor. También cubre la posible aplicación del modelo. No existe ninguna relación de empresa de la patente y los autores no han recibido ningún ingreso de la patente. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer
pulmón es la causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos [ ,,,0],1]. Hasta la fecha, no existe un tratamiento eficaz para los pacientes con cáncer de pulmón, y la tasa de supervivencia global a los 5 años no ha aumentado significativamente desde 1975, el 13% en 1975 y sólo el 16% en 2005 [1]. La falta de avance en la búsqueda de tratamientos eficaces para el cáncer de pulmón puede ser debido, en parte, a la falta de un modelo preciso que imita los procesos biológicos que se producen en pacientes con cáncer de pulmón. Bidimensionales cultivos celulares plato (2D) de Petri han proporcionado una gran comprensión de la capacidad de las células tumorales para crecer, pero no proporcionan información acerca de las complejas interacciones entre las células cancerosas y su entorno. Los modelos animales proporcionan pruebas definitivas para procesos particulares, pero a menudo hay una falta de correlación entre los resultados esperados y los observados, lo que puede deberse a los propios modelos [2]. Por otra parte, el crecimiento de tumores humanos y la respuesta al tratamiento farmacológico en modelos animales no siempre se correlacionan con los resultados de los ensayos en humanos [3] - [5]. Por otra parte, los modelos animales tardan varias semanas para proporcionar datos sobre los procesos biológicos. Como resultado,
in vitro y modelos 3D se han desarrollado a lo largo de los años como un intento de llenar la brecha entre las culturas tradicionales en 2D y modelos animales.
Actualmente hay dos tipos principales de
in vitro y modelos 3D en. El primer tipo lleva los
in vivo
tejidos de interés y los explantes y cultivos de ellos
in vitro
, que proporciona información sobre el crecimiento a corto plazo de los tejidos [6], [7]. El otro tipo crece células tumorales en un andamio matriz artificial 3D. Este
in vitro
modelo 3D utilizando Matrigel se ha demostrado ser superior a la cultura 2D usando una placa de Petri para el estudio de crecimiento del tumor [8] - [10]. Los cambios fisiológicos en las células cancerosas cultivadas en Matrigel son significativamente diferentes de las de los tumores crecer en cultivo 2D. Hay limitaciones, sin embargo, a la corriente
in vitro y modelos 3D. A pesar de que proporcionan un sustrato para los tumores que crecen en, el sustrato es un producto artificial que no se encontró por estas células en un entorno natural. Por otra parte, estos
in vitro
modelos 3D carecen de la presencia de vasculatura, lo que dificulta su capacidad para imitar el
in vivo
medio ambiente y mantener un comportamiento dinámico celular [5].
aquí, hemos caracterizado un
ex vivo
pulmón modelo 3D que se ha demostrado que producen crecimiento nódulos pulmonares perfusable [11]. A diferencia de la
in vitro
modelos 3D, nuestro
ex vivo
pulmón modelo 3D utiliza una matriz natural, que mantiene su homología entre las especies [12], y la matriz descelularizado forma una barrera entre el endotelio y espacios epiteliales [13]. Por lo tanto, las líneas celulares de cáncer de pulmón humano son capaces de formar nódulos pulmonares en este
ex vivo
modelo con vasculatura intacta [11], que supera las limitaciones con
y modelos in vitro 3D. Por otra parte, el
ex vivo
pulmón modelo 3D permite a las células crecer con el tiempo, lo que puede demostrar una condición dinámica que no se ve en
y modelos in vitro 3D. Se comparó el crecimiento de células de cáncer de pulmón humano en este
ex vivo
modelo 3D con que en una cultura 2D en las mismas condiciones de cultivo durante 15 días. Se encontraron diferencias significativas en la formación de nódulos tumorales, el número de células totales, las tasas de proliferación, las tasas de muerte celular y la producción de metaloproteinasas de matriz (MMP). Por otra parte, las células de cáncer de pulmón humanas cultivadas en el
ex vivo
modelo 3D de pulmón MMP producidas que se encuentran en muestras humanas, mientras que las células de la cultura 2D no lo hicieron.
Resultados
crecimiento celular y la formación de nódulos
En el
ex vivo
pulmón modelo 3D, el 96,3 ± 3,9% de las células A549 adheridas a la matriz pulmonar descelularizado después de 3 pases y la incubación durante 2 horas. Las células de cáncer de pulmón A549 cultivadas en las matrices de pulmón descelularizados de las 4 semanas de edad (3D -4 Wk) y ratas de 6 semanas de edad (3D) -6 Wk forman nódulos tumorales que crecieron en el período de 15 días. A lo largo del período de 15 días, hemos sido capaces de perfundir el modelo 3D con los medios de comunicación a las 6 cc por minuto. La distribución de los nódulos en la matriz fue aleatoria, pero el momento de su desarrollo era sobre todo uniforme, con pocos nódulos formando después día 6 para matrices de pulmón de ratas de 4 semanas de edad y día 2 para matrices de pulmón de 6 semanas de edad ratas. Significativamente se detectaron nódulos más grandes en las células de cáncer de pulmón A549 cultivadas en las matrices de pulmón descelularizados de las ratas 6 semanas de edad en comparación con los de las ratas 4 semanas de edad (p = 0,03, Fig. 1a). Sin embargo, los nódulos en las matrices de rata descelularizados de las 4 semanas de edad, las ratas fueron más denso (Fig. 1b) que los nódulos en las matrices de rata descelularizados de las 6 semanas de edad, las ratas (Fig. 1d). Se calculó la densidad de los nódulos pulmonares cultivadas en matrices descelularizados de las 4 semanas de edad, ratas y ratas 6 semanas de edad, dividiendo el número de las células en el día 15 dividido por el tamaño total nódulo en día 15. La densidad de los nódulos que crecen en la matriz pulmonar descelularizado de las 4 semanas de edad, las ratas (3,24 ± 0,24 millones de células /cm
2) fue significativamente más alto que la densidad de los nódulos que crecen en la matriz pulmonar descelularizado de la 6-de semana Las ratas viejas (1.12 ± 0.20 millones de células /cm
2, p = 0,02). La mayor densidad también fue evidente en la H & amp; E mancha del andamio. El H & amp; mancha E del nódulo pulmonar de las ratas de 4 semanas de edad, mostró la mayor parte del área cubierta por células grandes números con escasa superficie de las capas individuales del tumor (figura 1c.), Mientras que el nódulo pulmonar desde el 6 de semana ratas de edad mostraron grandes áreas con una sola capa de células tumorales (Fig. 1E). Por otra parte, no hay crecimiento de las células tumorales en el espacio vascular tanto en H & amp;. E con células tumorales en crecimiento alrededor de ella sin obstruir que
(a) Los nódulos tumorales aumentado de tamaño con el tiempo. nódulos significativamente mayores formados en la matriz pulmonar descelularizado de ratas 6 semanas de edad (3D - 6 Wk, n = 2) en comparación con las ratas de 4 semanas de edad (3D - 4 Wk, n = 2, p = 0,03). Los nódulos tumorales fueron más densa en las 4 semanas de edad, las ratas (b) que en las 6 semanas de edad, las ratas (d). El H & amp; E mancha (4X) del nódulo pulmonar de las ratas de 4 semanas de edad, mostró la mayor parte del área cubierta por el gran número de células con escasa superficie de las capas individuales del tumor (c) mientras que el nódulo pulmonar de la 6- semanas de edad ratas mostraron grandes áreas con capas individuales de las células tumorales (e). barra de error representa el error estándar de la media.
En la cultura 2D, las células A549 confluentes se convirtió en el día 5. Durante el período de 15 días, no hubo formaciones nodulares.
Estructura y celular Número
H & amp; e análisis del bloque de celdas a partir de la cultura 2D mostró ninguna organización (Fig, 2a), mientras que no hubo célula-célula y la organización matriz celular en el
ex vivo
3D modelo de pulmón, con vasculatura intacta (Fig. 2b). En el
ex vivo
3D modelo de pulmón, el número de células A549 cultivadas en los dos armazones de diferente tamaño después de 15 días no fue significativamente diferente: 32 ± 3 millones de células de la 4-semanas de edad, de rata en comparación con 27 ± 5 millones de células de la 6-semanas de edad, de rata (p = 0,45, Fig. 2c). Sin embargo, el número medio de células después de 15 días en el cultivo 2D (471 ± 70 millones) era aproximadamente 16 veces mayor que el número medio de células de la
ex vivo
modelo 3D (29 ± 3.000.000; p = 0,0007, la figura 2c)
Representante hematoxilina y eosina (H & amp;.. e) tinción de las células de (a) la cultura 2D y (b) el
ex vivo
pulmón modelo 3D . El H & amp; E de la
ex vivo
pulmón modelo 3D muestra las interacciones célula-célula y célula-matriz. (C) Hubo significativamente más células en el cultivo 2D (471 ± 70 millones, n = 3) que en el
ex vivo
pulmón modelo 3D (29 ± 3 millones, n = 4, p = 0,0007) . El número total de células en el 4 semanas de edad (32 ± 3.000.000, n = 2) y 6 semanas de edad (27 ± 5.000.000, n = 2) matrices de rata no fueron diferentes (p = 0,45). barra de error representa el error estándar de la media.
proliferación y la muerte celular
Las células A549 cultivadas en la cultura 2D (Fig. 3a) y
ex vivo
modelo de pulmón 3D (Fig. 3b) tiñe positivo para Ki-67. El porcentaje de células con Ki-67 tinción era mucho mayor en el
ex vivo
modelo 3D (23,8 ± 2,9%) que en el cultivo 2D (6,7 ± 0,9%, p & lt; 0,0001). Había muy pocas células en el cultivo 2D (Fig. 4a) que tiñe positivo para la caspasa-3, mientras que hubo muchas células en el
ex vivo
modelo 3D que manchaba positivo para la caspasa-3 (Fig. 4b ). Un porcentaje significativamente mayor de células en el
ex vivo
modelo 3D (5,5 ± 0,8%) se tiñeron positivas para la caspasa-3 en comparación con el cultivo 2D (0,1 ± 0,1%; p & lt;. 0,0001, Fig 4C).
Representante Ki-67 tinción de las células A549 cultivadas en (a) la cultura 2D y (b) el
ex vivo
pulmón modelo 3D. (C) Hubo significativamente más Ki-67 tinción en el
ex vivo
pulmón modelo 3D (23,8 ± 2,9%, n = 4) en comparación con el cultivo 2D (6,7 ± 0,9%, n = 3, p & lt ; 0,0001). barra de error representa el error estándar de la media.
Representante de la caspasa-3 tinción de las células A549 cultivadas en (a) la cultura 2D y (b) el
ex vivo
pulmón modelo 3D. (C) No fue significativamente más caspasa-3 tinción en el
ex vivo
modelo 3D (5,5 ± 0,8%, n = 4) que en la cultura 2D (0,1 ± 0,1%, n = 3, p & lt; 0,0001). barra de error representa el error estándar de la media.
MMP mRNA nivel en los modelos
Se ha producido significativamente más alta expresión de MMP-1 (p = 0,003) y MMP-2 (p = 0,01) en las células A540 cultivadas en el -4 Wk 3D en comparación con el -6 Wk 3D en el ARNm obtenido a partir de día 15 (Fig 5a & amp;. 5b). se observó y 3D -6 Wk (p = 0,0002) en comparación con el nivel de mRNA en 2D; Una expresión significativamente mayor de la producción de MMP-1, tanto en 3D -4 Wk (0,0001 p & lt). Esto también se observó con MMP-9 y MMP-10 expresión (Fig 5c & amp;. 5d). Para MMP-2, no fue significativamente mayor expresión en las células A549 cultivadas en el -4 Wk 3D (p = 0,006) en comparación con el nivel en 2D pero fue significativamente menor en las células A549 cultivadas en el -6 Wk 3D (p = 0,001) en comparación con el nivel en 2D (Fig. 5D).
No eran significativamente mayores niveles de MMP-1, MMP-9 y MMP-10 en las células A549 en el
ex vivo
modelos 3D en comparación con la cultura 2D. No fue significativa mayor nivel de MMP-2 de la expresión génica en 3D -4 Wk en comparación con el cultivo 2D sin embargo, no fue significativamente más bajo nivel de MMP-2 de la expresión génica en 3D -6 Wk en comparación con el cultivo 2D. barra de error representa el error estándar de la media.
MMP proteína de nivel en los modelos
Se detectaron MMP-1, MMP-2, MMP-9 y MMP-10 en el medios de comunicación de las células A549 cultivadas en el
ex vivo
modelo de pulmón 3D, mientras que sólo se detectaron MMP-1, MMP-2 y MMP-10 en los medios de las células A549 cultivadas en la cultura 2D. MMP-1, MMP-2, MMP-9 y MMP-10 no se detectaron en los medios de comunicación de la
ex vivo
pulmón modelo 3D sin células A549. Dado que no hay diferencia significativa en el número de células entre la cultura y el 2D
ex vivo
pulmón modelo 3D en el día 15, se calculó el nivel de proteína MMP por célula. Nos encontramos que había niveles significativamente más elevados de MMP-1, MMP-2, MMP -9 y MMP-10 por célula en el -4 Wk 3D y 3D -6 Wk en comparación con el cultivo 2D (Fig. 6).
(a) No fue significativamente mayor nivel de MMP-1, (b) MMP-2, (c) MMP-9, y (d) MMP-10 de producción por célula en el
ex vivo
modelos 3D en comparación con el cultivo 2D por célula. barra de error representa el error estándar de la media.
A continuación, se evaluó el nivel de MMP en distintos días en los medios de la 2D en comparación con el Wk -4 3D y el 3D -6 Wk. Los niveles de MMP en el
ex vivo
pulmón modelo 3D aumentaron durante los primeros 6 días del experimento. Aunque hubo más células en el cultivo 2D, había una cantidad significativamente mayor de MMP-1, MMP-9 y MMP-10 en el
ex vivo
modelo 3D de pulmón en comparación con el modelo 2D de todos los días, excepto para MMP-1 y MMP-10 plantas en el día 3 de 3D -4 Wk, que era similar al modelo 2D. No hubo una relación consistente entre los niveles de MMP-2 en el modelo 2D y los modelos 3D y 3D Wk -4 -6 semana durante diferentes días (Fig. 7).
(a) Hubo una significativamente mayor nivel de producción de MMP-1 en el
modelos ex vivo de pulmón
3D en comparación con la cultura 2D excepto el día de 3D -4 Wk 3 nivel de MMP-1, que era similar al nivel de 2D en el día 3. (b) Hay hubo una tendencia consistente entre los
modelos ex vivo de pulmón
en 3D y 2D para la cultura de MMP-2 niveles entre los diferentes días. (C) No hubo producción de MMP-9 en la cultura 2D y significativamente mayor producción de MMP-9 en el
ex vivo
pulmón modelo 3D. (D) Hubo significativamente más MMP-10 producido en el
modelos ex vivo de pulmón
3D en comparación con la cultura 2D excepto el día de 3D -4 Wk 3 nivel de MMP-10, que era similar al nivel en el día 3 para el cultivo 2D. barra de error representa el error estándar de la media.
MMP en pacientes
Se analizaron muestras de cuatro pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Ninguno de los pacientes tenía quimioterapia o la radioterapia preoperatoria. El tamaño tumoral medio fue de 2,6 ± 1,1 cm, y ninguno de los pacientes tenían afectación de los ganglios linfáticos. MMP-1, MMP-2, MMP-9 y MMP-10 se detectaron en la vena cava superior y las venas pulmonares de los especímenes lobectomía de los cuatro pacientes. Hubo un promedio de 11,8 ± 22,3 ng /ml de MMP-1, 40,4 ± 23,2 ng /ml de MMP-2, 41,6 ± 27,6 ng /ml de MMP-9 y 100,4 ± 128,5 pg /ml de MMP-10 en el el plasma de la sangre extraída de la vena cava superior. Hubo un promedio de 7,8 ± 13,8 ng /ml de MMP-1, 37,8 ± 19,9 ng /ml de MMP-2, 134,5 ± 83,3 ng /ml de MMP-9, y 105 ± 90,9 pg /ml de MMP-10 en el plasma de la sangre obtenida de las venas pulmonares de los especímenes lobectomía. Puesto que hay una gran variación entre los pacientes para el nivel de MMP, que normalizó el valor al nivel encontrado en la vena cava superior para cada paciente. Por último, comparamos los valores entre los pacientes. No hubo diferencia significativa entre MMP-1, MMP-2 y MMP-10 niveles, sin embargo, no fue significativamente mayor nivel de MMP-9 en la vena pulmonar en comparación con la vena cava superior (p = 0,02, Fig. 8). niveles
MMP están normalizados a nivel encontrado en la vena cava superior (VCS). No hubo diferencia significativa en los niveles de MMP entre el SVC y la vena pulmonar para MMP-1 (p = 0,03), MMP-2 (p = 0,9) y MMP-10 (p = 0,6). No hubo aumento significativo en los niveles de MMP-9 en la vena pulmonar en comparación con la vena cava superior (p = 0,02).
Discusión
Las células A549 cultivadas en el
ex vivo
modelo de pulmón 3D fueron más similares a las células de cáncer de pulmón que crecen en los pacientes que las células A549 cultivadas en cultivo 2D. Como hemos demostrado anteriormente [11], las células A549 cultivadas en los
ex vivo
modelo 3D de pulmón nódulos formados, pero las células que crecen en cultivo 2D no lo hicieron. El sello distintivo de cáncer de pulmón es la formación de un nódulo pulmonar que puede ser detectado clínicamente con formación de imágenes tal como una radiografía de tórax o tomografía computarizada [14]. Estos cánceres de pulmón crecen con el tiempo y la metástasis a los ganglios linfáticos y otros órganos. El
ex vivo
pulmón modelo 3D mostró la formación de nódulos y el crecimiento con el tiempo, pero la cultura 2D no lo hizo. Por otra parte, se detectaron nódulos más grandes cuando se utilizó una matriz de pulmón descelularizado más grande en el experimento. La razón probable de esta diferencia es que el tamaño del nódulo está limitada por el área de superficie de la matriz pulmonar descelularizado. Por otra parte, las células A549 forman nódulos más densos en la matriz de pulmón más pequeño que en la matriz de pulmón más grande, y el número total de células después de 15 días de crecimiento en el
ex vivo
pulmón modelo 3D no fue diferente entre los dos tamaños de matriz pulmonar decellularlized. Esto sugiere que los nódulos más grandes y menos densas que crecen en las matrices de pulmón descelularizados de las ratas de 6 semanas de edad, tenían un número similar de células como los nódulos más pequeños y densos cultivan en las matrices a partir de las 4 semanas de edad ratas. Independientemente del tamaño de la matriz pulmonar descelularizado usado en el experimento, se produjo la formación de nódulos del tumor y los nódulos aumentó con el tiempo.
Hubo significativamente más remodelación tumor de las células A549 cultivadas en el
ex vivo
pulmón modelo 3D en comparación con las cultivadas en la cultura 2D. Después de 15 días, se encontró que un número mucho mayor de células en el cultivo 2D que en el
ex vivo
modelo de pulmón 3D. El crecimiento de las células en el cultivo 2D estaba limitada por el espacio, mientras que el crecimiento de las células en el
ex vivo modelo de pulmón
3D parece haber sido limitado por factores distintos de espacio, ya que el uso de un pulmón descelularizado más grande matriz no aumentó el número total de las células al final del experimento. En el
ex vivo
pulmón modelo 3D, las células tumorales forman nódulos en ciertos lugares de la matriz, y una vez que los nódulos formados, aumentaron en tamaño, con unos nódulos que forman adicionales durante el período de 15 días. Esto sugiere la proliferación de células en áreas de crecimiento favorable y la muerte celular en las zonas de crecimiento desfavorable. Esto se evidenció mediante el análisis de Ki-67, que es un marcador de la proliferación, y la caspasa-3, que es un marcador de la muerte celular. Hubo una cantidad significativamente mayor de la proliferación celular y la muerte celular en el
ex vivo
modelo de pulmón 3D en comparación con el cultivo 2D. Esta remodelación se produjo en el contexto de las células tumorales se organizan con las interacciones célula-célula y célula-matriz que sólo se ven en un
in vivo
ajustar [11].
Los factores que pueden contribuir a la formación de condiciones favorables para el crecimiento nódulo tumoral incluir nutrientes de los medios de comunicación y los bolsillos de la hipoxia creadas por el modelo [15]. Las células cancerosas probablemente se formarán nódulos en las áreas que son ricos en nutrientes, lo que puede permitir que las células crecen mejor que en las zonas con baja perfusión; Así, las células en las áreas ricas en nutrientes más cerca de los vasos sanguíneos pueden tener una mayor proliferación de las de las zonas con menos de perfusión. La capacidad de la
ex vivo
pulmón modelo 3D para imitar esta condición hace que sea un mejor modelo de la
in vivo
medio ambiente que la cultura 2D.
Además, el
ex vivo
pulmón modelo 3D puede imitar el
in vivo
entorno mejor que
in vitro
modelos 3D (como el cultivo de células de cáncer de pulmón en Matrigel), ya que mantiene un vascular espacio, tiene la arquitectura natural de un órgano perfusable, y lo más importante, la composición de la matriz se mantiene entre las especies [12]. Estas dos características son el aspecto más importante de la
ex vivo
modelo 3D. El espacio vascular intacta es resultado de la creciente las células tumorales en la matriz acelular. Como se crea la matriz acelular a través del proceso de descelularización, donde se conserva la membrana basal y mantiene la integridad del espacio vascular y del espacio epitelial. El proceso de descelularización elimina las células endoteliales del espacio vascular y las células epiteliales y mesenquimales del espacio epitelial. Las células tumorales se colocan en el espacio epitelial a través de la tráquea y los medios de comunicación se bombea a través del espacio vascular. A medida que el tumor crece y forma nódulos, que preserva el espacio vascular. Si el tumor destruye el espacio vascular entonces los medios de comunicación no sería capaz de bombear a través del andamio en 6 cc por minuto. A lo largo de los 15 días, no tuvimos ningún problema perfusión del nódulo tumoral. Así, el modelo crea nódulo tumoral perfusable. No hay otro modelo que pueda llevar los nutrientes y eliminar los factores secretados como este modelo. Por otra parte, a diferencia de
in vitro
modelos 3D que se basan en una matriz artificial, la composición de la matriz utilizada en el
ex vivo
pulmón modelo 3D es la composición que se ve más probable es que el cáncer de pulmón las células en el
in vivo
medio ambiente. A medida que la señalización de células y su comportamiento dependen de la composición y la rigidez de la matriz extracelular [9], [16], [17], el comportamiento de las células tumorales se pueden representar con mayor precisión por el
ex vivo
3D de pulmón modelo.
Además de la formación de nódulos tumorales perfusable, las células A549 cultivadas en el
ex vivo
pulmón modelo 3D producida MMP-9 que es producida por las células de cáncer de pulmón en los pacientes. MMPs son una familia de endopeptidasas dependientes de cinc que juegan un papel clave en la invasión de células tumorales, migración y metástasis mediante la degradación de la matriz extracelular (ECM) y la membrana basal [18]. ECM es una red compleja de macromoléculas como el colágeno, proteoglicanos, laminina, fibronectina, y muchas otras glicoproteínas. El ARNm de la MMP también se han detectado en las células tumorales que crecen en el
ex vivo
modelo 3D en el día 15. Por otra parte, se encontró que la MMP-1, MMP-2, MMP-9 y MMP-10 en los medios de comunicación de la
ex vivo
modelo de pulmón 3D, así como en el suero de las muestras de sangre de la vena cava superior y las venas pulmonares de los especímenes de cáncer de pulmón lobectomía. La vena pulmonar es la primera embarcación importante encontrado por la proteína secretada desde el cáncer de pulmón, que llevará a cabo la mayor concentración de las proteínas secretadas por el cáncer. Por otra parte, la vena cava superior contiene sangre que viaja a la arteria pulmonar que va a los pulmones con el tumor. Por lo tanto, la MMP que probablemente es producida por el tumor debe tener mayor concentración en la vena pulmonar y la concentración más baja de la vena cava superior. Entre los cuatro MMPs estudiados, se encontró que la MMP-9 es la única proteína que se reunió este criterio. MMP-9 fue encontrado en los medios de comunicación de la
ex vivo
pulmón modelo 3D, mientras que no se encontró en la cultura 2D. Nuestro estudio confirma la anterior conclusión de que las células A549 no producirán MMP-9 en una cultura 2D [19]. MMP-9 desempeña un papel importante en la degradación de colágeno de tipo IV, que es una proteína estructural principal de las membranas de ECM y de sótano. Séricos elevados niveles de MMP-9 se ha demostrado que se correlaciona con una baja supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón [20], [21]. Por lo tanto, la presencia de MMP-9 en el
ex vivo
pulmón modelo 3D sugiere que imita
in vivo
condiciones mejores que la cultura 2D.
La fuerza de la estudio actual está mostrando cómo pulmón humano las células cancerosas se comportan de 2D en comparación con el
ex vivo
modelo 3D utilizando el mismo número de células y utilizando el mismo medio de cultivo. Una debilidad de este estudio es que no fuimos capaces de comparar el modelo
ex vivo
3D a los
y modelos in vitro 3D. No fuimos capaces de cultivo de 25 millones de células en un Matrigel para proporcionar una comparación debido a las limitaciones técnicas de
in vitro y modelos 3D. Sin embargo, hemos sido capaces de mostrar características de la
ex vivo
modelo 3D que no se ve en el
in vitro
modelos 3D como el crecimiento de los nódulos tumorales y preservación del espacio vascular.
en general, las células de cáncer de pulmón humanas cultivadas en el
ex vivo
modelo 3D de pulmón tenían características que imitan el crecimiento del cáncer de pulmón y metástasis en los pacientes, mientras que las células que crecen en cultivo 2D no lo hicieron. Las células de cáncer de pulmón humanas cultivadas en los
ex vivo
3D modelo de pulmón formado nódulos tumorales perfusable, con proteínas secretadas que son importantes para el crecimiento tumoral y la metástasis. Por lo tanto, la
ex vivo
modelo de pulmón 3D puede ser un modelo mejor con el que estudiar el crecimiento del cáncer de pulmón y metástasis de la cultura 2D y, posiblemente, otros
modelos in vitro
3D.
Materiales y Métodos
obtenido el consentimiento informado por escrito de los pacientes para determinar los perfiles de secretoma en la sangre. Los experimentos que involucran pacientes fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Metodista Instituto de Investigación (IRB (2) 0.811-0.142). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con todas las leyes, reglamentos, lineamientos y políticas que rigen el uso de animales de laboratorio en la investigación. Los protocolos de los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Metodista Instituto de Investigación (AUP-0910 hasta 0018).
muestras de pacientes
Los pacientes que fueron sometidos a una lobectomía para cáncer de pulmón dio consentimiento para que la sangre tomada de la vena cava superior y la vena pulmonar de la pieza operatoria. También se obtuvo información demográfica del paciente y los resultados de patología para la muestra. Después paciente tenía un lugar vía central, nos eliminado aproximadamente 10 ml de la línea central ubicado en la vena cava superior en un BD Vacutainer con K
2 EDTA (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.. Luego, después de que el espécimen era retirado del paciente, se identificó la vena pulmonar. Hemos eliminado aproximadamente 10 ml de sangre de la vena y la colocó en un BD Vacutainer con K
2 EDTA (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). se diluyó la muestra con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 01:01, y luego, la muestra se estratificó en 18 ml de medio de separación de linfocitos y se centrifugó a 2200
g
en una centrífuga durante 20 minutos la concentración de MMP del plasma. capa se determinó usando un Luminex (Luminex, Austin, TX, EE.UU.) de ensayo se describe a continuación.
Cell Cultura y
El alveolar basal A549 línea celular de adenocarcinoma epitelial humana se obtuvo de la American Type Culture Collection ( Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en 525 cm
2 frascos de cultivo celular (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) en completa los medios de comunicación a partir de RPMI 1640 (Hyclone, Sur Logan, UT, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) y antibióticos (100 UI /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 0,25 mg /ml de anfotericina; MP Biomedicals, Solon, OH, EE.UU.) a 37 ° C en 5% de CO
2. Una vez que las células eran 85% confluentes, se lavaron con PBS y se sometieron a tripsinización utilizando tripsina al 0,25% (Cellgro, Manassas, VA, EE.UU.) para recoger las células de los matraces. Las células se lavaron con medio y finalmente se suspendieron en 30 a 50 ml de medio completo.
Ex vivo
3D Modelo de pulmón
Hemos creado el
ex vivo
pulmón modelo 3D como se describe anteriormente [11]. Utilizamos matrices pulmonares descelularizados a partir de (n = 2) y 6 semanas de edad (n = 2) ratas 4 semanas de edad. Las matrices de pulmón de ratas descelularizados 4 semanas de edad fueron significativamente menores que los de ratas 6 semanas de edad. Nos pusieron a 25 millones de células A549 diluidos en 50 ml de medio completo a través de la tráquea del
ex vivo
modelo 3D de pulmón (n = 4). Se recogieron los medios de comunicación que pasivamente salió del modelo en un recipiente de 500 ml, pasamos de nuevo a través de la tráquea tres veces, y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas para permitir la unión celular. A continuación, las células se cuentan en el recipiente y se determinó el porcentaje de células tumorales se sembraron a la
ex vivo
pulmón modelo 3D. Nos hicimos un 200 ml adicionales de medio completo en el biorreactor se describe anteriormente [11] y los medios puedan pasar por la bomba a 6 ml por minuto y luego a través del oxigenador y la arteria pulmonar del
ex vivo
pulmón modelo 3D. También realizamos un control
ex vivo
3D modelo de pulmón donde cambiamos 200 ml de medio completo en el biorreactor diaria sin colocar cualquier célula en el modelo. Hemos recogido los medios de comunicación todos los días desde el envase de 500 ml y se centrifugan los medios de comunicación utilizado a 400
g
durante 5 minutos y salvos 10 ml de sobrenadante para el análisis secretoma. Hemos sustituido los medios de comunicación se utiliza con medio fresco cada día durante 15 días. Cada dos días, se analizó el
ex vivo
pulmón modelo 3D para la presencia de nódulos. Se calculó la superficie por nódulo y se añadirán todas las áreas de nódulos obtener el tamaño total de nódulos según el modelo. Después de 15 días, alrededor de 5% de la
ex vivo
modelo de pulmón 3D se retiró y se fijaron en formalina al 10% para hematoxilina y eosina (H & amp; E), Ki-67, y el ensayo de la caspasa-3. A continuación, creó una suspensión de células del resto del pulmón mediante el uso de avería mecánica seguida de la degradación enzimática con colagenasa y dispasa a 37 ° C durante 45 minutos. Nos centrifugaron las células a 400
g
durante 5 minutos y se resuspendió el sedimento en 1 ml de medio; las células se contaron usando el contador automático de células TC10 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Cultura y 2D
Nos pusieron a 25 millones de células A549 en un 525 cm