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PLOS ONE: Las variantes del gen PPARd y su significado clínico-patológica en Cáncer Colorrectal


Extracto

Antecedentes

peroxisoma proliferador activado del receptor delta (PPARd) es de receptores hormonales nucleares implicados en el cáncer colorrectal diferenciación y progresión (CRC). El propósito de este estudio fue determinar la prevalencia y el espectro de variantes en el
PPARd
gen en el CCR, y su contribución a criterios de valoración clínico-patológicos.

métodos y las conclusiones

La secuenciación directa de la
PPARd
de genes se realizó en 303 tumores primarios, en muestras de sangre de 50 pacientes con ≥ 3 familiares de primer grado afectados, 50 pacientes con 2 afectadas familiares de primer grado, 50 pacientes esporádicos, 360 controles sanos, y en 6 líneas celulares de cáncer de colon. El análisis de mutaciones reveló 22 ​​diferentes transversiones, 7 de ellos eran novela. Tres de todas las variantes eran somática (c.548A & gt; G, p.Y183C, c.425-9C & gt; T, y c.628-16G & gt; A). Dos mutaciones sin sentido (p.Y183C y p.R258Q) fueron patogénicos utilizando
in silico
programa predictivo. Cinco variantes recurrentes se detectaron en /junto a los exones 4 (c.1-87T & gt; C, c.1-67G & gt; A, c.130 + 3G & gt; A, y c.1-101-8C & gt; T) y el exón 7 (c.489T & gt; C). Variante c.489C /C detectada en los tumores se correlaciona con peor diferenciación (
P = 0,0397
).

Conclusiones

Hemos encontrado 7 nuevas variantes de entre 22 heredada o adquirida
PPARd
variantes. Somáticas y /o cambio de sentido variantes detectadas en pacientes con CCR son raros, pero indican la importancia clínica de la
PPARd
gen

Visto:. Ticha I, Gnosa S, Lindblom A, T Liu, Sun XF (2013) las variantes de la
PPARd
génica y su significado clínico-patológica en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (12): e83952. doi: 10.1371 /journal.pone.0083952

Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón

Recibido: 17 Septiembre, 2013; Aceptado: 10 de noviembre de 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Ticha et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación: Conceder una ayuda : Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación sueca del cáncer, Consejo Sueco de Investigación, y por el Consejo de Investigación de la Salud en el sureste de Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a nivel mundial, el diagnóstico de cáncer colorrectal (CCR) ocupa el segundo lugar en las mujeres y la tercera en los hombres, y es la cuarta causa más común de mortalidad por cáncer. Por otra parte, la tasa de incidencia de CCR está en aumento [1]. La patogénesis de la CRC es complejo y todavía no se entiende completamente. CRC se piensa que es un proceso de múltiples pasos que implican una acumulación de aberraciones genómicas, insuficiencia de apoptosis, y anormalidades de múltiples vías de señalización [2]. Un reciente estudio de familias suecas afectadas por CRC demuestra el efecto significativo de los antecedentes genéticos de pacientes con CRC familiar [3]. Esos genes implicados en la iniciación y progresión de CRC son limitadas. genes de baja penetrancia pueden desempeñar un papel importante en la tumorigénesis colorrectal y necesitan ser identificados.

Durante la última década, se ha prestado gran atención a la investigación de la función de los peroxisomas delta del receptor activado por el proliferador (PPARd) en el CCR [4]. Anteriormente, grupo de investigación de Sun realiza ARNm y análisis de proteínas en tejidos y líneas celulares de CRC, lo que sugiere un papel inhibitorio de PPARd en la tumorigénesis de colon [5] - [8]. Harman
et al
. [9] proporcionado pruebas de que también es fuerte PPARd atenúa la carcinogénesis de colon, utilizando modelos de ratones genéticamente modificados. En concreto, PPARd promueve la diferenciación e inhibe la proliferación celular, que es apoyada también por otros [10]. Además, Sun y colaboradores encontraron una correlación entre la expresión más alta de PPARd y la supervivencia favorable en pacientes con cáncer rectal [6].

Este factor de transcripción activados por ligando pertenece a la superfamilia de receptores de hormonas nucleares, y se codifica por el gen
PPARd gratis (MIM#600409) que tiene nueve exones, cinco de ellas son la codificación, y se extiende por alrededor de 85 kb en el cromosoma 6p21.2 [11]. PPARd puede ser activado por los ácidos grasos y sus derivados, y su expresión es relativamente alto en el tracto gastrointestinal en comparación con otros tejidos [12]. PPARd ha demostrado estar involucrados en la regulación del metabolismo de lípidos y la glucosa y los trastornos relacionados [13] - [15], y se considera un objetivo prometedor fármaco para el tratamiento de enfermedades del síndrome metabólico [16]

A pesar. el consenso emergente de que PPARd es un jugador clave en el CCR, los resultados divergentes complicar el papel específico en la tumorigénesis. Ya sea PPARd tiene un papel en promover o inhibir la carcinogénesis colorrectal sigue siendo objeto de debate [17], [18]. variantes genéticas en el
PPARd
gen podría ser responsable de estos resultados controvertidos y hasta la fecha el papel de
PPARd
variantes en CRC no se ha investigado. Sólo unos pocos estudios investigaron la relación entre los polimorfismos en el
PPARd
gen y las características del metabolismo de lípidos e hidratos de carbono [19], [20]. Codificación de los exones 4 a 9 de la
PPARd
gen se secuenciaron en el amplio análisis del genoma humano de mama y colorrectal [21], [22]. Sin embargo,
PPARd
que no fue validado como candidato gen del cáncer en estos análisis. Variante c.489T & gt; C (rs2076167) se encierran en una búsqueda de alelos candidatos susceptibles de CRC, pero no hubo correlación con el riesgo de CCR fue encontrado [23]

PPARd se ha demostrado que participan en el desarrollo de CCR. por nuestro grupo y otros. Sin embargo, la importancia de la
PPARd
alteraciones genómicas en CRC no se ha abordado plenamente. Los objetivos del presente estudio fueron (
i
) para determinar la frecuencia y el espectro de variantes en el
PPARd
gen en cuatro diferentes cohortes de pacientes con CRC incluyendo 303 muestras de tejido de CRC, y 150 muestras de sangre de 50 pacientes con CCR esporádicos, 50 pacientes con 2 afectadas familiares de primer grado, y 50 pacientes con ≥3 hereditarias afectados familiares de primer grado, y (
ii
) para evaluar la posible relación de variantes con clinicopatológica variables. Seis líneas celulares de cáncer de colon humano, comúnmente utilizados como
in vivo
modelos de cáncer de colon en el laboratorio del Sol y de los demás, se incluyeron en este estudio.

Materiales y Métodos

Ética declaración

Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Linköping, Suecia y el Instituto Karolinska, Suecia.

pacientes y controles sanos

Este estudio incluyó tejido CRC primaria, y, cuando esté disponible, la mucosa normal distante de los portadores de la
PPARd
variante de 303 pacientes (grupo I) diagnosticados en los hospitales de la Universidad de Linköping y en el hospital Vrinnevi en Norrköping. El tejido se recogió durante la cirugía primaria entre 1989 y 2004, y se almacena -70 ° C. Las muestras de sangre no estaban disponibles para esta cohorte. Además, las muestras de sangre de pacientes con CRC no relacionados: familiares de primer grado 50 pacientes esporádicos CRC (grupo II), 50 pacientes con 2 afectadas (grupo III), 50 pacientes hereditarias con 3 o más afectados familiares de primer grado (grupo IV) y 360 controles sin cáncer, fueron examinados. Se obtuvieron las muestras de sangre (grupo II-III) entre 2004 y 2009 a partir de 14 hospitales diferentes en Suecia media. Para estimar la frecuencia de población de los
PPARd
variantes, controlar subgrupos diferentes al cáncer, que comprende los donantes de sangre reclutadas durante el año 2010 de la región de Uppsala de Suecia, se utilizaron. Ambos casos y controles eran de ascendencia europea y de Suecia. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del donante o de los familiares para el uso de sus muestras con fines de investigación. Características de los pacientes y los controles se muestran en la Tabla 1. Los tumores con mejor diferenciación incluyó bien y moderadamente diferenciados los tumores, y peor diferenciación incluyen el carcinoma pobremente diferenciado, mucinoso o de células en anillo de sello. los datos de diferenciación del tumor no se pudieron obtener los grupos II a IV.

se realizó Líneas Celulares

El análisis de mutaciones también en 6 líneas celulares de cáncer de colon de uso común. Las líneas de células SW480 y SW620 se obtuvieron de American Type Culture Collection. línea celular SW480 se estableció a partir de un adenocarcinoma de colon primario, y el SW620 de una metástasis de los ganglios linfáticos, tomada del mismo paciente un año más tarde [24], [25]. El KM12C, líneas celulares y KM12SM KM12L4a fueron amablemente proporcionados por el Prof. I.J. Fidler (M. D. Anderson Cancer Center de Houston, TX) [26], [27]. El KM12C se deriva de un paciente con cáncer de colon en estadio II. El KM12SM es una metástasis hepática espontánea surgido a partir de la inyección de KM12C en el ciego de ratones desnudos. KM12L4a, una metástasis hepática experimental, se produce por repetida inyección intra-bazo y la cosecha de las metástasis de hígado en ratones desnudos. La línea celular de cáncer de colon HCT-116 fue una especie de regalo del profesor B Vogelstein (el centro de la celda de núcleo, de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD) [28], [29]. Las líneas de células SW480, SW620, KM12C, KM12SM y KM12L4a se cultivaron en medio de Eagle esencial mínimo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y la línea celular HCT-116 en McCoys5A (Sigma Aldrich), complementado con 10% inactivado por calor fetal albúmina de suero bovino (GIBCO, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 0,5% de L-glutamina (GIBCO), 1% de penicilina y cóctel de estreptomicina (GIBCO) a 37 ° C y 5% de CO
2 en incubador humidificado. Para la solución de vitaminas 2% de células KM12 (GIBCO) se añadió. Las células se recogieron a 80% de confluencia.

El aislamiento de ácidos nucleicos a partir de tejidos, líneas de sangre y de células

ADN fue aislado de tejido fresco congelado tumor, las líneas celulares y la sangre entera periférica usando procedimientos estándar la aplicación de Asistente Sistema de purificación de ADN genómico (Promega, Madison, WI) o DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN total de muestras de tejidos particulares y las células cultivadas se aisló utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

análisis de mutación

La región de codificación de la
PPARd
gen se proyectó por PCR y secuenciación directa de ADN Sanger en 203 tumores, 150 muestras de sangre de pacientes con CRC (grupo II-IV), y 6 líneas de células. Debido al tiempo y la eficiencia de costes, las muestras adicionales 100 tumorales, así como controles fueron seleccionados en dos regiones alteradas con más frecuencia que abarcan los exones 4 y 7. La adenina de codón de iniciación de la traducción es 102 base del exón 4. Por lo tanto los exones 4-9 y adyacente intrónica secuencias del gen
PPARd
fueron amplificados utilizando FastStart High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Alemania) según las instrucciones del fabricante. BigDye Terminator
v
3.1 Reaction Mix Ready (Applied Biosystems, Foster City) se utilizó para la reacción de secuenciación y la separación se realizó en ABI 3500 analizador genético (Applied Biosystems). Los datos recogidos se analizaron usando software analizador de secuencias (Applied Biosystems). cebadores diseñados utilizados para la amplificación y análisis de secuenciación se muestran en la Tabla S1. Cada mutación o sospechosas fragmentos fueron verificadas por otra secuencia de amplificación y análisis de PCR independientes.

análisis de PCR con transcriptasa inversa utilizando alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems) se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante en 3 cajas de transporte variantes c.130 + 3G & gt; A y c.1-101-8C & gt; T con ARN disponible de tumor y el tejido normal correspondiente. Un fragmento de ADNc de 856 pb bordeada por los cebadores RP_01 /02F 5'-CAGTGTTGTACAGTGTTTTG-3 'cruce cruce de los exones 1 y 2, y PRD_08R 5'-TCTGCCTGCCACAATGTCTC-3' situados en el exón 8 se amplificó por PCR y se secuenciaron directamente (Fig. 1) . El mismo fragmento de ADNc fue secuenciado en SW480, SW620, KM12C, KM12SM, y las líneas celulares KM12L4a

análisis de secuenciación Representante de ADNc aislado de la mucosa normal del portador de variantes c.130 + 3G & gt;. A (intrón 4) y c.1-101-8C & gt; T (intrón 3) muestra que falta del exón 4; en peso - secuencia de tipo salvaje, mut - secuencia mutada. unión exón está indicada por
línea discontinua
. Exon 3 estaba ausente en tanto de tipo salvaje y el alelo mutado.

nomenclatura de las mutaciones

Las mutaciones fueron descritas de acuerdo con el sistema de nomenclatura recomendada por el Genoma Humano Variación Sociedad (vehículos pesados) [30 ]. Designación de las alteraciones genómicas en el
PPARd
gen se basa en las secuencias de referencia GenBank NG_012345.1 y NM_001171818.1. Las mutaciones que no se encontraron en la literatura, la base de datos de polimorfismo de nucleótido único (dbSNP, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/, acceder el 8 de agosto de 2013) [31], o en el Catálogo de las mutaciones somáticas en el cáncer (COSMIC, http://www.sanger.ac.uk/cosmic, consultado el 8 de agosto de 2013 [32], fueron considerados como novela. Hay inconsistencia en la descripción de las variantes c.1-87C & gt ; T (rs2016520) en la región 5 'no traducida (UTR) del exón 4, y sinónimo c.489C sustitución & gt; T (rs2076167; p.N163) en el exón 7. de acuerdo con la secuencia de referencia GenBank (NCBI) el alelo de tipo salvaje es C, pero según la determinación del genotipo en el grupo de control (Tabla 2) el alelo C es de menor importancia para ambas variantes. es en concordancia con otros dos estudios que realizó genotipificación incluyendo estos dos polimorfismos en cohortes más grandes [15], [19] . Es de destacar que Skogsberg
et al
[15] llamado variante c.1-87T & gt;.. C, + 294T /C la presente, por nombrar estas variantes c.1-87T & gt; C y c.489T & gt; C.


in silico
Herramientas de Predicción para evaluar el impacto de sentido erróneo detectado variantes

para la evaluación de la importancia funcional de variantes missense detectado que empleamos varios ampliamente utilizados
In silico
programas de predicción. Estos programas sugieren la posible interferencia con la función biológica y la estabilidad de la proteína: SIFT como parte del programa comercial Alamut 2.0 (Interactive Biosoftware, Roven, Francia), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php), Alinear GVGD (http://agvgd.iarc.fr), mutación Catador (http://www.mutationtaster.org), Müpro ( http://mupro.proteomics.ics.uci.edu).

análisis estadísticos

los análisis se realizaron utilizando el STATISTICA 10 (SatSoft, Tulsa, OK). Se aplicó la prueba de chi-cuadrado para determinar la relación entre los gastos de
PPARd
variantes y variables clínico, para evaluar las diferencias en las frecuencias de alteraciones entre los grupos II-IV y controles, y para poner a prueba la distribución de genotipos en los controles para una equilibrio de Hardy-Weinberg. Modelo de riesgo proporcional de Cox se utilizó para probar la relación entre las variantes PPARd y la supervivencia de los pacientes, y se utilizó el método de Kaplan-Meier de las curvas de supervivencia. Todas las pruebas fueron de dos caras, y un
P
-valor inferior a 0,05 fue considerado significativo.

Resultados

Variantes de la
PPARd
génica en los pacientes de CRC, los controles sanos, y líneas celulares

análisis de la secuencia de ADN directa de la
PPARd
gen demuestra 22 variantes de un solo nucleótido diferentes, de los que 5 eran recurrentes y 7 eran nuevas variantes (Tabla 2 y 3). La frecuencia de cinco recurrente
PPARd
variantes en diversos cohortes de pacientes de CRC, los controles sanos, y las líneas celulares se muestran en la Tabla 2. distribuciones genotípicas de las variantes de nucleótido único recurrentes hereditarias fueron consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg (datos no mostrados ). Todas las variantes detectadas fueron las transiciones (4 missense, 3 en silencio, y 15 variantes no codificantes). Para evaluar los efectos predichos de missense variantes en función de las proteínas, seis
In silico
herramientas de predicción se utilizaron. De hecho, p.Y183C mutación somática y mutación p.R258Q se clasificaron como nocivo (Tabla 4).

recurrente
PPARd
variante en relación con las variables clinicopatológicas

Asociación de variantes recurrentes con las características clínico-patológicas, incluyendo el género, la edad, la localización del tumor, el estadio y la diferenciación, se investigó. c.489C Variante /C fue significativamente relacionados con la diferenciación peor comparar a T /C y genotipos T /T (
P = 0,0397
, Tabla 5). Los datos clínico-patológicas de los pacientes con la variante detectada c.489C /C se muestran en la Tabla S3.

No hubo una relación significativa de la recurrente
PPARd
variantes con otras variables clinicopatológicas incluyendo el género , edad, localización y estadio del tumor. (
P Hotel & gt; 0,05, datos no mostrados)

Caracterización del recurrente
PPARd
variantes

En total, 196 variantes de 106 (35%) pacientes de los pacientes de cada grupo II, 45 variantes de cada 22 (44%) de los pacientes de cada grupo III, y 22 variantes en 11 el grupo I, 28 ejecuciones en 17 (34%) (22% ) se detectaron pacientes fuera del grupo IV. Cinco alteraciones recurrentes de la línea germinal (Tabla 2), cuatro situadas en o adyacente al exón 4 (c.1-87T & gt; C, c.1-67G & gt; A, y las variantes c.130 conjunta + 3G & gt; A y c.1-101 8c & gt; T) y uno en el exón 7 (c.489T & gt; C) representaron gran mayoría de todas las variantes identificadas, y con frecuencia se produjeron juntos sin un patrón estricto de la combinación de variante. La mayoría de los portadores de al menos un C-alelo menor en la posición de c.1-87 en 5'-UTR también eran portadores de al menos un C-alelo menor en la posición c.489. Los portadores de la variante c.1-67G & gt; A en 5'-UTR del exón 4 lleva también otra variante, ya sea c.489T /C o c.489C /C, excepto de un caso (grupo II) con las variantes c. 1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; A. El intrónica línea germinal variantes c.1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; A, situada ocho pares de bases aguas arriba y aguas abajo de 3 pares de bases del exón 4, respectivamente, siempre se produjeron juntos. Todos los pacientes y controles con estas variantes eran portadores de la variante heterocigota c.489T /C, a excepción de dos pacientes (grupo II) - quien lleva variantes c.489C /C y c.1-67G /A, y un portador de la variante c .1-67G /a.

análisis de la mutación en muestras de sangre mostró que la cantidad de los pacientes portadores de alteraciones heredadas fueron menores en el grupo IV comparación con los grupos II y III combinados (
P = 0,037
), mientras que no se observó ninguna diferencia entre el grupo II y III (
P
= 0,305; Tabla 2). La frecuencia de las variantes recurrentes en los exones 4 y 7 no difirió significativamente entre la población control y subgrupos II, III o IV, con excepción variantes conjuntos c.1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; A, que se encuentra en 10% de los pacientes en el grupo III en comparación con el 2,5% en los controles (
P = 0,003
; Tabla 2).

Conjunto de variantes c.1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; a están en la vecindad de los sitios de empalme de consenso y tienen potencial de alterar empalme posttranscriptional. se realizó para evaluar el impacto de estas variantes, se extrajeron y se invierten los ARN de tumor y el tejido normal de 3 individuos afectados y control no afectado transcripción. Análisis de secuencias de fragmento de PCR, que comprende la región del extremo del exón 1 al exón 8 de cDNA, omisión del exón 4 (Fig. 1) revelada. Todas las muestras analizadas se carece del exón 3. La secuenciación del mismo fragmento de ADNc en las líneas celulares también reveló que falta del exón 3 (datos no mostrados). Cinco conocidos transcripción variantes alternativas de PPARd han sido descritos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Gene ID: 5467) y sólo una de estas variantes contiene el exón 3 en la secuencia de mRNA. número alternativa transcripción 4 con la ausencia de los exones 3 y 4 tiene codón de inicio alternativo en el exón 2 y expresa la isoforma de proteína 3, que se diferencia en N-terminal debido a que carece de una parte del extremo 5 'la secuencia de codificación. Otras variantes de transcripción tienen codón de inicio en el exón 4.

El análisis de 20 muestras al azar pareadas (muestras que eran homocigotos o heterocigotos de la variante mutada en al menos uno de los sitios polimórficos o c.1-87 c.489) revelado igual heterocigosidad en los sitios polimórficos c.1-87T /C y c.489T /C en 4 tejidos normales, mientras que en las muestras de ADN tumoral emparejados se observó diferente proporción de ambos alelos en repetidas ocasiones (Figura 2).

N - tejido normal, T - tejido tumoral;#516 es ejemplo de análisis de secuencias con el mismo patrón en el tejido normal y tumoral.

caracterización de nuevos y /o somáticas
PPARd
Variantes

Siete nuevas variantes fueron detectados en los pacientes, los controles y /o en líneas celulares (Tabla 3). De estos, tres fueron variantes de cambio de sentido y 6 se encuentra en intrones. Una de estas nuevas variantes intrónicas fue somática, uno fue encontrado en el grupo de control, y uno en la línea celular HCT-116. Todas estas variantes eran heterocigotos y detectan sólo una vez. Además de nuevas variantes, se detectaron otros 2 esporádica y 8 variantes raras. se reportan las características de los pacientes con la variante poco frecuente detectada en la Tabla S2

Curiosamente, dos de las tres variantes somáticas detectadas, c.425-9C & gt;. T (siete pares de bases del sitio de empalme de consenso 3 ') y c .548A & gt; G (en el exón 7, que conduce al cambio de aminoácido tirosina altamente conservado de cisteína en el codón 183, y se produjo junto con variantes conjuntos c.1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; a) , se detectaron ni en otras dos muestras de ADN extraído de espacialmente diferentes partes del tumor ni en la mucosa normal correspondiente

la mutación de sentido erróneo c.773G & gt;. se ha detectado un (p.R258Q) en el exón 8 en SW480 ( línea celular derivada de adenocarcinoma de colon), pero no en las células SW620 (línea celular derivada de metástasis de ganglios linfáticos). Esta variante se produce en un dominio de unión a ligando y conduce al cambio de aminoácido arginina altamente conservado de glutamina

Tanto missense variantes c.548A & gt;. G (p.Y183C) y c.773G & gt; A (p. R258Q) se sugirió que se patógenos utilizando
in silico
programas de predicción (Tabla 4).

Discusión

el presente estudio muestra por primera vez el análisis de secuencias de la em
PPARd
génica en diversos grupos de pacientes con CRC, los controles sanos, y los modelos de la línea celular de cáncer de colon. Detectamos 5 recurrente y 17 variantes raras, de las cuales 7 fueron reportadas por primera vez en este estudio. Dos o más
PPARd
variantes, en su mayoría, se produjeron alteraciones recurrentes juntos en la mayoría de los pacientes con la variante detectada. Dos de cada cuatro variantes missense detectados (p.Y183C y p.R258Q) fueron clasificados por
In silico
programas de predicción de probabilidades patógenos.

Aún más interesante, analiza en una cohorte de 303 CRC pacientes (grupo I) reveló que los portadores de la variante c.489C recurrente /C tenían tumor peor diferenciada en comparación con el c.489C /T y c.489T /T. Sin embargo, no está claro si esta variante impulsa el desarrollo de tumor, o si es sólo una mutación de pasajeros sin efecto directo sobre la idoneidad de las células tumorales.

Se ha propuesto que los cánceres de los extremos proximal y distal colon puede ser de dos tipos distintos de cáncer con diferentes factores de riesgo genéticos y ambientales, y no se describieron diferencias genéticas entre los cánceres que se presentan en los extremos proximal y distal del colon [33]. Sin embargo, no reveló diferencias significativas en la distribución de las alteraciones entre los carcinomas de colon y recto, ni entre los tumores lados izquierdo y derecho
.
Además, tres somática
PPARd
variantes, c.425-9C & gt ; T, c.548A & gt; G (p.Y183C), y c.628-16G & gt; a, se detectaron en tres tumores de colon esporádicos (grupo I). Hemos observado una variante somática heterogénea que no era detectable en cada parte tumor secuenciada. La variante c.548A & gt; G ha sido anunciado en la base de datos cósmico de mutaciones somáticas en un paciente afectado por el carcinoma de células escamosas [32]. Hasta la fecha, el cósmico contiene 40 diferentes
PPARd
variantes somáticas, dispersos en todo el gen, que se detectó en 43 pacientes únicos. De estos, 3 variantes silenciosas y 7 missense se encontraron en 10 adenocarcinomas de colon mucinosos, y una variante de cambio de sentido en la muestra de tumor rectal. Somática
se describieron PPARd
variantes también en pulmón, mama, ovario, endometrio, el hígado y el tumor de próstata y neuroblastoma. La presencia de variantes somáticas en tumores CRC apoya la relevancia de
Hoteles en PPARd CRC tumorigénesis.

Proyección en las muestras de sangre de pacientes reveló una frecuencia similar de las variantes recurrentes ubicados en, o adyacente a, los exones 4 o 7, entre los grupos de pacientes II, III y IV en comparación con el grupo de control, excepto de una mayor prevalencia de la articulación variantes c.1-101-8C & gt; T y c.130 + 3G & gt; a en el grupo III. Curiosamente, se observó la mayor frecuencia de las variantes de la línea germinal en la población de bajo riesgo de los pacientes con dos familiares de primer grado afectados (grupo III) mientras que no se observó la frecuencia más baja en el grupo de alto riesgo de los pacientes con CCR hereditario (grupo IV). Sin embargo, cualquier interpretación sustancial de los datos está limitado por pequeños grupos de muestras y a poco, a pesar de que estadísticamente significativa, las diferencias. se desean mayores análisis de series con mayor número de pacientes para los análisis comparativos precisos

Nos encontramos novela mutación de sentido erróneo c.773G & gt;. A (p.R258Q) en la línea celular de cáncer de colon SW480 primaria y no en las células de los ganglios linfáticos metastásicos la línea SW620. Una característica única de las líneas de células SW480 y SW620 es que se derivan de tumores primarios y secundarios resecados del mismo paciente. Otra variante, c.1078 + 22G & gt; A, está presente sólo en primaria derivada tumor de células de líneas KM12C pero no en las líneas de células de metástasis experimentales y KM12SM KM12L4a. estado Distinct mutación en líneas celulares de tumores primarios y líneas de células metastásicas, así como la detección de variantes somáticas sólo en una parte del tumor (c.425-9C & gt; T y c.548A & gt; G) están en concordancia con el modelo de clonal evolución del cáncer y intratumoral heterogeneidad genética [34], [35]. Distribución espacial de subclones con diferentes aberraciones genómicas dentro de tumor y la metástasis se ha descrito recientemente [36]. La aparición de la
PPARd
mutación en líneas celulares primarias pero no en la línea celular metastásico también puede ser explicada por deleción en
PPARd
loci durante tumor y la formación de metástasis. Por otra parte, el análisis de secuencia de ADN en las diferentes muestras (grupo I) mostró en varios casos diferente proporción de alelos en dos sitios polimórficos, que se encuentra en el exón 4 y 7, en comparación tumor con el tejido normal. Teniendo en cuenta el hecho de que el
PPARd
gen está localizado en el antígeno leucocitario humano (HLA) en complejo región cromosómica 6p, que con frecuencia se ve afectada por deleciones y reordenamientos en los cánceres humanos [37], [38], nuestra observación puede sugerir la pérdida de heterozigosidad en el
PPARd
loci en subclones de células tumorales durante el desarrollo del tumor.

es de destacar que gran mayoría de las alteraciones detectadas son transcripcionalmente silencioso, ya sea localizado en 5 'ó 3' -UTRs o en intrones. Varias líneas de evidencia sugieren que cualquier variante de nucleótidos (intrónica, sin sentido, de sentido erróneo, sinónimo) puede ser considerado como potencialmente nocivo ya que puede alterar normal de empalme pre-mRNA
vía
cambios en las secuencias consenso de corte y empalme, la creación de nuevo críptico secuencias, el afecto de la tasa de traslación, o cambios de ARNm o estabilidad de la proteína [39] - [41]. Tales variantes previamente desatendidas, podrían ser susceptibles de enfermedades hereditarias. Por desgracia, en nuestro estudio era imposible probar todas las variantes en el nivel de ARNm debido a la falta de los tejidos o muestras de sangre particulares para el aislamiento de ARN. Sin embargo, análisis de la secuencia de cDNA en los portadores de variantes heredado c.130 conjunta + 3G & gt; A y c.1-101-8C & gt; T reveló la omisión del exón 4, que puede conducir a la traducción de la isoforma PPARd con cambiado N-terminal de proteínas en comparación con la forma de tipo salvaje. El
PPARd
variantes en 5'-UTR pueden ser de especial interés, ya que la función reguladora de la hipótesis de la expresión del ARNm. Sin embargo, en la cohorte de 303 pacientes con CRC, no hemos encontrado una asociación entre variantes recurrentes en el 5'-UTR (c.1-87C & gt; T y c.1-67G & gt; A). Y variables clínico

Nos gustaría reforzar la importancia de la caracterización de los antecedentes genéticos de las líneas celulares utilizadas como sistemas modelo. Por ejemplo, dos laboratorios demostraron que la expresión de proteínas PPARd era dependiente de APC /
beta-catenina vía
[42], [43]. Su conclusión se basó en la observación de que la expresión relativa de PPARd era similar o inferior en las células SW480 que tienen un mutante
APC
gen y una de tipo salvaje
beta-catenina
gen. En el presente estudio hemos detectado sentido erróneo
PPARd
mutación (p.R258Q) en las células SW480 que pueden influir en la interpretación de estos resultados e indica un uso limitado de la línea celular SW480 de los
in vivo
estudios . Además, el análisis exhaustivo de la
PPARd
gen podría ser útil en el diseño de fármacos, ya que PPARd proporciona una diana atractiva para la intervención terapéutica hasta la fecha en pacientes con síndrome metabólico [16].

En conclusión, se identificaron 22
PPARd
variantes, aunque las variantes potencialmente funcionales detectados en el
PPARd
gen son raros. variante sinónimo c.489T & gt; C (p.N163N; rs2076167) podrían ser de interés clínico en cuanto a su asociación con peor diferenciada CRC. En última instancia, los futuros estudios en una serie de muestras clínicas independientes ayudarán a resolver si alguno de los
PPARd
variantes son posibles modificadores de la susceptibilidad CRC o pronóstico.

Apoyo a la Información sobre Table S1. .
Cebadores usados ​​para la amplificación por PCR y análisis de secuencias
doi: 10.1371 /journal.pone.0083952.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
raras
PPARd
variantes en relación con las características clínico-patológicas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083952.s002 gratis (DOCX) sobre Table S3.
homocigoto variante c.489C en relación con las características clínico-patológicas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083952.s003 gratis (DOCX)

Reconocimientos

Agradecemos para los médicos y los pacientes por su colaboración. Las gracias especiales pertenecen al Dr. Gunnar Arbman (Departamento de Cirugía en Östergötland, Norrköping, Suecia) para la recogida de muestras y datos, Assoc. Prof. Zdenek Kleibl MD, Ph.D (Instituto de Bioquímica y Oncología Experimental, Universidad Charles en Praga, República Checa) para las discusiones críticas, Brandon R. Macías Ph.D (UCSD Medical Center, Universidad de California, San Diego, CA ) y Ph.D Veronika Patcha Brodin (División de Oncología, Departamento de Medicina clínica y Experimental de la Facultad de Ciencias de la Salud, el Consejo del Condado de Östergötland, Universidad de Linköping, Linköping, Suecia) para la corrección del manuscrito, y Birgitta Holmlund (Departamento de Medicina clínica y Experimental de la Universidad de Linköping, Linköping, Suecia) por su excelente asistencia técnica durante el aislamiento de ADN.

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