Extracto
Antecedentes
previamente identificado una asociación entre una desajuste de genes de reparación,
MLH1
, promotor SNP (rs1800734) y microsatélites inestables (MSI-H) de cáncer colorrectal (CRC) en dos muestras. El estudio actual se expandió en este hallazgo como exploramos las bases genéticas de la metilación del ADN en esta región del cromosoma 3. La hipótesis de que los polimorfismos específicos en el
MLH1
región del gen que predispone a la metilación del ADN, lo que resulta en la pérdida de
MLH1
la expresión génica, la función de reparador de desajustes, y en consecuencia el genoma amplia inestabilidad de microsatélites.
Metodología /Principales conclusiones
primero probamos nuestra hipótesis en una muestra de Ontario (901 casos, 1.097 controles) y los principales hallazgos replicados en dos muestras adicionales de Terranova y Labrador (479 casos, 336 controles) y de Seattle (591 casos, 629 controles). Se utilizó regresión logística para probar la asociación entre los SNPs en la región de
MLH1
y el CRC, MSI-H CRC,
MLH1
la expresión génica en el CCR, y la metilación del ADN en el CCR. La asociación entre rs1800734 y MSI-H CRC, se informó anteriormente en Ontario y Terranova, se replicó en la muestra de Seattle. Dos nuevos SNPs, en fuerte desequilibrio de ligamiento con rs1800734, mostraron una fuerte asociación con
MLH1
la metilación del promotor, la pérdida de proteínas MLH1, y MSI-H CRC en las tres muestras. El modelo de regresión logística de MSI-H CRC que incluía
MLH1
estado -promoter-metilación y el estado immunohisotchemistry MLH1 caber la mayoría de parsimonia en las tres muestras combinadas. Cuando se añadió rs1800734 con este modelo, su efecto no fue estadísticamente significativa (
P
-valor = 0,72 frente a 2,3 × 10
-4 cuando el SNP fue examinado por sí solo).
conclusiones /Importancia
la asociación observada de rs1800734 con MSI-H CRC se produce a través de su efecto sobre la
MLH1
la metilación del promotor, la deficiencia de MLH1 IHC, o ambos
Cita.: Mrkonjic M, Roslin NM, Greenwood CM, Raptis S, Pollett A, Laird PW, et al. (2010) Las variantes específicas en el mayo Drive MLH1 metilación del ADN gen de la región, la pérdida de expresión de proteínas, y MSI-H cáncer colorrectal. PLoS ONE 5 (10): e13314. doi: 10.1371 /journal.pone.0013314
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 28 Junio, 2010; Aceptado el 15 de septiembre del 2010; Publicado: 13 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Mrkonjic et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca del equipo de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (CIHR subvención CRT-43821 a JM, BB, JK, SG, RG, PP y BY). Además, este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo Solicitud de Aplicaciones CA-95-011 y por medio de acuerdos de cooperación con los miembros de la familia del Registro de colon y los investigadores principales (U01 CA074783 adjudicados a Ontario Registro de Estudios de familiar de cáncer colorrectal, y U24 CA074794 otorgado a Seattle colorrectal Registro Familiar del cáncer). A.D.P. y N. R. son apoyados por Genoma Canadá. A.D.P. sostiene Cátedra de Investigación en Genética de las enfermedades complejas. B.W.Z. y T.J.H. son los destinatarios de los Premios investigador principal del Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer, a través generoso apoyo del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario. Además, este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Americano para la Investigación del Cáncer conceder 99B055 (B. B. y J. K.). M. M. es un Estudiante Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer a través de un premio del Instituto Nacional del Cáncer de Canadá (018.668). M. M. También recibió el apoyo de beca graduada del Equipo de Investigación Interdisciplinaria sobre el Cáncer Colorrectal con fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y del Instituto de Investigación Samuel Lunenfeld. Todos los autores tienen plena responsabilidad por el diseño del estudio, la recogida de datos, el análisis y la interpretación de los datos, la decisión de enviar el manuscrito para su publicación, y la escritura del manuscrito. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en América del Norte [1]. CRC se puede subdividir en dos grandes parsimonia grupos definidos por las vías genéticas implicadas. La vía supresor, observada en & gt; 80% de los casos de CCR, implica anormalidades de la vía de señalización /sin alas APC y se caracteriza por mutaciones somáticas frecuentes de oncogenes y la pérdida de heterozigosidad de genes supresores de tumor, la inestabilidad cromosómica y microsatélites estables (MSS) tumores. La vía de mutador, por otro lado, representa el ~15-20% de los casos de CCR y los resultados de una deficiencia del sistema reparador de desajustes (MMR), que conduce a escala del genoma inestabilidad de microsatélites (MSI) [2], [ ,,,0],3]. MSI tumores tienen características clínico patológicas de los tumores del SMS en el que tienden a ocurrir con más frecuencia en el colon proximal, tienen histología mucinosa, linfocitos infiltrantes de tumor, pobre diferenciación, y la reacción de Crohn-como [4]. CRC también puede clasificarse en base a la inestabilidad epigenética en la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) -positivos y tumores CIMP-negativos [5]. CRC tumores CIMP-positivas se pueden subdividir posteriormente en dos grupos, unos tumores CIMP1 más comunes, que son MSI-H debido a
MLH1 promotor metilación
y tumores CIMP2, que son MSS [5]. Aproximadamente el 80-90% de la pérdida esporádica exhibición de MSI CRC de la función MMR debido a
MLH1
la metilación del promotor [6], [7]. El posible mecanismo por el que
MLH1
es silenciado epigenético está claro.
Nuestro trabajo previo destinado a dilucidar el papel de un panel de SNPs en genes MMR en el CCR. Se incluyen en este panel fue el
MLH1
-93G & gt; Un polimorfismo promotor (rs1800734), y se observó su asociación con tumores MSI-H en dos muestras procedentes de las provincias canadienses de Ontario y Terranova y Labrador [8]. Varios estudios confirmaron y ampliaron posteriormente en nuestros hallazgos y se han observado asociaciones entre el
MLH1
-93G & gt; Un polimorfismo y
MLH1
metilación en el promotor CIMP CRC, así como la deficiencia de MLH1 IHC [9] , [10], [11]. Sin embargo, se ha propuesto ningún modelo predictivo para describir tales hallazgos. La asociación entre el
MLH1
promotor polimorfismo (rs1800734) y la metilación puede indicar la especificidad de secuencia de la metilación del ADN.
La hipótesis de una progresión escalonada de MSI-H CRC basado en la susceptibilidad genética a la guía de metilación del ADN a
MLH1
silenciamiento génico y la inestabilidad de microsatélites (Figura 1). Además, la hipótesis de que la
MLH1
-93G & gt; Un polimorfismo puede estar en fuerte desequilibrio de ligamiento (LD) con otras variantes, y que una o más de estas variantes predisponen la región a la metilación, que luego resulta en la pérdida de
MLH1
la expresión génica y un sistema de MMR defectuoso, lo que lleva a la inestabilidad de microsatélites. Hemos llevado a cabo un enfoque basado en la población utilizando tres muestras independientes. En este estudio se utilizó una combinación única de epidemiología genética y estrategias funcionales para identificar y caracterizar los alelos que juegan un papel en la modificación de la Convención de desarrollo en un subgrupo importante y común de los casos.
SNPs específicos predisponen a la región, incluyendo el
MLH1
promotor del gen, a la metilación, que da como resultado el silenciamiento de promotor y la pérdida de
MLH1
la expresión de genes que se mide por tinción inmunohistoquímica. La pérdida de la
MLH1
expresión génica conduce a-genoma amplia inestabilidad de microsatélites y el cáncer colorrectal MSI-H.
Materiales y Métodos
Criterios de selección SNP
se seleccionaron los polimorfismos analizados mediante el ensayo de la nucleasa 5 'en este estudio sobre la base de extensas bases de datos y búsquedas bibliográficas como se describe anteriormente [8], [12]. La región de 500 kb del cromosoma 3 que rodea
MLH1
se genotipo para todos los polimorfismos disponibles de una combinación de Affymetrix GeneChip Human Mapping 100K y 500K plataformas. Además, se seleccionaron los SNPs en la región de interés que son fuertes en LD con rs1800734 en los datos de HapMap (27 libere de la población CEU), disponibles públicamente en http://www.hapmap.org. Se identificaron dos SNPs tales y también se incluyeron
Sujetos de estudio
Hemos realizado este estudio con sujetos desde tres lugares diferentes:. la provincia de Ontario, la provincia de Terranova y Labrador (en lo sucesivo como Terranova), y el área metropolitana de Seattle. En todos los lugares, sólo se incluyeron los individuos con un solo tumor. CRC pacientes y controles no afectados de Ontario y Terranova fueron acumulados a lo descrito previamente [8], [12]. En resumen, para los pacientes con CCR Ontario 1004 y 1957 controles fueron identificados por el registro familiar de cáncer colorrectal Ontario (OFCCR) [13]. Con el fin de minimizar la posibilidad de estratificación de la población se excluyeron de los análisis los casos que no eran blancos y los que no informaron el origen étnico. De los pacientes de caso 1004, 929 eran blancos. No hay casos relacionados se utilizaron en el estudio. Además, se excluyeron todos los pacientes de CRC con conocidas mutaciones en el gen de la línea germinal MMR (11 casos con una mutación conocida en MLH1, 10 en MSH2, y uno en MSH6) y todos los casos de CCR que eran deficientes en una de las proteínas MMR, distintos de MLH1 ( 14 MSH2 /MSH6 IHC tumores deficientes). 901 pacientes con CRC se mantuvieron y constituyen los casos de Ontario. Toda la información del paciente, así como se obtuvieron muestras de sangre y tejidos como se describe anteriormente [8].
Un total de 1957 sujetos de control de Ontario de acuerdo en participar en el estudio y completaron las tres cuestionarios (familiares, personales, y cuestionarios dietéticos). Del 1957, 1314 controles proporcionaron muestras de sangre, y 1.097 de ellos eran blancos. Estos 1097 sujetos de control fueron genotipo con éxito y por lo tanto constituyen los controles Ontario. Aproximadamente el 21% de los casos OFCCR y el 12% de los controles tienen familiares de primer grado afectados con CRC.
El patrón de acumulación seguido por el registro familiar de cáncer colorrectal Terranova (NFCCR) fue similar a la seguida por el OFCCR. Los pacientes con CCR fueron identificados a través del registro de tumores de Terranova; Se identificaron 1144 pacientes con CRC, de los cuales 747 respondieron al cuestionario de la historia familiar y 555 muestras de sangre proporcionadas; 490 proporcionan información etnicidad y fueron clasificados como blanco. No hay casos relacionados se utilizaron en el estudio. Se excluyeron cuatro casos de CCR con mutaciones de la línea germinal conocidas en MSH2, al igual que 11 no MLH1 MMR IHC casos deficientes (5 para MSH2, MSH6 de 5 y 1 para la deficiencia de PMS2). Los 479 pacientes con CCR restantes constituyen los casos de Terranova
controles
Terranova fueron reclutados mediante llamadas telefónicas al azar, y emparejados a los casos por sexo y grupo de edad de 5 años.; 1602 controles de acuerdo en participar, de los cuales 336, a esta etapa, se han completado las tres cuestionarios y muestras de sangre proporcionadas. No hay controles relacionados se utilizaron en el estudio. Aproximadamente el 31% de los casos NFCCR y el 18% de los controles tenían familiares de primer grado afectados con CRC
.
En Seattle, los casos y los controles fueron reclutados por el Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson (FHCRC) como se ha descrito anteriormente [14] . En resumen, los pacientes con CCR que fueron diagnosticados entre las edades de 20 y 74 años en condados de King, Snohomish, o Pierce de Washington entre enero de 1998 y junio 2002 se estableció contacto. Se incluyeron todos los casos de CCR, independientemente de los antecedentes familiares. De los 1814 casos y 1531 controles que completaron los dos cuestionarios, 1497 casos y 745 controles donaron una muestra de sangre. Para este estudio, se obtuvieron muestras de ADN de 668 casos de CCR y 667 controles de etnia caucásica. Quince MMR IHC casos de CCR deficientes fueron excluidos (10 para MSH2, MSH6 de 1 y 4 para la deficiencia de PMS2). No hay casos o controles relacionados se utilizaron en el estudio. Aproximadamente el 14% de los casos FHCRC y el 8% de los controles tenían familiares de primer grado afectados con CRC.
Los datos fueron recogidos en la edad al momento del diagnóstico (para los casos), edad en la realización del cuestionario antecedentes familiares, localización del tumor, el estadio del tumor y el grado del tumor, cuando esté disponible, a través de la revisión de patológica y /o informes quirúrgicos. Los tumores se organizaron y se clasificaron de acuerdo con el método del Comité Conjunto sobre el Cáncer [15]. Las muestras de sangre y de tejido se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito para participar en el estudio, de acuerdo con los protocolos aprobados por los consejos de administración de ética de la investigación del Mount Sinai Hospital, Universidad de Toronto, la Universidad Memorial de Terranova, y Fred Hutchinson Cancer Research Center.
Molecular Genetic Analysis
Single-polimorfismo de nucleótidos genotipificación.
linfocitos de sangre periférica se aislaron de sangre completa mediante el uso de centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Biosciences, Baie d 'Urfé, Quebec, Canadá). Fenol-cloroformo o el kit de extracción de ADN Qiagen (Qiagen Inc., Montgomery Co., MD) se usó para extraer el ADN genómico a partir de linfocitos. Se utilizó el ensayo fluorogénico 5 'nucleasa cadena de la polimerasa de reacción o en el ensayo TaqMan [16] para determinar el genotipo de cada uno de los siguientes cinco SNPs:
MLH1
-93G & gt; A (rs1800734), I219V (rs1799977), IVS14-19A & gt ; G (rs9876116),
LRRFIP2
intrón 26 IVS26-18T & gt; C (rs749072),
LBA1
intrón 8 (rs4431050), y rs13098279 intergénicas. Las secuencias de cebadores y sondas, así como las mezclas de reacción maestro para rs1800734, rs1799977, rs9876116 y fueron descritas previamente [8]. El
LRRFIP2
rs749072,
LBA1
rs4431050 y rs13098279 polimorfismos intergénicas se genotipo mediante el uso del kit de Eurogentec qtPCR (Eurogentec, San Diego, CA) [8]. Las secuencias de cebadores y sondas para rs749072, rs4431050 y rs13098279, se proporcionan en S4 archivo complementario.
SNPs situados en la región de 500 kb del cromosoma 3 que rodea el
MLH1
gen se genotipo en el Ontario muestras utilizando el Affymetrix GeneChip Human Mapping 100K y 500K plataformas como parte de la evaluación del riesgo de tumores colorrectales en el proyecto de Canadá (Ártico), que se describe anteriormente [17]. 94 SNPs en la región de 500 kb, además de los 5 SNPs genotipo de TaqMan, se genotipo de las muestras de Ontario que abarcan los siguientes genes:
DCLK3
,
LBA1
,
,
MLH1
,
LRRFIP2
, y
GOLGA4
. La lista de los SNPs genotipo de las muestras de Ontario se proporciona en S1 Archivo. Las muestras de Terranova y Seattle se genotipo utilizando la plataforma Illumina ISeleccione 500K Chip. Un total de 16 SNPs en esta región se genotipo incluyendo rs1800734, rs749072 y rs13098279. Las muestras de Terranova se caracterizan además por tres polimorfismos: rs1799977 y rs9876116 genotipo anteriormente [8], y
LBA1
rs4431050. El SNP rs1800734 se genotipo tanto por las plataformas de patatas fritas y Taqman Affymetrix en Ontario y se utilizó para validar las llamadas de genotipado. Fuera de 1884 muestras con genotipo por ambos métodos hubo 11 llamadas discordantes (0,58%, complementario Archivo S1).
Se realizó el control de calidad para el genotipado como se describe anteriormente [17]. Brevemente, SNPs se excluyeron del análisis de los datos si la frecuencia del alelo menor fue menos de 1% y la tasa de llamada fue de menos de 87% en los controles en cada uno de los tres centros de estudio. Además, los SNPs se excluyeron si el
P
-valor de una prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg fue inferior al 10
-4 en los controles. Los individuos fueron excluidos si la tarifa de llamadas de genotipos fue inferior al 87%.
Tumor Análisis de inestabilidad de microsatélites.
El tumor se realizó el análisis de MSI como se describe anteriormente [18]. Brevemente, tumor colorectal embebido en parafina y el tejido normal de colon emparejado de pacientes con casos incidentes de CRC se microdissected en áreas con más de 70% de celularidad. PCR en ADN de tumor CRC y el tejido de colon normal correspondiente se utiliza para establecer y comparar los patrones de MSI. MSI análisis se llevó a cabo con un mínimo de cinco marcadores de microsatélites desde el panel de 10 marcadores microsatélites, según lo recomendado por el Instituto Nacional del Cáncer [19]. estado de MSI fue asignado como MSI alta (MSI-H, ≥30% marcadores inestables entre todos los marcadores de la prueba), MSI baja (MSI-L, & lt; 30% marcadores inestables), o de microsatélites estables (MSS, no hay marcadores inestables) según lo recomendado [19]. Para el análisis, los grupos del SMS MSI-L y se combinaron en un grupo (denominado en lo sucesivo como "MSS /L"). Los cebadores se obtuvieron de Applied Biosystems (Foster City, CA), y secuencias de los cebadores fueron descritos anteriormente [8].
Proteína MMR tinción inmunohistoquímica
fijados con formalina, tejidos CRC incluidos en parafina, recogidos con fines de diagnóstico, se seccionaron a 4 micras, fueron desparafinados y rehidratados con alcohol y xileno para el análisis inmunohistoquímico de MLH1 como se describe anteriormente [20], [21]. Después de la rehidratación, los portaobjetos se colocan en cualquiera de una olla a presión o antígeno microondas medio de recuperación (10 mmol /L de tampón de citrato a pH 6,0 durante 3 minutos a 115 ° C en MicroMed T /T Mega; Hacker Instrumentos & amp; Industries, Inc., Fairfield , NJ). bloqueador de proteínas (20%) con avidina se usa para prevenir la unión no específica (Signet Laboratories, Inc, Dedham, MA). Después de que los portaobjetos se lavaron en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo de ratón contra MLH1 (1:40; G168-728, PharMingen, San Diego, CA), MSH2 (1:100; FE 11, Oncogene Research Products, Cambridge, MA ), MSH6 (1:100; 44, BD transducción Laboratories, Mississauga, Ontario, Canadá), o PMS2 (1:50; BD Biosciences Pharmingen, Mississauga, Ontario, Canadá) durante 1 hora. Los anticuerpos se detectaron entonces usando avidina-biotina:. 3,3'-diaminobencidina tetracloruro se utilizó como cromógeno y hematoxilina para la contratinción
MLH1 promotor análisis de metilación
MLH1
promotor de la metilación se analizó utilizando MethyLight [22], [23]. ADN tumoral de los casos disponibles estaba sujeto a la conversión de bisulfito de sodio usando ADN EZ metilación oro Kit (Zymo Research, Orange, CA) según las recomendaciones del fabricante.
MethyLight análisis de la
se realizó MLH1
promotor como se describe anteriormente [23]. La reacción de control Alu-C4 se utilizó para normalizar para la entrada de ADN con bisulfito MODIFICADA [23]. Las muestras fueron clasificadas como positivas para
MLH1
la metilación del promotor si por ciento referencia metilado (PMR) ≥10, tal como se describe anteriormente [23]. Las secuencias de cebadores y sondas para el
MLH1 Opiniones y Alu-C4, así como el programa de PCR en tiempo real para el análisis MethyLight se ha informado anteriormente [23]. Todos los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos de polipropileno (Axygen Scientific, Union City, CA) y los resultados fueron analizados utilizando el instrumento ABI 7500HT PCR en tiempo real y el software que lo acompaña, SDS versión 2.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . El control independiente de calidad para el análisis de la metilación del promotor MLH1 se realizó el exterior el 15% de las muestras Ontario
Análisis estadístico
Cada uno de los siguientes resultados se probó para la asociación con cada SNP mediante regresión logística:. de colon cáncer (todos los casos de CCR en comparación con los controles), la metilación (
MLH1
tumores metilados en comparación con los tumores no metilados), IHC (MLH1 IHC deficientes en comparación con los tumores de dominio), y MSI (MSI-H en comparación con los tumores MSS /L) , utilizando una codificación aditivo de genotipos para cada SNP. El sexo y la edad al examen, recogido por los pacientes y los controles no afectados, se utilizaron como covariables cuando CRC fue el resultado, mientras que el sexo y la edad al momento del diagnóstico (disponible sólo para los pacientes) fueron utilizados en los modelos con los otros resultados. Se realizó un análisis de los modelos separados para los tres sitios de recolección y la combinación de datos. En el análisis de los datos combinados, el sitio se incluyó como covariable.
modelos de regresión logística múltiple para el estado MSI también se evaluaron en el subconjunto de los datos en los que no se han encontrado valores que faltan para todas las variables incluidas en los modelos (edad, MSI, IHC, la metilación, y tres SNPs). estado de MSI se empezó en combinaciones de IHC, metilación y SNP, para cada uno de los tres SNPs que mostraron asociaciones en los modelos de regresión logística iniciales. Dado que los tamaños de las muestras son pequeñas, particularmente en Seattle, la regresión se realizó con todas las muestras combinadas, durante el uso de una de covarianza para la ubicación de contratación. Para comprobar la consistencia de los resultados, los modelos también se llevaron a cabo sobre cada muestra por separado. Debido a la fuerte asociación entre MSI, IHC, y la metilación y la separación casi completa, se utilizó máxima verosimilitud penalizada para producir estimaciones de los parámetros finitos [24]. Todos los análisis estadísticos se realizaron con R 2.7.0 (http://www.R-project.org).
Con el fin de controlar el efecto de múltiples pruebas, se estimó un número efectivo de pruebas de Ontario , Seattle y Newfoundland, basado en el procedimiento de Li y Ji [25]. Este procedimiento utiliza la descomposición espectral de la correlación observada entre SNPs para estimar el número de pruebas completamente y parcialmente correlacionados. Por lo tanto, en el control de error de tipo I, el nivel de significación nominal de 0,05 se ajusta mediante el número efectivo estimado de pruebas utilizando el procedimiento de Bonferroni normal. La descomposición espectral se realizó utilizando scripts modificados descargados desde el sitio web de Dale Nyholt (http://gump.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD, 4 de julio de 2005), junto con el oro 1.1.0 [26] y R 2.7.0 (http://www.R-project.org).
resultados
Estamos genotipo 901 casos y 1097 controles de Ontario por 99 SNPs en una región de 500 kb del cromosoma 3 que rodea a los
MLH1
gen (Figura 2).
un total de 99 polimorfismos fueron examinados en las muestras de Ontario a través de una región de 500 kb del cromosoma 3 que rodea el
MLH1
gen. Los genes en esta región se esbozan (panel superior) junto con su direccionalidad de la transcripción (panel inferior). Los tres polimorfismos de interés se indican. Modificado de Ensembl (www.ensembl.org) guía empresas
Hemos eliminado 25 SNPs debido a problemas de control de calidad:. Menor frecuencia de los alelos & lt; 1% (22), llamada tasa de & lt; 87% (1) o de Hardy-Weinberg
P-valor
& lt; 10
4 (2), lo que resulta en 74 SNPs analizados. a continuación, hemos examinado las muestras de Terranova (479 casos y 336 controles) y Seattle (591 casos y 629 controles) durante 19 y 16 SNPs de interés, respectivamente. Todos los marcadores en las muestras de Terranova y Seattle pasaron los filtros de control de calidad. la inestabilidad de microsatélites del tumor se evaluó por 744 Ontario, Terranova 463 y 487 casos Seattle. MLH1 IHC tinción se llevó a cabo en 709 Ontario, Terranova 462 y 517 casos de Seattle, y
MLH1
análisis de la metilación del promotor se realizó en 569 Ontario, Terranova 468 y 210 casos Seattle. Características de las tres poblaciones de la muestra se resumen en la Tabla 1. Las características clínicas y patológicas generales de CRC de nuestras poblaciones totales de casos fueron similares a los de las poblaciones de casos utilizados en los múltiples modelos de regresión logística, con la excepción de Seattle, donde había un sesgo hacia los tumores MSI-H (y correspondientemente tumores IHC-deficiente). La lista de todos los polimorfismos genotipo se proporciona en S1 Archivo. descomposición espectral reveló que la prueba de los 74 SNPs en las muestras de Ontario era equivalente a 28 pruebas eficaces; por lo tanto, la asociación
P
-valores fueron comparados con un umbral crítico de
P = 0,0018
, para controlar el nivel de significación del experimento a gota a 5%. Para los datos de Terranova, el análisis de los 19 SNPs constituido 8 pruebas eficaces (
P-valor umbral
= 0,0063), y para los datos de los 16 SNPs Seattle fue equivalente a 6 pruebas eficaces (
P
= 0,0083-valor umbral).
en primer lugar, las pruebas de asociación entre cada SNP y el riesgo de CCR (frente a los controles), MSI-H CRC (vs. MSS /L CRC), MLH1 CRC IHC-deficientes (frente a MLH1 IHC-positivo), y con
MLH1
la metilación del promotor (frente a no metilado
MLH1
promotor) (S2 archivo). Dos SNPs fueron estadísticamente significativamente asociados con un mayor riesgo de CCR en Ontario:. Rs931913 (
P
= 0,001) y rs4624519 (
P
= 0,005)
Tres nuevos SNPs fueron asociado significativamente con un mayor riesgo de MSI-H CRC, MLH1 CRC IHC-deficientes, y con
MLH1
promotor metilado CRC en Ontario (por rs1800734
P = 0,005
,
P
= 0,04, y
P = 0,018, respectivamente
; para rs749072
P
= 3.0 × 10
-4,
P = 0,011
, y
P
= 0,003, respectivamente, y para rs13098279
P = 0,017
,
P = 0,090
, y
P = 0,037, respectivamente
; S2 suplementaria archivo). Examinamos estos resultados en las otras dos muestras: para rs1800734 en Terranova,
P = 8,53
× 10
-5, 1,92 × 10
-5 y 8,95 × 10
-7 para MSI-H, MLH1 IHC-deficiencia, y
MLH1
la metilación del promotor, respectivamente, y, por Seattle,
P = 0,08
,
P = 0,02
, y
P
= 0,04, respectivamente; para rs749072 en Terranova,
P = 0,001
,
P
= 2,4 × 10
-4,
P
= 6.65 × 10
-6, respectivamente, y , para Seattle,
P = 0,03
,
P = 0,004
, y
P = 0,014, respectivamente
; para rs13098279 en Terranova,
P
= 4,5 × 10
-4,
P = 4,30
× 10
-5 y 1,98 × 10
-6, respectivamente, y , para Seattle,
P = 0,24
,
P = 0,07
, y
P
= 0,14, respectivamente. Ver S2 fichero adicional. Ninguno de los tres últimos SNPs se asociaron significativamente con el riesgo general de CRC en las tres muestras estudiadas (S2 Archivo). Estos tres SNP abarcan una región de 197,5 kb con rs1800734 situado en el
MLH1 promotor
, 93 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de la traducción; rs749072 situado en el intrón 26 del
LRRFIP2 gratis (IVS26-18T & gt; C); y rs13098279 situados entre
LRRFIP2
y
GOLGA4 gratis (Figura 2). Los tres SNPs están en desequilibrio fuerte vinculación en los controles de Ontario (por pares
r
2 Hotel & gt; 0,73,
D
'& gt; 0,98). Por parejas
D
'y
r
2 Opiniones de todos los SNPs genotipo en los sujetos control Ontario se muestran en las Figuras S1 y S2.
El análisis de las tres muestras combinadas reveló una fuerte asociación entre rs749072 y la disminución del riesgo de
MLH1
-promoter-metilado CRC (
P
= 3.80 × 10
-6, o para el alelo común = 0,45, IC = 0,34 -0,60); aumento del riesgo de MLH1-proteína que expresan CCR tal como se mide por tinción IHC (
P
= 3,99 × 10
-7, o para el alelo común = 1,87, IC = 1,47 a 2,39); y la disminución del riesgo de MSI-H CRC (
P
= 2.50 × 10
-7, o para el alelo común = 0,55, IC = 0,44-0,69). Debido a que los otros dos SNPs (rs1800734 y rs13098279) están en fuerte desequilibrio de ligamiento con rs749072, los análisis de estos SNP dado resultados similares (Tabla 2).
Con el fin de examinar si estos SNPs se asociaron con la vía que la hipótesis (Figura 1), el próximo creado modelos de regresión logística para MSI-H versus no-MSI-H CRC para el conjunto de datos combinados (S3 archivo). Hemos modelado MSI-H en función de cada uno de los predictores de aguas arriba, así como combinaciones de predictores: primero estado MLH1 IHC; a continuación,
MLH1
estado -promoter-metilación; un SNP; tanto el estado de IHC MLH1 y
MLH1
estado de metilación; y, finalmente, el estado de MLH1 IHC,
MLH1
estado -promoter-metilación y cada SNP (Tabla 3). MLH1 estado de IHC solo era un fuerte predictor de MSI-H CRC (
P = 2,08
× 10
-30) al igual que el
MLH1
estado -promoter-metilación (
P
= 1,33 × 10
-44) para el SNP de interés (para rs1800734,
P
= 2.30 × 10
-4, por rs749072
P =
1,36 × 10
-5, y por rs13098279
P
= 5.10 × 10
-3). El modelo con el estado de IHC MLH1 y
MLH1
estado -promoter-metilación dio el más pequeño del criterio de información de Akaike (AIC) (225.12) y la adición de rs13098279 dieron como resultado el segundo modelo más parsimonioso (AIC = 225,94) (Tabla 3 ). En el modelo con el estado de IHC MLH1 y
MLH1
estado -promoter-metilación, ambas variables fueron estadísticamente significativas, al igual que el SNP en el modelo en el que fue el único predictor. Sin embargo, cuando se añadió el SNP de interés para el modelo con el estado de IHC MLH1 y
MLH1
estado -promoter-metilación, el SNP ya no se mantuvo estadísticamente significativa: el
P-valor de la
prueba de significación para rs1800734 cambió de 2,30 × 10
-4 cuando fue el único predictor, a 0,72 cuando el SNP,
MLH1
estado de metilación y el estado de MLH1 IHC fueron predictores; para rs749072, a partir de 1,36 × 10
-5 a la 0,98; y para rs13098279, 0,005-0,29 (Tabla 3). En el modelo más parsimonioso, centro de reclutamiento no tenía un efecto significativo en el modelo (
P
≥0.26, S3 Archivo).
Se evaluaron los mismos modelos en la ubicación conjuntos de datos específicos de las y los resultados fueron consistentes con los resultados combinados (S3) del archivo. MLH1 estado de IHC,
MLH1
estado de metilación y los SNPs de interés eran todos los factores predictores de tumor estado de MSI-H. El modelo que incluía el estado de IHC MLH1 y
MLH1
estado -promoter-metilación dio la más pequeña AIC en las tres muestras. La adición de cualquiera de los tres SNP no dio lugar a un modelo de ajuste significativamente mejor (S3 Archivo).
Discusión
Este estudio multicéntrico a gran escala examinó marcadores de ADN de la línea germinal y su contribuciones a eventos somáticos, especialmente la susceptibilidad a la metilación del ADN en el CCR. En tres muestras independientes, tres polimorfismos rs1800734, rs749072, y rs13098279 se asociaron con
MLH1
estado -promoter-metilación que resulta en la pérdida de proteínas MLH1 y la inestabilidad de microsatélites. Aunque estos tres marcadores no están asociados con un aumento en el riesgo de CCR en general, las que desempeñan un papel en la tumorigénesis colorrectal en el subconjunto de CRCs que muestran inestabilidad de microsatélites en todo el genoma. Entre los casos de cada población de la muestra individual y en un análisis de las tres cosas, estadísticamente no se observaron asociaciones significativas entre cada uno de estos tres polimorfismos y
MLH1
la metilación del promotor, la deficiencia de MLH1 IHC, y el estado de tumores MSI-H. En varios modelos de regresión logística, cada SNP se asoció con tumores estado de MSI-H;