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PLOS ONE: Linfangiogénesis en Ganglios linfáticos regionales es un marcador pronóstico independiente en cáncer rectal pacientes después del tratamiento neoadyuvante

2013/11/28


Extracto

Uno de los principales factores pronósticos en el cáncer de recto es metástasis en los ganglios linfáticos. La formación de metástasis en los ganglios linfáticos depende de la existencia de un nicho premetastatic. Un factor importante precedente metástasis son vasos linfáticos que están localizados en el ganglio linfático. En consecuencia, se cree que la aparición de la LI intranodal para indicar metástasis a distancia y peor pronóstico. Para evaluar la importancia de la LI de los ganglios linfáticos, se estudió fijadas con formalina, incluidos en parafina adenocarcinomas y los ganglios linfáticos regionales de 203 pacientes con cáncer rectal que fueron tratados con radio-quimioterapia neoadyuvante y cirugía curativa consecutiva con márgenes quirúrgicos libres de cáncer (R0). vasos linfáticos regionales de los ganglios linfáticos se detectaron mediante inmunohistoquímica para podoplanin (D2-40). Nuestros resultados muestran que la presencia de vasos linfáticos en los ganglios linfáticos regionales afecta significativamente la supervivencia libre de enfermedad en univariante y multivariante. En contraste, no hubo correlación entre la densidad de los vasos linfáticos peritumoral o intratumoral y el pronóstico. De hecho, nuestro estudio demuestra la importancia de la LI en los ganglios linfáticos regionales después de radioquimioterapia neoadyuvante y cirugía consecutivo como un marcador pronóstico independiente. La tinción para la LI y métodos de imagen intravital de la LI y el flujo linfático intranodal puede ser una estrategia útil para predecir el resultado a largo plazo en pacientes con cáncer rectal. Por otra parte, la adición de VEGF-agentes bloqueantes de los esquemas estandarizados de tratamiento neoadyuvante podría ser indicada en el cáncer de recto avanzado

Visto:. Jakob C, Aust DE, Liebscher B, Baretton GB, Datta K, Muders MH (2011) Linfangiogénesis en los ganglios linfáticos regionales es un marcador pronóstico independiente en cáncer rectal pacientes después del tratamiento neoadyuvante. PLoS ONE 6 (11): e27402. doi: 10.1371 /journal.pone.0027402

Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América

Recibido: 20 Septiembre, 2011; Aceptado: 17 de octubre de 2011; Publicado: 7 Noviembre 2011

Derechos de Autor © 2011 Jakob et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. No hay corriente fuentes externas financian este estudio específico. En general, el trabajo de los investigadores fue apoyado por becas de MHM (Wilhelm Sander Stiftung fur Krebsforschung) y KD (R01-NIH, CA140432)

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

preoperatoria (neoadyuvante) seguida de cirugía curativa se ha convertido en el tratamiento estándar del cáncer de recto localmente avanzado [1]. La regresión del tumor histopatológico como correlato de la eficacia del tratamiento local varía desde ninguna a los cambios regresivos mínimos para completar la respuesta [2], [3]. El estado de los ganglios linfáticos después de radioquimioterapia neoadyuvante, sin embargo, sigue siendo el factor pronóstico independiente más importante para la supervivencia libre de enfermedad, como los pacientes con ganglios positivos post-terapéutica (ypN +) tienen un pronóstico desfavorable, independientemente de la regresión del tumor primario [2], [3], [4], [5], [6]. Por lo tanto, la inhibición de metástasis en los ganglios linfáticos regionales podría ser una vía eficaz en el tratamiento futuro pacientes con cáncer rectal. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para descubrir los mecanismos de la metástasis de los ganglios linfáticos. Se ha sugerido que la inducción de la linfangiogénesis en el tumor primario y en los ganglios linfáticos contribuye significativamente a la metástasis de tumores [7], [8]. En este estudio se han validado linfagiogénesis en los ganglios linfáticos regionales como predictor de mal pronóstico y facilitador de metástasis a distancia en una cohorte de pacientes tratados con cáncer neoadyuvante rectales avanzados. Es un mejor predictor que la densidad de los vasos linfáticos peri y intratumoral o sistemas de clasificación de regresión tumoral estandarizados para este grupo de pacientes con cáncer rectal.

Resultados

caracterización clínico-patológico de la cohorte evaluada

Todos los pacientes fueron sometidos a resección del recto con escisión total del mesorrecto después de radioquimioterapia neoadyuvante. En todos los pacientes se consiguió una resección curativa a nivel local (R0-situación). La estadificación patológica se informa en la Tabla 1. regresión completa del tumor se observó [9] en 10 casos (5%). 57 pacientes con experiencia grado regresión del tumor 3 (28%). 85 pacientes mostró grado regresión del tumor 2 (42%) y 48 pacientes tenían grado regresión del tumor 1 (23%). No se observó regresión del tumor en 3 pacientes (1,5%). En una mediana de seguimiento de 223 semanas (95% intervalo de confianza 216,9 a 247,3 semanas) 38 pacientes tuvieron recurrencia de la enfermedad, de 32 años desarrolló metástasis a distancia y 6 recurrencias locales. Se detectaron metástasis a distancia en los siguientes órganos: hepática 15 (HEP), pulmonares 6 (PUL), distante ganglios linfáticos no regionales 3 (MJL), pleura 1 (PLE), la piel 1 (PIEL), el peritoneo 1 (PER), ósea 2 (OSS), hepática y pulmonar 2 (HEP y PUL) y 1 otros (OTH). En estos casos de recidiva y metástasis a distancia fueron confirmadas por la evaluación patológica y examen. En ocho casos, la información clínica (se accede por un asistente de documentación) se utilizó para detectar recurrencia de la enfermedad.

Para detectar las células tumorales metastásicas en los ganglios linfáticos que utiliza la norma tinción HE, así como pan-citoqueratina tinción utilizando una anticuerpo monoclonal disponible comercialmente (Dako Inc) en al menos tres secciones en serie de los ganglios linfáticos. Se estudió una mediana de 14 ganglios linfáticos regionales por caja. La presencia de células tumorales positivas pancytokeratin indica la metástasis de los ganglios linfáticos (fig. 1A).

A. Inmunohistoquímica para pancytokeratin para detectar micrometástasis de ganglios linfáticos. B. Podoplanin tinción con D2-40 en un ganglio linfático con la metástasis. El rojo de las marcas de coloración marrón vasos linfáticos. tinción C. Podoplanin con D2-40 en un ganglio linfático y sin metástasis.

Asociación de la regresión del tumor primario y la metástasis de los ganglios linfáticos con los parámetros clínico-patológicos y parámetros de pronóstico

Una correlación significativa encontrado entre los grados de regresión del tumor (Fig. 2) y la supervivencia libre de progresión cuando se dicotómica para la regresión de alta y baja del tumor (p = 0,0033 log-rank) (Fig. 3A) en el análisis de Kaplan-Meier. El análisis multivariado reveló una diferencia estadísticamente significativa al comparar TRG TRG 1 y 3 (Tabla 2). Al igual que en los informes publicados anteriormente [2], [3], [4], [5], [6], también hemos demostrado que la metástasis de los ganglios linfáticos es un importante factor pronóstico independiente en nuestra cohorte (p = 0,0017 log-rank) ( La Fig. 3B).

A. Manchó adenocarcinoma de recto con el grado de regresión del tumor 1 (40x). B. HE tiñó el tejido de cáncer rectal con el grado de regresión del tumor 1 (100x) carcinoma C. rectal con el grado de regresión del tumor 2 (40x) adenocarcinoma D. Rectal con el grado de regresión del tumor 2 (100x). E. La regresión del tumor de grado 3 (100x) en el cáncer de recto con la acumulación de mucina extracelular. F. La linfa grado de regresión de metástasis de nodo 2 (40x). G. La linfa grado de regresión de metástasis de nodo 3 (40x). H. Regional de metástasis en los ganglios linfáticos (400x) en la tinción HE comunes.

A. Tiempo hasta la progresión en semanas en relación con la probabilidad de supervivencia libre de progresión estratificado para una clasificación de la regresión del tumor dicotómica (TRG 0/1/2 = no regresión o masa tumoral dominante con fibrosis obvia o mucina o fibrótico dominantemente o cambios mucinosos, con células tumorales o grupos; TRG 3/4 = muy pocas células tumorales en el tejido fibrótico o mucinoso o no células tumorales, solamente fibrótica o mucinoso masa /regresión total,. de acuerdo con Dworak et al 1997). B. El tiempo de progresión en las últimas semanas en relación con la probabilidad de supervivencia libre de progresión estratificado para la metástasis de los ganglios linfáticos (ypN0 y ypN +).

Asociación de densidad de los vasos linfáticos y peritumoral intratumoral con los ganglios linfáticos metástasis, la UICC etapa, y de pronóstico parámetros

en una siguiente etapa se evaluó la linfagiogénesis peritumoral y intratumoral (pLVD y ILVD) y su relación con metástasis en nuestra cohorte. Linfangiogénesis se evaluó mediante un anticuerpo disponible en el mercado que detecta podoplanin (D2-40, Dako) (Fig. 1B y 1C). La tinción es específico para endotelio linfático y no mancha los vasos sanguíneos con eritrocitos intraluminales detectables. pLVD no se correlacionó significativamente con la metástasis en los ganglios linfáticos (p = 0,08 χ
2). No hubo correlación significativa de pLVD y ypUICC etapa o la supervivencia libre de enfermedad. Además, ILVD no se correlaciona con el pronóstico, metástasis en los ganglios linfáticos, o etapa ypUICC.

Asociación de lymphangiogensis intranodal en los ganglios linfáticos regionales con estadio UICC, la supervivencia libre de progresión, y el tipo de recaída

Mesa -1-captionIn paralelo, se evaluó la linfangiogénesis intranodal por tinción ganglios linfáticos regionales con mesorrectales D2-40 como se describió anteriormente. Un ganglio linfático se clasifica como positiva para linfangiogénesis intranodal cuando al menos un vaso linfático puede detectarse en la folicular o /y la región interfollicular de por lo menos un ganglio linfático mesorectal (designado como NLV +). En esencia, en 102 pacientes todos los ganglios linfáticos fueron negativos para la LI de los ganglios linfáticos, mientras que en 43 pacientes en un solo ganglio linfático linfagiogénesis detectable podría ser visto. En 58 pacientes con más de un ganglio linfático regional tiene linfagiogénesis detectable.

Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre nlv + (LI en al menos una mesorrecto /ganglios linfáticos regionales) y la recaída del tumor, así como la etapa ypUICC (Tabla 1 ). Análisis de Kaplan Meier reveló una correlación significativa de NLV + con la progresión del tiempo de supervivencia libre (p = 0,0071 rango logarítmico) en toda la cohorte (Fig. 4A). Por otra parte, nlv + fue un factor pronóstico independiente que estudió en el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox con las covariables ypUICC etapa, la edad, el género, la regresión del tumor, intratumoral densidad de los vasos linfáticos, peritumoral densidad de los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos densidad de los vasos linfáticos (Tabla 2 ). En consecuencia, el análisis de subgrupos de pacientes con ganglios negativos presentó una correlación significativa entre nlv + y la supervivencia libre de enfermedad (Fig. 4B) mediante el análisis de Kaplan-Meier. Al comparar la frecuencia de metástasis hepática en pacientes con y sin mesorrecto linfagiogénesis intranodal (NLV +), encontramos más metástasis hepáticas en pacientes con linfagiogénesis ganglionar (13 metástasis hepáticas en pacientes con linfagiogénesis intranodal frente a 2 metástasis hepáticas en pacientes sin linfagiogénesis intranodal). También se evaluó el número de vasos linfáticos (densidad de los vasos linfáticos, nLVD) detectados en los ganglios linfáticos regionales. Aquí, el máximo número de vasos linfáticos detectadas en un ganglio linfático con linfangiogénesis correlaciona significativamente con el estado del nodo (ypN0 o ypN +; p = 0,01 χ
2) (Fig 5B.). En contraste, no hubo correlación del número máximo de los vasos linfáticos con metástasis a distancia. Cuando dichotomizing según la mediana de la densidad máxima de los ganglios linfáticos vaso linfático, no hemos podido detectar ninguna correlación significativa con el tiempo hasta la progresión. Además, el número de ganglios linfáticos con linfangiogénesis no se correlacionó con la etapa ypUICC o recidiva tumoral en el subgrupo de pacientes con NLV +. En resumen, la presencia de vasos ganglio linfático ganglios regionales representa un parámetro pronóstico independiente, mientras que la densidad de los vasos linfáticos ganglionar, así como el número de ganglios linfáticos con linfagiogénesis ganglionar detectable pueden ser de menor importancia para el pronóstico general.

"con linfagiogénesis ganglio linfático" se define como al menos un ganglio linfático regional /mesorrecto con linfagiogénesis detectable en la zona folicular o interfollicular. A. El tiempo de progresión en semanas en relación con la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad estratificado para la presencia de la linfangiogénesis ganglios linfáticos en todos los pacientes. B. El tiempo de progresión en las últimas semanas en relación con la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad estratificado para detectar la presencia de la linfa linfagiogénesis nodo en pacientes con ganglios negativos.

A. Los diagramas de caja que comparan el número de vasos linfáticos en la región peritumoral con la presencia o ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos. B. parcelas de cajas que compara el número de buques de ganglios linfáticos ganglios regionales en relación con la presencia o ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos en pacientes con vasos linfáticos detectables en los ganglios linfáticos regionales.

Asociación de metástasis en los ganglios linfáticos clasificación y el pronóstico de regresión

en nuestra cohorte, no hubo correlación estadísticamente significativa entre la clasificación de regresión de metástasis de los ganglios linfáticos y la recurrencia tumoral /supervivencia libre de enfermedad en el modelo de Kaplan-Meier en todos los pacientes y en los análisis de subgrupos. En el análisis multivariado ninguna correlación estadísticamente relevante se pudo encontrar.

Discusión

Independientemente del tamaño del tumor y la extensión de la invasión, metástasis de ganglios linfáticos regionales (ypN +) es un importante factor pronóstico en pacientes tratados con neoadyuvante radioquimioterapia [2], [3], [4], [5], [6]. Por lo tanto, es importante para dilucidar los mecanismos de la metástasis en los ganglios linfáticos, así como la forma en la metástasis de ganglios linfáticos podría influir en la supervivencia global del paciente. Aunque controvertidos, linfáticos peritumoral son reportados por algunos para desempeñar un papel en la promoción de la metástasis de los ganglios linfáticos en el carcinoma colorrectal [10], [11], [12], [13] [12], [14], [15]. Utilizamos D2-40 anticuerpo (Podoplanin, superficie de la célula glicoproteína sialilada) [16], [17] para la tinción de los vasos linfáticos en adenocarcinomas primarios y los ganglios linfáticos mesorrectales de 203 pacientes con cáncer rectal. Estos pacientes fueron tratados con radio-quimioterapia preoperatoria seguida de la extirpación quirúrgica completa del tumor (R0). Nuestros resultados indican que no hay una correlación significativa entre la LI peritumoral y intratumoral y el pronóstico del paciente. Curiosamente, se observó ganglios linfáticos linfagiogénesis fue un factor pronóstico importante en esta cohorte de pacientes. Como se informó anteriormente, factores de crecimiento lymphangiogenic tales como VEGF-C y VEGF-A pueden migrar a los ganglios linfáticos regionales de tumores primarios y promover linfangiogénesis [7], [18]. Podemos predecir un fenómeno similar en el cáncer colorrectal, como el nivel de VEGF-C ha demostrado ser elevados en el suero sanguíneo de los pacientes con cáncer colorrectal [19]. Se ha planteado la hipótesis de que los buques de los ganglios linfáticos ganglios pueden actuar como un nicho metastásico de células cancerosas [7], [8], [20], [21] y facilitar aún más la transformación metastásica de las células tumorales. Esto podría llevar a cáncer metastásico resistente a la terapia y por lo tanto es responsable de mal pronóstico del paciente. Los estudios en otros tipos de cáncer también indican un significado pronóstico similar de linfagiogénesis de los ganglios linfáticos. En un modelo de ratón B16 melanoma se demostró que linfangiogénesis ganglio linfático es una respuesta temprana al crecimiento del tumor y precede a la metástasis del tumor [22]. La importancia de centinela linfangiogénesis de los ganglios linfáticos en la diseminación metastásica de cáncer de mama a los ganglios linfáticos no centinela se ha demostrado en pacientes humanos. [23]. Similares resultados indican la importancia de la LI ganglio linfático se reportaron en el cáncer de páncreas [8], la cabeza escamosas y el cáncer de cuello [21], y la enfermedad de Paget extramamaria [20].

Multimodal tratamiento previo de cáncer de recto localmente avanzado ha mostrado beneficios terapéuticos a los pacientes [24]. Anteriormente, se ha demostrado que los factores de crecimiento, por ejemplo, lymphangiogenic VEGF-C se upregulated por las células tumorales durante el estrés y promueve su capacidad de tensión-resistencia, [25] ,, [26]. Por lo tanto, es posible que el estrés terapéutico durante el tratamiento neoadyuvante del cáncer de recto aumenta el nivel de la síntesis de factores de crecimiento lymphangiogenic y aumenta la formación de vasos linfáticos en los ganglios linfáticos regionales. Esto a la larga conduce a la recurrencia del tumor y la metástasis. El bloqueo de la eje lymphangiogenic durante la terapia neoadyuvante por lo tanto, debe mejorar el resultado de las modalidades de tratamiento actuales para el cáncer rectal etapa avanzada. La asociación de linfagiogénesis ganglios linfáticos y peor pronóstico sugiere además la detección de rutina de los ganglios linfáticos linfagiogénesis como un parámetro importante para la predicción de la recaída del cáncer y como un indicador para un tratamiento adyuvante más agresivo.

En conclusión, nuestro estudio demuestra que la presencia de linfagiogénesis intranodal representa un marcador pronóstico independiente asociado con menor supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer de recto localmente avanzado, que son tratados con radio-quimioterapia neoadyuvante. Por lo tanto, las estrategias para la detección de ganglios linfáticos linfagiogénesis en el ámbito clínico podría ayudar a identificar a los pacientes que se beneficiarían de las opciones de tratamiento más agresivo. Además, la inclusión de un enfoque terapéutico para bloquear linfagiogénesis sería beneficioso para los pacientes con cáncer rectal avanzado tratados neoadyuvante.

Materiales y Métodos

materiales de pacientes

El material utilizado en este estudio es cubierto por la aprobación del comité de ética del hospital Universitario "Carl Gustav Carus", TUD-Facultad de Medicina, para el uso en la investigación (EK59032007; "Feingewebliche und molekularpathologische Untersuchung en Langzeit-archiviertem Gewebsmaterial des Institut fuer Patología des UNIVERSITAETSKLINIKUM Dresden /Medizinische Fakultaet Carl Gustav Carus, TU Dresden "; Presidente del Comité: W. Kirch, MD). La decisión del comité de ética de la aprobada específicamente el uso de material de tejido para este estudio mínimamente invasiva y retrospectivo que utiliza materiales de pacientes que ha sido almacenada durante más de tres años. Todos los pacientes dieron su consentimiento para el uso de material de tejido para la investigación (como se señala en los expedientes de los pacientes). Según comité consentimiento oral de la ética es suficiente en este caso (este procedimiento de autorización es aprobada por el comité de ética de la) debido a que el material utilizado aquí no está asociado con el nombre del paciente y se codifica. Doscientos tres pacientes (masculinos: n = 152, femeninos: n = 51, edad media = 70 años) con adenocarcinoma de recto localmente avanzado (UICC fase II /III) entre 2001 y 2008 se incluyeron en este estudio (Figura 1). Todos los pacientes fueron sometidos a preoperatoria (neoadyuvante) 5-fluorouracilo (5-FU) radioquimioterapia basada y cirugía curativa R0 en analogía al aleatorizado de fase III de ensayos alemanes cáncer rectal CAO /ARO /AIO-94 [1]. Los datos de las recaídas de la enfermedad (metástasis distante o recurrencias locales), así como otros datos relevantes fueron recuperados de la base de datos del Instituto de Patología, Hospital Universitario "Carl Gustav Carus", Facultad de Medicina de la Universidad de Dresden, Alemania.

el examen patológico del espécimen de cáncer después de la terapia neoadyuvante

se tomaron al menos cuatro muestras y se evaluaron desde el cáncer rectal primario. En el caso del cáncer residual oculta durante el examen macroscópico, la antigua área completa del cáncer se ha incrustado y estudiado por histología. En el caso de la ausencia de células cancerosas residuales en las células cancerosas epiteliales vitales de tinción HE se detectaron por tinción con citoqueratina. Este procedimiento asegura que la fibrosis del tejido terapia inducida, así como acumulaciones de mucina extracelular no se consideraron como el tejido de cáncer residual y incuded en la clasificación regresión del tumor. Mesorrectales ganglios linfáticos regionales fueron disecados de acuerdo con la "Unión Internacional contre el cáncer" (UICC). En caso de examen de menos de doce ganglios linfáticos regionales mesorrectales perirrectales tejido graso (mínimo de diez bloques de parafina), se incorporaron y se evaluó la presencia de otros ganglios linfáticos que no eran detectables mediante el examen macroscópico. Para detectar las células cancerosas residuales tinción pancytokeratin se realizó según lo descrito.

El tumor y los ganglios linfáticos de clasificación de regresión de metástasis

regresión tumoral histopatológico (TRG) dentro del tumor primario se clasifican de acuerdo con el sistema establecido por semicuantitativo Dworak et al. [9]: TRG 0 = ninguna regresión; TRG 1 = masa tumoral dominante con fibrosis o mucina obvia; TRG 2 = fibrótico dominantemente o cambios mucinosos, con pocas células tumorales o grupos; TRG 3 = muy pocas células tumorales en tejido fibrótico o mucinoso; células TRG 4 = no tumorales, solamente fibrótica o masa mucinoso /regresión total de [2] (Fig. 2).

Evidencia de respuesta del tumor a radioquimioterapia preoperatoria dentro de los ganglios linfáticos perirrectales se definió como la presencia de fibrosis nodal o piscinas de mucina (con o sin células tumorales residuales), como se describe anteriormente [27], [28]. La linfa regresión nodo metástasis (LRG) se evaluó con los mismos parámetros, como la regresión del tumor primario considerando cada ganglio linfático metastásico: LRG 0 = no regresión; LRG 1 = masa tumoral dominante con fibrosis o mucina obvia; LRG 2 = fibrótico dominantemente o cambios mucinosos, con pocas células tumorales o grupos; LRG 3 = muy pocas células tumorales en tejido fibrótico o mucinoso; LRG 4 = no hay células tumorales, solamente fibrótico o mucinoso masa /regresión total. ganglios linfáticos no metastásico se distinguen de los de regresión metastásico total (LRG 4) por la ausencia de fibrosis o mucina (Fig. 2). Cuando se encontraron diferentes GLRs en un paciente, se consideró sólo el ganglio linfático con la peor regresión.

La inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó en 2 micras secciones de bloques incluidos en parafina del tumor primario y ganglios linfáticos regionales. Desparafinación, rehidratación y recuperación del antígeno se realizó mediante la cocción al vapor (98 ° C, 45 min) en tampón PT Módulo (pH 8,0) (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemania). Los tejidos se lavaron en solución salina tamponada con Tris (TBS) (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemania) y se incubaron con anti podoplanin humano de ratón monoclonal D2-40 la detección de anticuerpos (DAKO, Hamburgo, Alemania, 1:400 dilución) durante 30 min a temperatura ambiente. Entonces, la actividad peroxidasa endógena fue inhibida por la incubación de los portaobjetos en 3% H
2O
2 durante 10 minutos. Después de lavar en TBS, Ultravisión LP gran volumen de sistema de detección de HRP Polímero (Thermo Scientific, Medac, Hamburgo, Alemania) se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las secciones fueron teñidas con 0,5 mg /ml de diaminobenzidina tetrahydrochlorid (DAB) y contra el teñidas con hematoxilina. En todos los experimentos, se incluyeron controles positivos y negativos.

Evaluación de inmunohistoquímica

densidad de los vasos linfáticos se evaluó por el método de "punto caliente" como se ha descrito anteriormente y también se hace referencia como la Chalkley método de punto de retícula [29]. En resumen, todas las diapositivas fueron escaneadas a bajo aumento (x40) y se identificaron las zonas con mayor densidad de vasos positivos D2-40. Entonces, el número de vasos positivos D2-40 se contó en aquellos ámbitos en los cinco campos de alta potencia (HPF, x400) por dos patólogos independientes (CJ y MHM) sin conocer los hallazgos clínico-patológicos, y el valor medio de los recuentos de los vasos eran calculado. Intratumoral (vasos linfáticos dentro de la masa tumoral) y peritumoral (vasos linfáticos fuera del tumor, pero dentro de 2 mm desde la parte delantera invasión tumoral) LVD se determinó por separado. No se contaron los vasos cerca de las zonas ulceradas. LVD se evaluó en todos los ganglios linfáticos mesorrectales disecados incluyendo metástasis nodales, tejido linfoide residual de los ganglios linfáticos metastáticos (si existe), y todos los ganglios linfáticos no metastásicos. Vasos preexistentes intranodal (intermedios, así como marginal sinusal) no se contaron. Durante la evaluación del acuerdo de alto interobservador fue confirmada mediante el uso de coeficiente Kappa de Cohen (κ = 0,8; p & lt; 0,001). En caso de diferencias interobservador, el caso fue reevaluado de una nueva evaluación simultánea de la muestra.

El análisis estadístico

Todas las pruebas se realizaron con SAS JMP Versión 9. Las asociaciones entre las diferentes variables categóricas se evaluaron utilizando la χ
2 test. Las variables continuas se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney o ANOVA. Tiempo para las tasas de progresión se compararon mediante el análisis univariante de Kaplan-Meier, se realizó un análisis multivariado mediante el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox con las covariables ypUICC-etapa, la edad, el género, la regresión del tumor, intratumoral linfático densidad de los vasos, peritumoral linfático densidad de los vasos, ganglio linfático densidad de los vasos linfáticos. Los valores de P menor que 0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Reconocimientos

Los autores agradecen a Marissa J Stanton, de la Universidad de Nebraska Medical Center, para la revisión crítica del manuscrito.

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