Extracto
metástasis ganglionares indica mal pronóstico en el cáncer de esófago. Para comprender los mecanismos subyacentes, la mayoría de los estudios hasta ahora se centraron en la investigación de los tumores ellos mismos y /o ganglios linfáticos invadidos. Sin embargo se olvidaron de los eventos potenciales dentro del nicho metastásico, que preceden la invasión. Aquí se presenta la primera descripción de estos reglamentos en los pacientes en el nivel de transcripción. Se determinó perfiles de transcriptómica de los ganglios linfáticos regionales Metástasis todavía libre para dos grupos de pacientes: pacientes clasificados como pN1 (n = 9, existen linfáticos metastásicos) o pN0 (n = 5, no existen linfáticos metastásicos). Todos los ganglios linfáticos investigados, también los de los pacientes pN1, seguían siendo la metástasis libre. Los resultados muestran que los ganglios linfáticos regionales de pacientes pN1 difieren decisivamente de las de los pacientes pN0 - incluso antes de que la metástasis haya tenido lugar. En el grupo de pN0 se observaron patrones de respuesta inmunes distintas. En contraste, los ganglios linfáticos del grupo pN1 exhibieron un perfil claro de la respuesta inmune reducida y la proliferación reducida, pero el aumento de la apoptosis, el aumento de la hipoplasia y procesos de conversión morfológicas. DKK1 era el gen más significativo asociado con los mecanismos moleculares que tienen lugar en los ganglios linfáticos de pacientes que sufren de metástasis (pN1). Suponemos que los dos perfiles moleculares observados constituyen diferentes etapas de una enfermedad progresiva. Por último, sugerimos que DKK1 podría desempeñar un papel importante dentro de los mecanismos que conducen a la metástasis de los ganglios linfáticos
Visto:. Otto B, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke A, K Klaetschke, Vashist YK, et al. (2014) Los cambios moleculares en premetastásico ganglios linfáticos de pacientes con cáncer de esófago. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10.1371 /journal.pone.0102552
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: Abril 8, 2014; Aceptado: 20 Junio 2014; Publicado: 21 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Otto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos de microarrays se han depositado en el NCBI GEO repositorio público y son accesibles con el número de GSE51021
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Stiftung für und Pathobiochemie Molekulare Diagnostik, Deutsche Gesellschaft für Vereinte Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin eV Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En el cáncer de esófago (CES), la metástasis de los ganglios linfáticos se asocia con un mal pronóstico. Durante la migración de las células tumorales a través de los vasos linfáticos y durante su homing en los ganglios linfáticos, estas células tumorales entrar en contacto cercano a las células endoteliales y los senos de los ganglios linfáticos. La expansión del tumor actualmente constituye la base principal para la selección de la terapia. Pero a pesar de la gran importancia pronóstica de las metástasis lymphogenic, los mecanismos moleculares que subyacen a esta vía metastásico siguen siendo en su mayoría desconocidos
Una serie de estudios investigaron los perfiles moleculares de los tumores [1] - [4]. Y /o la . ganglios linfáticos metastásicos [5] Otros estudios investigaron metástasis lymphogenic en correlación con la angiogénesis linfático [6] - [9] y de quimioquinas asociado [10] - [12] migración. Se asumió que dirige la migración de células de carcinoma de esófago podrían ser guiadas por quimioquinas expresadas localmente. [12] Y en base a estos resultados sería imaginable que el proceso de toma de referencia en los ganglios linfáticos puede ser asistida por lectina-glicano-interacciones entre el tumor células y células linfáticas endoteliales. Hirakawa et al. [13] demostraron que en ratones, incluso antes de metástasis, tumores primarios (cáncer de piel) podría estimular el ganglio linfático centinela linfagiogénesis. Sugirieron que los tumores primarios podrían ser capaces de preparar su nicho metastásico futuro mediante la producción de factores lymphangiogenic que podrían mediar el transporte eficiente de los ganglios linfáticos centinela.
Sin embargo, al mejor conocimiento de los autores, no hay obra publicada en concreto examinar los mecanismos moleculares tempranos en este nicho metastásico en pacientes -. mecanismos dentro de los ganglios linfáticos no afectados, lo que podría propagar o suprimir la metástasis temprana en pacientes que sufren de ESC
El objetivo de este estudio, por lo tanto fue investigar específicamente estas primeras alteraciones en los ganglios linfáticos antes de la histopatológicamente metástasis detectable. El trabajo ha sido impulsado por la hipótesis de que las células tumorales antes de metástasis a los ganglios linfáticos regionales, los cambios importantes deben haber tenido lugar ya propagar o suprimir el proceso de toma de referencia. Para tener una visión de este proceso, se recogieron los ganglios linfáticos regionales y distantes de tumores de pacientes que sufren de etapas ESC como pN0 (no existen linfáticos metastásicos) o pN1 (existen linfáticos metastásicos). Todos los ganglios linfáticos incluidos en el análisis estaban libres de metástasis - independientemente de la puesta en escena del paciente. Se realizó el análisis de microarrays y se investigaron los mecanismos vinculados a los genes expresados diferencialmente entre los ganglios linfáticos regionales y distantes del mismo paciente.
La clave para nuestro trabajo aquí son dos características. En primer lugar, toda analizaron los ganglios linfáticos sin excepción, incluso las de los pacientes pN1, todavía estaban libres de metástasis. En segundo lugar, hemos utilizado muestras de pacientes que no se sometieron a cualquier radio-quimioterapia neoadyuvante y procedimientos adicionales establecidos que aseguraban calidad de la muestra muy alto.
Materiales y Métodos
flujo de trabajo Análisis general
los pacientes incluidos sufrían de cáncer de esófago y se les realizó una esofagectomía radical toracoabdominal en bloque incluyendo la disección de los ganglios linfáticos del mediastino superior e inferior (resección R0) sin radio-quimioterapia neoadyuvante. Se incluyeron sólo los ganglios linfáticos de pacientes en escena como pN0 (ganglios linfáticos regionales libres de metástasis) o pN1 (ganglios linfáticos regionales metástasis está presente) y verificados por histopatología que los ganglios linfáticos seleccionados para nuestro análisis fueron todas las células tumorales libre. También confirmó por inmunohistología que estos ganglios linfáticos estaban libres de micro-metástasis. Estamos aislados el uno del ARN total de los ganglios linfáticos para el análisis de microarrays de expresión. Se utilizó un ensayo T por parejas para la identificación de genes que son expresados diferencialmente entre los ganglios linfáticos regionales y distantes y se realizó un enriquecimiento y análisis funcional de la red. Posteriormente principales candidatos fueron validados mediante PCR en tiempo real y DKK1 fue validado además por medio de tinción inmunohistoquímico.
Configuración del experimento
El objetivo del trabajo presentado aquí fue identificar los factores que pueden favorecer y estimular la metástasis en ganglios linfáticos de pacientes que sufren de carcinoma de esófago. Para habilitar esta comprensión del diseño de experimentos (Fig. 1) incorpora dos variables de interés.
Se investigaron los ganglios linfáticos de dos grupos diferentes de pacientes que sufren (pN1) o no sufren (pN0) de metástasis en los ganglios linfáticos. De cada uno de los ganglios linfáticos regionales del paciente (adyacentes al tumor) se compararon a los ganglios linfáticos distantes (de referencia como línea de base). La clave del experimento es que
Todos los
investigaron los ganglios linfáticos, incluyendo las de los pacientes pN1, se hicieron seguramente será todavía libre de metástasis, así como micro-metástasis.
En primer lugar, las muestras se clasificaron de acuerdo con el estado principal de los pacientes que muestran (grupo pN1) o no exhibiendo metástasis (grupo pN0) en los ganglios linfáticos regionales. La comparación de los pacientes pN0 pN1 y debe poner de relieve las diferencias generales en las regulaciones que pueda dar lugar o prevenir la metástasis.
En segundo lugar, se recogieron dos muestras de ganglios linfáticos de cada paciente, un nodo situado cerca del tumor (regional ) y el segundo nodo distante al tumor. Mientras que los nodos distantes sirvieron como muestra de referencia los nodos regionales fueron investigados por los reglamentos de la transcripción. La comparación por pares de las muestras tumorales distantes con los nodos regionales específicas del paciente debe revelar los primeros reglamentos que pudieran ser derivadas de la ubicación cerca del tumor. En esta publicación el término "regulación" se utiliza para los genes y las funciones que muestran una mayor expresión en los ganglios linfáticos regionales en comparación con los ganglios linfáticos distantes. Por el contrario, los genes y las funciones que han disminuido en los ganglios linfáticos regionales se denominan "las reguladas".
Es importante tener en cuenta que todos los nodos investigados se hicieron seguramente será todavía la metástasis libre, independiente de los pacientes "clasificación pN1 /pN0 y de la ubicación en relación con el tumor. Esto debería permitir la identificación de los primeros cambios que se producen
antes
a homing metástasis
Ética aprobación del comité & amp.; consentimiento de los pacientes
Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la normativa aplicable, y fue aprobado por el Comité de Ética de Hamburgo, Alemania, con el número voto PV3548. Los pacientes consentimiento para participar en el estudio se recogieron por escrito de conformidad con la normativa aplicable.
Material de las muestras
Se analizaron muestras totales de 22 pacientes con carcinoma de esófago de los cuales 14 pares de muestras exhibieron una muestra adecuada calidad. Para cada uno de los pares de muestras de pacientes de cerca del tumor y los ganglios linfáticos distantes del tumor fueron recogidos para reducir las diferencias interindividuales que podrían ocurrir debido a las divergencias antecedentes genéticos. Los ganglios linfáticos se disecaron inmediatamente después de la extracción en la sala de operación. Los segmentos que se dedicaron para el análisis de microarrays de expresión fueron transportados directamente en nitrógeno líquido al laboratorio para la extracción de RNA. La otra parte de los ganglios linfáticos se incluyó en parafina para la clasificación y el diagnóstico.
Operación procedimiento
Después de un diagnóstico histológico de carcinoma de esófago, los pacientes con lesiones en fase inicial (PT1A) fueron remitidos a la cirugía o bien si la resección endoscópica fue incompleta o el tumor se representó como pT1b. Los pacientes fueron remitidos directamente a la cirugía si la estadificación preoperatoria era sospechosa, ya sea para la participación muscular de la pared (los T2) o afectación de los ganglios linfáticos (CN1). Ningún paciente fue sometido a la terapia neoadyuvante.
Todos los pacientes fueron sometidos a laparotomía mediana en forma de T y la toracotomía del lado derecho. Para los pacientes con anastomosis cuello se realizó una cervicotomıa adicional en el lado izquierdo para la anastomosis collar. Cada paciente recibió un radical de la esofagectomía en bloque con la resección del esófago, el conducto torácico, la vena ácigos, la pleura ipsilateral, y todo el tejido periesofágico en el mediastino posterior. La reconstrucción se realiza por sonda gástrica o interposición de colon por lo general con un alto intratorácica o anastomosis cervical.
Además, se realizó una linfadenectomía normalizado de dos campos. Todos los ganglios linfáticos fueron muestreados sistemáticamente de ocho lugares: mediastinal regional, tanto en la vecindad del tumor y distante de ella; infraclavicular; diafragmática (mediastino inferior); ganglios linfáticos perigástrica (incluyendo, a izquierda y derecha pericárdico); los ganglios linfáticos de la arteria hepática común; y los ganglios linfáticos en el tronco celíaco. Todos los nodos fueron asignadas por el cirujano según el esquema de la Sociedad Torácica Americana modificado por Casson y col. [14] Todas las piezas resecadas fueron evaluadas por un patólogo de alto nivel.
El seguimiento postoperatorio se realizó como parte de la atención posterior habitual. Los pacientes fueron atendidos en la consulta externa de intervalos de 3 a 4 meses durante los primeros 2 años y en intervalos de 6 meses a partir de entonces. La evaluación de seguimiento incluyó el examen físico, radiografía de tórax, ecografía abdominal, endoscopia, ecografía, TAC de tórax y abdomen, con PET-TAC después de enero de 2006, en casos seleccionados, CEA y CA 19-9 marcadores tumorales estudios, y las gammagrafías óseas . Cada vez que se sospecha de recaída, radiológico adicional, endoscópica, o se solicitó la confirmación histológica.
La recurrencia se diagnostica si demostrado por biopsia o por la evidencia inequívoca de masas tumorales (metástasis que acababan de aparecer o recurrencia local), con una tendencia a crecer durante seguimiento más allá y /o seguimiento hasta la muerte. La enfermedad recurrente se definió como cualquiera locorregional (que se producen en el abdomen superior o mediastino) o metástasis distantes.
tinción micrometástasis
hematoxilina y eosina tinción se utiliza para la detección de células tumorales en una primera etapa de diagnóstico . Histológicamente ganglios linfáticos "libres de tumor" se investigan luego usando inmunohistoquímica anti-citoqueratina anticuerpo AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido 1:50 (v /v) por el método de biotina-estreptavidina como se describió anteriormente [15]. AE1 /AE3 es un cóctel de dos anticuerpos que reconocen de básico y ácido CK en la superficie y en el citoplasma de todas las células epiteliales (excepto las células parietales, hepatocitos, y las capas superficiales de epitelio escamoso). Los anticuerpos no reaccionan con tejido mesenquimatoso, incluyendo el tejido linfoide [16].
formalina fijo y secciones embebidas en parafina de 5 a 6 m de espesor se cortaron en tres niveles diferentes en cada nodo y eliminó la parafina de acuerdo con técnicas histológicas estándar y se transfirieron a portaobjetos de vidrio tratados con 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Alemania). Una sección de la muestra obtenida en cada nivel se tiñó utilizando la técnica de la fosfatasa de la fosfatasa alcalina-anti-alcalina combinado con la nueva mancha fuchsine (Sena, Heidelberg, Alemania) para la reacción de visualización [17].
Secciones de la normalidad mucosa de colon sirvieron como controles de tinción como positivas y isotipo, anticuerpos monoclonales murinos irrelevantes sirvieron como controles negativos (proteína de mieloma purificada de inmunoglobulina de ratón para IgG1; Sigma, Deisenhofen, Alemania).
Los portaobjetos se evaluaron en un procedimiento ciego por dos investigadores independientes. En caso de resultados incongruentes un tercer investigador fue consultado y se tomó la decisión consensuada. la participación de células tumorales Minimal en un ganglio linfático que se considera que es libre de tumor por tinción histológica convencional se definió como la presencia de uno a diez células positivas en el cuerpo del nodo.
Preparación de la muestra y la purificación
Aislamiento de ARN total de nitrógeno congelado muestras de ganglios linfáticos líquidos se realizó con el Trizol de Invitrogen de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (fecha Rev. 12 de junio de 2007) y se purificó después con el RNeasy-Mini-Kit Qiagen. Las concentraciones se determinaron con un fotómetro PEQLAB NanoDrop y la calidad del ARN por electroforesis capilar utilizando un Sistema 2100 de Agilent Bioanalyzer. De los 22 pares de muestras 9 pares de pacientes con metástasis ahora observados y 5 pares de muestras de pacientes con metástasis en el momento observado ningún mostraron un ARN de calidad suficiente para el siguiente análisis.
Análisis de microarrays
Microarray los experimentos se realizaron usando Affymetrix GeneChips todo el genoma humano U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, EE.UU.) según el protocolo de los fabricantes. Para preparar el ARN para la matrices de expresión de ADNc de síntesis con precedente determinación fotométrica de la concentración de ARN se realizó. Los siguientes pasos se realizaron usando 250 ng de ARN total para la primera síntesis de la cadena. Preparación de la muestra incorpora pasos para la síntesis de ADNc, purificación, síntesis de la biotina cRNA-labled, la transcripción in vitro, la fragmentación, la hibridación, así como el lavado y la tinción. La preparación se realizó de acuerdo con el Protocolo de un ciclo con el GeneChip 3 Kit 'IVT Express desde Affymetrix. Para la hibridación 12,5 g se utilizaron cRNA fragmentado. Los arrays se incubaron durante 16 h en el Affymetrix Hybidization Horno 640 a 45 ° C. Lavado y tinción de las etapas se realizaron semiautomática en la estación de fluidos 450 Affymetrix, los pasos individuales siguiendo el protocolo de Affymetrix Ciclo Uno de matrices estándar. Después de lavar y teñir las matrices fueron escaneados utilizando el escáner Affymetrix GeneChip 7G 3000 y el software de la consola de comandos a una longitud de onda de 570 nm y un tamaño de píxel de 1,56 micras.
El análisis estadístico
Los ganglios linfáticos de ambos grupos de pacientes (pN0 y pN1) se analizaron de forma independiente. A medida que el enfoque de este trabajo fueron los primeros cambios anteriores metástasis, se analizaron únicamente Metástasis ganglios linfáticos libres. Las muestras de los ganglios linfáticos distantes del tumor se utilizaron como referencia para los ganglios linfáticos regionales emparejadas.
Corrección de fondo y la normalización se realizaron utilizando el procedimiento de RMA y cuantil normalización. Un ensayo T por parejas dentro de los dos grupos (pN0, pN1) y se llevó a cabo un procedimiento de bootstrapping se realizó para ajustar las regulaciones de falsos positivos. Como punto de corte valores de un p-valor corregido de 0,05, un p-valor crudo de 0,01 y una relación señal-log (SLR) de ± 0,7 se utilizaron para determinar el mejor de los genes regulados.
Después de la expresión génica diferencial El análisis se realizó un conjunto de genes de enriquecimiento y análisis de la red con el software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, versión 162830). Para el análisis de la p-valor de corte corregido se establece en un valor menos estricto de ± 0,1 para permitir la incorporación de los cambios más sutiles.
Validación mediante RT-PCR
Doce de los determinada genes candidatos fueron validados a través de RT-PCR utilizando tres técnicas repeticiones por muestra. La RT-PCR se realizó con placas de 96 pocillos en el sistema de PCR en Tiempo Real StepOne Plus de Applied Biosystems. Para cada muestra de 2 l con una concentración de 5 ng /l se utilizaron. Para tener en cuenta las fluctuaciones de la concentración de la muestra Beta-2-microglobulina (B2M) se tomó como referencia el servicio de limpieza. Para la determinación de las normas sobre el nivel de expresión se calculó el valor medio de los valores Ct-delta de los tres técnica repeticiones. Importancia de los cambios se determinó usando un ensayo t por parejas entre-CT-valores delta medias distantes del tumor estrechas y tumorales dentro de cada grupo (pN0, pN1).
DKK1 La inmunohistoquímica se realizó
La inmunohistoquímica en secciones de parafina de los ganglios linfáticos investigados utilizando anticuerpo policlonal contra DKK1 (1:100, Abcam,#ab61034). Para la detección inmunohistoquímica secciones se deparaffinized, rehidratada, y pre-tratadas con 0,1% pronasa, durante 10 minutos para desenmascarar el antígeno enzimática. Después de la incubación en peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena y la incubación con 5% de BSA durante 30 min para bloquear la unión no específica de anticuerpos se aplicó anticuerpo primario. La tinción inmunohistoquímica se realizó durante la noche a 4 ° C. Se utilizó una IgG biotinilado secundario de cabra anti-conejo (1:200, Dako Cytomation), seguido de incubación con una estreptavidina /HRP (1:200, Dako Cytomation) como un tercer anticuerpo. actividad de la peroxidasa se detectó utilizando DAB como sustrato cromogénico (Dako Cytomation). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Las imágenes se recogieron en un escáner de diapositivas Zeiss Mirax MIDI (Zeiss) y las imágenes fueron capturadas utilizando el software Pannoramic Visor.
Resultados
ganglios linfáticos regionales sin metástasis difieren entre los pacientes y pN1 pN0 en transcriptómica nivel
Nos preguntó si a) el nicho metástasis en los ganglios linfáticos podría verse afectada incluso antes de la metástasis ha tenido lugar y si b) siendo la metástasis gratuitas ganglios linfáticos de pacientes pN1 podría ser más al borde de la invasión metastásica de aquellos de los pacientes pN0 y si c) por lo que dichas "pN1" ganglios linfáticos pueden exhibir desregulaciones de la transcripción distintos relacionados con la preparación de nicho
Se incluyeron los ganglios linfáticos regionales tumorales de 14 pacientes con carcinoma de esófago (n = 9 pacientes pN1.; n = 5 pacientes pN0) para investigar la expresión de genes en el potencial metastásico nicho. Además hemos recogido un ganglio linfático distante del tumor de cada paciente emparejado para servir como referencia para los nodos regionales (Fig. 1). Posteriormente se analizaron en el nivel transcriptómica por la tecnología de microarrays.
La clave para el trabajo que se presenta aquí es que todos los nodos investigados se confirmó que eran histopatológico y metástasis inmunohistológicamente y libre de micrometástasis, independiente de la clasificación pN1 /pN0 de los pacientes y de la ubicación en relación con el tumor. Esto debería permitir la identificación de los primeros cambios que ocurren
antes
a homing metástasis. Información sobre los pacientes edad, el sexo, la histología o clasificaciones se proporciona en la Tabla S1.
Para identificar los posibles cambios pre-invasoras se compararon los ganglios linfáticos regionales, con los ganglios linfáticos distantes usando un ensayo T por parejas dentro de la dos grupos (pN0, pN1). Los ganglios linfáticos distantes del tumor sirvieron como referencia para los nodos regionales, de tal manera que hasta-regulaciones representan los genes con un mayor nivel de expresión en los ganglios regionales y hacia abajo-regulaciones respectivamente los genes con un menor nivel de expresión. El T-test fue seguido por un procedimiento de bootstrapping para dar cuenta de las múltiples pruebas. Como punto de corte valores de un p-valor corregido de 0,05, un p-valor crudo de 0,01 y una relación señal-log (SLR) de ± 0,7 se utilizaron para determinar la parte superior genes regulados. Los candidatos más importantes identificados se muestran en la Tabla 1, las estadísticas completas se proporcionan en la Tabla S2.
La aplicación de estos umbrales que hemos identificado 173 genes transcritos (128) reguladas de manera significativa entre los ganglios linfáticos regionales y distantes de pN0- Los pacientes clasificados. Varios de estos genes estaban asociados con la respuesta inmune (por ejemplo, CD64, CD32,
FPR1
y
fpr2
, [18]
IGHG1
,
IL1R2
,
CCL23
,
MSR1
,
C5AR1
,
LILRA5
, [19] o
LILRB2
[20]). Es interesante que un par de genes del cáncer y la metástasis asociada fueron desregulados, así (como
L1CAM gratis (CD171), [21]
EREG
, [22], [23]
Nova1
,
HPR
, [24] o
LAMC2
[25], [26]). Epirregulina, por ejemplo, es un factor angiogénico que pueden propagar la metástasis al permitir que las células tumorales infrinjan las barreras endoteliales pulmonares y a su vez por la liberación de ellos en el sistema de circulación [22], [23].
Por el contrario hemos identificado 134 transcripciones desregulados (109 genes, incluyendo
IGF1
,
DKK1
,
PRIMA1
y
LTF
) en los ganglios regionales de pacientes clasificados-pN1. Entre estos genes se redujeron reguladas moléculas pro-proliferativos y anti-apoptóticos - como
IGF1
y
LTF
que actúan a través de la regulación de la vía AKT [27] y ERK1 /2 vía de señalización [28], respectivamente. PRIMA1 modula la expresión de CXCR4 [29] -. Una molécula que ya se ha descrito una correlación significativa con el aumento de la metástasis linfática [11], [12], [29]
Cabe destacar que
DKK1
exhibieron la más importante desregulación (2 veces el cambio; valor de p de 0,0029). El gen fue claramente reducido regulado en los ganglios linfáticos regionales de pacientes pN1. DKK1 es un inhibidor de la vía WNT que se ha demostrado ser de importancia pronóstica en diversas entidades tumorales tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, mieloma, sino también en carcinoma de esófago [30] - [38]. Además se informó de DKK1 a ser elevados en el suero de los pacientes ESC [37].
validado 12 de los genes más relevantes a través de RT-PCR (Fig. 2). Para cinco de estos genes (
ISL1
,
LAMC2
,
Nova1
,
EREG
,
L1CAM
) las tendencias de regulación y fortalezas se confirmaron pesar de que los valores p determinados en el análisis de PCR oscilaron entre 0,08 y 0,15, probablemente debido al tamaño pequeño de la muestra. Siete genes (
IGF1
,
IGFBP5
,
DKK1
,
LTF
,
TBX3
,
FOXG1
,
LILRA
) podría validarse mostrando con éxito un importante valor de p por debajo de 0,05. Más alta significación (p-valor de 3 * 10e-4) se observó de nuevo por
DKK1 gratis (véase la Tabla S3).
que se muestra la señal de diario de los coeficientes de los ganglios linfáticos regionales en comparación a los ganglios linfáticos distantes del tumor (referencia) para un conjunto seleccionado de los mejores genes regulados.
en la época de cinco pacientes pN1 de seguimiento análisis había muerto, así como un paciente pN0. Este último paciente había exhibido la metástasis de pulmón en un examen de seguimiento. Es interesante que este paciente constituye un caso atípico en términos de
DKK1
expresión que muestra una baja regulación en los ganglios linfáticos regionales.
Los resultados descritos en esta sección muestran que estas libre de metástasis pN1 ganglios linfáticos de exposiciones reglamentos de genes claramente diferentes de las de los ganglios linfáticos pN0. Además indican que DKK1 podría estar asociado de forma significativa con los mecanismos subyacentes.
Los patrones funcionales en muestras pN0 y pN1 son distintos pero estrechamente conectado
Sobre la base de estos hallazgos nos preguntamos si los reglamentos observados de hecho representar diferentes mecanismos moleculares - o simplemente diferentes representantes de los mismos mecanismos. Para ello hemos realizado el enriquecimiento conjunto de genes y el análisis de redes.
Debido a que el tamaño de la muestra utilizada en nuestro trabajo es bastante pequeña, la distribución de p-valor se ve afectado en el T-test. Teniendo esto en cuenta y para permitir la incorporación de los cambios más sutiles, que sin embargo podría añadir a la imagen grande, decidimos utilizar un valor de p menor estricto de ± 0.1 para identificar los genes regulados para ser incluidos en el análisis.
Nuestro análisis reveló sorprendentemente perfiles distintos (Fig. 3) que caracterizan a los ganglios linfáticos de tumores adyacentes de los pacientes pN1 y pN0. Los resultados mostraron una clara activación de mecanismos de respuesta inmune en el grupo pN0. Los genes regulados se asociaron con una mayor respuesta inflamatoria, la presentación de antígenos, el crecimiento celular reducida, el seguimiento de las células inmunitarias y la señalización de célula a célula, mientras que la proliferación y mecanismos asociados con el cáncer se redujeron.
indicados son funciones biológicas y moleculares y sub-funciones asociadas a los genes regulados en los ganglios linfáticos regionales en comparación con los ganglios linfáticos distantes (de referencia) de pN1 o pacientes pN0. Los círculos transparentes individuales representan las principales funciones, la de color (rojo: se activa, azules: inactivada) círculos representan dentro de las sub-funciones enriquecidas de forma significativa (por ejemplo, dentro pN1 círculo de muerte celular: 'apoptosis de líneas celulares de leucemia' - rojo, o "celda supervivencia "- azul). Azul subfunciones tienen una predicción fuerte como para ser inactivado, rojo subfunciones que se activen. Cuanto más profundo es el color, más fiable (puntuación z) es la predicción del estado de activación. El tamaño de los círculos aumenta con la significación (p-valor) de la asociación de la lista de genes con las subfunciones. El análisis se realizó con el software Ingenuity Pathway Analysis. Se puede ver claramente que los ganglios linfáticos regionales sin metástasis de pacientes pN1 exhiben una regulación de patrón completamente diferente que los de los pacientes pN0.
A diferencia de los ganglios linfáticos regionales de pacientes pN1 mostraron una reducción de la inmunológico mecanismos de respuesta asociado (Fig. 3). Además, se observó reducción de la proliferación, así como la reducción de tejido estructura, morfología y el desarrollo, por una parte - y aumento de la apoptosis y la hipoplasia en el otro. En cuanto a tiempo se debe esperar que estos ganglios linfáticos estarían más cerca del punto de la invasión metastásica por lo que era sorprendente que el patrón de respuesta inmune se había reducido regulado.
Además, el análisis predijo una inactivación de β-catenina y reguladores de aguas abajo (Fig. 4a). Entre los principales objetivos de β-catenina,
VEGFA
,
CCND1
,
MSX1
,
IGFBP5 y DKK1
mostraron una disminución en la expresión en el microarray. Aunque sólo basado en probabilidades estadísticas, la predicción es notable porque se requiere activa β-catenina para
DKK1
expresión. [39] La falta de actividad potencial de la β-catenina, por tanto, podría correlacionarse con la observada baja regulación de
DKK1
.
El análisis de redes se realizó utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis. a) Red mecanicista de la β-catenina reguladores aguas abajo Viendo predijo estado de activación y la relación de regulación (activación o inhibición) entre los reguladores individuales. β-catenina y un número de los reguladores aguas abajo se prevé que se inactivado. b) El análisis muestra una estrecha relación entre los genes regulados en las muestras pN1 (nodos de color gris claro) y las reguladas en las muestras pN0 (nodos de color gris oscuro) unidos por ERK1 /2 y DKK1 incrustado dentro de la red.
Para investigar más a fondo cómo relacionan las vías moleculares subyacentes son, incluimos las regulaciones de expresión génica observados en las muestras pN1 (109 genes) y en muestras pN0 (128 genes) en una lista común y se realizó un análisis de la red. Curiosamente, a pesar de la clara diferencia en los perfiles mecanismo molecular entre las muestras pN1 y pN0, el análisis reveló que varios de los genes involucrados (28/128; 19/109 genes pN0 genes pN1) parecía estar estrechamente conectados (figura 4b.) A través de ambos - grupos. DKK1 con incrustados dentro de la red
en conjunto, estas observaciones sugieren que sin metástasis a los ganglios linfáticos regionales de pacientes pN1 ya están sujetos a procesos moleculares diferentes a las de los pacientes pN0 - lugar, aunque la metástasis todavía no ha tomado en estos nodos. Además de una participación de
regulación DKK1
través de la vía /β-catenina vía parece más plausible. Dicho esto, las redes moleculares que subyacen a estos patrones diferentes podrían estar conectados. En CES metástasis en los ganglios linfáticos pacientes es sólo una cuestión de tiempo, a menos que se realiza una resección del tumor oportuna. Por lo tanto, parece plausible que los patrones de transcripción observadas no se correlacionan con dos mecanismos totalmente diferentes, sino más bien representan dos puntos de tiempo de un proceso que progresa.
DKK1 se puede observar en subestructuras diferentes de los ganglios linfáticos y en las células endoteliales de los vasos
debido a la importancia de los
DKK1 Hoteles en nuestros resultados y porque DKK1 ya se ha demostrado que el pronóstico para el resultado de una serie de entidades tumorales malignas [30] - [38] nos centramos en esta molécula en la validación de inmunohistoquímica. Estamos manchados secciones de parafina de los ganglios linfáticos investigados utilizando un anticuerpo policlonal contra DKK1 y se contratiñeron las secciones con hematoxilina. La tinción inmunohistoquímica reveló una tendencia de DKK1 menos que se expresa en los ganglios linfáticos regionales 'pN1 pacientes (Fig. 5a). En DKK1 linfáticos positivos nodos de su expresión podría ser claramente observado en el seno subcapsular y en algunos casos se extienden en el seno intermediario y trabéculas (Fig. 5b). Por otra parte, en un par de expresión DKK1 muestras se pudo observar en las células endoteliales de los vasos (Fig. 5c).
Los ganglios linfáticos se tiñeron utilizando un anticuerpo policlonal contra DKK1 (1:100, Abcam,#ab61034) y de contraste con hematoxilina. a) Representante de ganglios linfáticos negativos DKK1. Barra de escala: 200 micras. b) Representante DKK1 ganglios linfáticos positivos. El seno subcapsular está marcado con (I) y el seno intermediario y trabéculas con (II). Barra de escala: 200 micras. c) DKK1 células endoteliales vasculares positivos. Barra de escala:.. 100 micras
Discusión
Mientras que varias tasas de incidencia de cáncer se redujeron en los Estados Unidos y otros países occidentales en las últimas décadas la tasa de incidencia de adenocarcinoma de esófago ha aumentado [ ,,,0],40] Uno parámetros que indican progresión de la enfermedad es la expansión del tumor que en la actualidad es la base para la selección de la terapia.