Extracto
Aplicaciones
El análisis de los exosomas /microvesículas (vesículas extracelulares (EVs)) y la ARN empaquetados dentro de ellos (exoRNA) tiene el potencial de proporcionar una plataforma no invasiva para detectar y controlar la expresión de genes relacionados con la enfermedad potencialmente
en lugar Red de procedimientos más invasivos, como la biopsia. Sin embargo, pocos estudios han puesto a prueba la capacidad diagnóstica del análisis de EV en los seres humanos
Diseño Experimental
La capacidad de análisis de EV para reflejar con precisión la expresión de ARNm de tejido prostático se examinó mediante la comparación de TMPRSS2 EV urinaria:. ERG exoRNA de prostatectomía pre-radical (PR) pacientes frente al tejido RP correspondiente en 21 pacientes. Para examinar la expresión diferencial de TMPRSS2: ERG través de los grupos de pacientes de una muestra de orina al azar fue tomada sin masaje de próstata a partir de una cohorte de 207 hombres incluyendo negativo biopsia de próstata (Bx Neg, n = 39), la biopsia de próstata positiva (Bx Pos, n = 47 ), la prostatectomía radical post-(post-PR, n = 37), los hombres de la misma edad sanos un-biopsia (Bx n, n = 44) y controles de varones jóvenes (Cont, n = 40). El uso de los vehículos eléctricos se examinó también como una plataforma potencial para no invasiva diferenciar Bx Pos Neg frente a los pacientes Bx a través de la detección de genes conocidos de cáncer de próstata TMPRSS2:. ERG, BIRC5, ERG, de PCA3 y TMPRSS2
Resultados
En este estudio piloto técnica de vehículos eléctricos urinarios tenían una sensibilidad: 81% (13/16), especificidad: 80% (4/5) y una precisión global: 81% (17/21) para la detección no invasiva de TMPRSS2: ERG frente tejido RP. Se encontró detección ERG exoRNA aumentar con la edad y el nivel de expresión correlaciona con la condición Bx Pos: La tasa de TMPRSS2. análisis característicos del operador receptor demostraron que varios genes relacionados con el cáncer podrían diferenciar Bx Pos Neg de Bx pacientes utilizando exoRNA aislado de los vehículos eléctricos urinarios: BIRC5 (AUC 0,674 (IC: 0,560 hasta 0,788), ERG (AUC 0,785 (IC: 0,680 a 0,890), PCA3 (AUC 0,681 (IC: 0,567 a 0,795), TMPRSS2: ERG (AUC 0,744 (IC: 0,600-0,888), y TMPRSS2 (AUC 0,637 (IC: 0,519 a 0,754)
Conclusión
Este estudio piloto sugiere que los vehículos eléctricos urinarios tienen el potencial de ser utilizado como una plataforma de manera no invasiva diferenciar a los pacientes con cáncer de próstata con una precisión muy buena. se necesitan estudios más amplios para confirmar el potencial de utilidad clínica.
cita:.. Motamedinia P, Scott AN, Bate KL, Sadeghi N, Salazar G, Shapiro e, et al (2016) Los exosomas de orina para la medida no invasiva de la expresión génica y mutaciones del cáncer de próstata PLoS ONE 11 (5): e0154507 . doi: 10.1371 /journal.pone.0154507
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: 6 Agosto, 2015; Aceptado: 14 de abril de 2016; Publicado: 4 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Motamedinia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. J Lin recibió un premio de la Fundación Caritativa Doris Duke. Este estudio fue apoyado por exosome Diagnostics, Inc. El donante prestado apoyo en forma de salarios de los autores ANS, KLB, GS, MJD, WDC, LMR, y tuvo un papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, y la preparación del manuscrito. . Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses: ANS, KLB, GS, WDC, LMR, y MJD eran empleados o consultores de los exosomas Diagnostics, Inc. en el momento de el estudio. WDC es accionista de exosome Diagnostics, Inc. LMR tiene opciones sobre acciones en exosome Diagnostics, Inc. Estos intereses en competencia, no afectan a la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales.
Introducción
Los exosomas y microvesículas son vesículas bicapa lipídica (normalmente 30-200 nm de diámetro). Durante la formación, exosomas y microvesículas (denominados colectivamente en este documento como vesículas extracelulares (EVs)) encapsulan una parte de los citoplasma de la célula padre, incluyendo proteínas de membrana, proteínas citosólicas [1] y ácidos nucleicos (principalmente RNA se hace referencia en este documento como exoRNA) [2, 3]. Los vehículos eléctricos se liberan de las células y pueden ser cosechadas a partir de fluidos biológicos como la sangre y la orina. Hasta la fecha no ha habido pocos estudios importantes para entender el potencial uso diagnóstico de los vehículos eléctricos.
Cáncer
próstata representa el tipo de cáncer más común en hombres y la segunda causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos [4] . de próstata en suero del antígeno específico (PSA) se utiliza como un biomarcador de cáncer de próstata aunque esta estrategia ha sido criticado debido a su baja sensibilidad y especificidad [5]. Schröder
et al
[6] encontró que 1055 hombres necesitan ser examinados y tendrían que ser tratados con el fin de salvar una vida 37 hombres. Este exceso de diagnóstico y tratamiento excesivo resultados en la disminución de la calidad de vida y el aumento de los costes sanitarios, poniendo de relieve la necesidad urgente de estrategias de diagnóstico más sensibles y específicos [7,8]. En 2009, se informó de que los genes relacionados con la próstata podría ser detectado con éxito en vehículos eléctricos urinarios [9]. Tenemos métodos avanzados recientemente a i) aislar rápidamente los vehículos eléctricos intactos eliminación de la dependencia de la ultracentrifugación y que permitan la adaptación al entorno de laboratorio clínico y ii) obtener una alta integridad exoRNA importante para el análisis de la transcripción fiable [10,11].
En el año 2005 , Tomlins
et al
. [12] informaron de la identificación de la TMPRSS2 específico de la próstata: mutación fusión ERG entre el andrógeno impulsado gen transmembrana serina proteasa 2 (TMPRSS2) y el oncogén Ets gen relacionado (ERG). La actividad de fusión más común (TMPRSS2 exón 1 con ERG exón 4) Se ha informado que tiene una incidencia entre 20% -80% en el cáncer de próstata [13,14]. estado de fusión ha sido examinada a través de diversas técnicas que incluyen fluorescencia
in situ
hibridación (FISH) y RT-PCR [15]. Otro gen examinado comúnmente en el cáncer de próstata es PCA3, originalmente llamado Display diferencial código 3 (DD3), PCA3 es un gen no codificante altamente expresado en el cáncer de próstata [16]. Otros genes que han sido implicados en el cáncer de próstata incluyen la repetición IAP de baculovirus que contiene 5 (BIRC5), también conocido como survivina [17] y ERG [18]. Calicreína 3 (KLK3), también conocido para codificar PSA [19], es un gen relacionado con la próstata cuyos niveles de mRNA han sido previamente utilizado para normalizar la expresión génica en los sedimentos urinarios [20].
Estudios previos examinar gen marcador de próstata expresión en la orina requerido masaje de la próstata para obtener suficientes células para el análisis de ARN. Los detalles de la masaje varían ampliamente entre los estudios, de la aplicación de presión digital leve a los lóbulos laterales a una presión firme sobre toda la glándula [20-26]. Estas manipulaciones pueden dar lugar a molestias para el paciente y la variabilidad inter-proveedor. Además, el masaje de la próstata requisito previo a la recolección de orina exige una interacción directa con un médico a través de una visita al consultorio antes de cada recogida de la muestra, lo que resulta en un aumento de coste. El estudio piloto actual examina el potencial utilidad de diagnóstico de los vehículos eléctricos en una muestra de orina al azar tomada sin masaje de la próstata antes. Utilizamos la detección de la actividad de fusión del gen específico de la próstata (TMPRSS2: ERG) en los vehículos eléctricos urinaria antes de la prostatectomía radical (RP) en comparación con el tejido emparejado de la pieza quirúrgica para examinar la capacidad de los vehículos eléctricos urinarios para reflejar la expresión de tejidos. Examinamos además el uso de vehículos eléctricos como una plataforma para diferenciar de forma no invasiva los hombres con cáncer de próstata demostrado biopsia (Bx Pos) de aquellos con biopsias de próstata negativas (Bx Neg) utilizando genes previamente descritos implicado en el cáncer de próstata.
materiales y Métodos
Muestra adquisición
La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Columbia aprobó este estudio. Se obtuvo el consentimiento por escrito de las muestras recogidas. las muestras de orina al azar recolectados sin masaje de la próstata, se obtuvieron de 207 hombres agrupados en: negativo biopsia (Bx Neg, n = 39), biopsia positiva (BX Pos, n = 47), prostatectomía radical, sin evidencia de enfermedad restante (post -RP, n = 37), la edad machos emparejados (sin antecedentes de cáncer de próstata) (no Bx, n = 44) y controles sanos (hombres & lt; 35 años) (Cont, n = 40). Las muestras de orina se almacenaron a 4 ° C hasta su uso. Es de destacar que el grupo Bx Neg incluyó a pacientes con alto grado de neoplasia intraepitelial prostática (PIN de alto grado) y /o la proliferación acinar pequeña atípica (ASAP) en la biopsia. Se proporcionaron Todas las muestras de orina para el análisis de forma consecutiva y de una manera ciega. La prostatectomía radical tejido se obtuvo de 21 pacientes para los que las muestras de orina recogidas a juego antes de RP estaban disponibles (n = 21). La parafina de tejido fijado con formalina RP fue cortado en 5 micras y montado en portaobjetos de vidrio, según el protocolo Departamento de Patología. Después, el tejido se congeló a -80 ° C hasta su uso.
procesamiento de las muestras de orina fueron procesados
Las muestras de orina que se informó anteriormente [10] utilizando 20 muestras de orina mL. Un filtro de 0,8 micras (Nalgene, NY) se utilizó para eliminar células completas y restos celulares. Microvesículas /exosomas se aislaron utilizando un 100K MWCO filtración concentrador (Millipore, MA) como se describió previamente (10). Después de la adición de la muestra de orina, el concentrador de filtración se centrifugó a 4.500 ×
g
durante 5 minutos y el filtrado se desechó y el material retenido mantiene. El retenido a continuación, se sometió a 10 ml de PBS de lavado y dos lavados con PBS de 15 ml, seguido de centrifugación a 4.500 ×
g
durante 5 minutos después de la adición de cada lavado PBS. se añadieron 4 l de RNasin (Promega, WI) a la EVs aislado antes de la extracción de ARN para eliminar adicionalmente cualquier actividad RNasa. exoRNA se aisló de la fracción EV lavada utilizando el kit RNeasy PLUS (Qiagen, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que utiliza una columna de centrifugación de ADN para la eliminación de ADN genómico (ADNg) de la muestra.
Tissue procesamiento
los pacientes con orinas de prostatectomía radical pre-fueron escogidos al azar para examinar la concordancia entre TMPRSS2: ERG detección en la orina y la detección en el tejido. Se eligió el tejido RP de manera que se podría analizar un análisis exhaustivo de los focos tumorales múltiples y regiones de tejido normal. Formol fija parafina embebido (FFPE) los tejidos de los focos tumorales y las áreas normales de la próstata se seccionaron a 5 micras y se coloca en portaobjetos de vidrio. Un total de 4-6 diapositivas de cada foco tumor o área normal se compilaron y se aislaron los ácidos nucleicos usando el kit de tejido de ADN QIAamp FFPE (Qiagen, CA) según las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones de tejido se rasparon en un tubo Eppendorf en un ambiente libre de RNasa. Para desparafinar secciones de tejido, se añadió 1,5 ml Histología Grado xileno (VWR International, PA) a las secciones, los tubos se sometieron a vórtice brevemente y se centrifugó a 20.000 × g durante dos minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante con una pipeta. Las muestras se agitaron con vórtex de manera similar y se centrifugaron después de la adición de 1,5 ml, a continuación, 1 ml de 100% de etanol (Microscopía Electrónica de Ciencias, PA). Los sedimentos se secaron totalmente mediante la incubación de los tubos no niveladas a 37 ° C durante 20 minutos. 180 l de tampón de ALT se añadió directamente a los gránulos, que fueron totalmente homogeneizados utilizando un dispositivo de tejidos ruptura. se añadieron 20 l de proteinasa K y se mezcló con las muestras, que se incubaron a continuación durante 1 hora a 56 ° C, luego 1 hora a 90 ° C. Los tubos se centrifugaron brevemente y las muestras fueron transferidas a columnas QIAamp MinElute en 2 tubos de recogida ml. Después de un 1 minuto 6.000 × g giro, el flujo a través se desecharon y columnas se transfirieron a tubos nuevos. Las columnas se centrifugaron dos veces a 6.000 xg durante 1 minuto después de la adición de 500 l AW1 Buffer y 500 l AW2 Buffer. Para eliminar todo el etanol, las columnas se centrifugaron a & gt; 20.000 × g durante 3 minutos. Los ácidos nucleicos se eluyen de las columnas en 35 l de tampón de ATE, la concentración de los cuales se midió por Nanodrop Espectrofotómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante en tampón ATE (Qiagen, CA) se utilizó como blanco.
análisis de PCR
ARN de ambas muestras de tejido y orina se sometió a reacción de la transcriptasa inversa (RT) usando el kit de VILO RT (Invitrogen, CA) según las instrucciones del fabricante. Muestra de pre-amplificación se llevó a cabo utilizando el TaqMan
® Kit PreAmp Master Mix (Life Technologies, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA Pre-amplificado se diluyó 1:20 en tampón TE. PCR se realizó con 5 l de cDNA diluido, pre-amplificada para la detección de TMPRSS2: ERG (Life Technologies, NY) (Hs03063375_ft, 106bp), KLK3 (PSA) (Hs03063374_m1, 64bp), ERG (Hs01554635_m1, 104bp), BIRC5 (Hs00153353_m1, 93bp) y PCA3 (Hs01371938_m1, 80bp), TMPRSS2 (Hs00237175_m1) en una máquina de StepOne Plus (Applied Biosystems, CA). Para la expresión de genes exoRNA, los genes de interés se normalizaron a exoRNA KLK3 (C
t gen de interés - C
t KLK3). Para tejidos de expresión génica de los genes de interés se normalizaron a GAPDH (C
t gen de interés - C
t GAPDH).
Análisis de Datos
El programa DataAssist versión 2.0 (Applied Biosystems, CA) fue usado para el análisis de datos para determinar la cuantificación relativa (RQ) de la expresión génica y el significado de la expresión (
P
-valor). Comparación de las características clínicas de los pacientes y que incluyen diagramas de caja y análisis ROC se realizó utilizando STATA IC 12.1 (StataCorp, College Station, TX).
El análisis estadístico
prueba t de Student, de una sola vía Los análisis de ANOVA y la República de China se utilizaron para probar la significación estadística.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Para determinar la exactitud con la que exoRNA aislado de los vehículos eléctricos urinaria refleja ARNm de tejido de la próstata, se analizaron TMPRSS2:. ERG en la expresión RP tejido de 21 pacientes y se comparó con muestras de orina tomadas a juego antes de la RP. se utilizó tejido prostatectomía radical (en contraposición a tejido de biopsia) de manera que un análisis más preciso podría estar hecho de TMPRSS2: ERG expresión en toda la próstata. Un ejemplo representativo de las áreas de la próstata extraídos para su análisis (una "hoja de tejido ') del tejido de la prostatectomía, el estado patológico de cada área (tumor o benigno) y la TMPRSS2: estado ERG de cada área extraído se muestra en la figura 1 que demuestra la extensa cantidad de tejido analizado (véase la figura S1 para el 'mapas tejido' de los 21 pacientes). El aislamiento de ARNm a partir de tejido FFPE se confirmó mediante el análisis de qPCR amplicones con y sin reacción de RT anterior (véase Fig S2). En algunos casos, TMPRSS2: ERG expresión se detectó en las regiones de tejido "benignos". Esto puede ser debido a la presencia de micro focos de tumor en las secciones posteriores del tejido extraído para el análisis de RNA inferior a la analizada originalmente por el patólogo (Ver S3 Fig) y puede explicar por qué algunas regiones benignas 'inesperadamente mostraron TMPRSS2 positivo: expresión ERG . Un paciente fue considerado TMPRSS2: ERG positivo si TMPRSS2: ERG se detectó en ninguna de las secciones del tejido prostatectomía mediante RT-qPCR. Este análisis se comparó con TMPRSS2: ERG expresión en vehículos eléctricos urinarios utilizando la misma reacción RT-qPCR y en la Tabla 1. El análisis de la detección de TMPRSS2: ERG en el tejido frente a la detección de los vehículos eléctricos urinario demostró una correlación muy buena con una sensibilidad de 81% (13/16), una especificidad del 80% (4/5), PPV 93%, NPV 57% y una precisión global del 81% (17/21) (véase la Tabla 2). Para determinar por qué expresión en los vehículos eléctricos orina no siempre reflejan la expresión tisular, se compararon los niveles de expresión de tejidos (cuantificación relativa (RQ)) de TMPRSS2: ERG para aquellos pacientes con niveles detectables TMPRSS2 EV urinaria: expresión ERG frente a aquellos pacientes con niveles indetectables TMPRSS2 EV urinaria : expresión ERG. Aunque limitada en tamaño de la muestra con sólo el 3 TMPRSS2: muestras de tejido positivo ERG siendo TMPRSS2: ERG negativo en exoRNA urinaria, frente a 13 que tuvo correlación exacta con la expresión positiva tanto en el tejido y los vehículos eléctricos urinarios, los datos revelaron que TMPRSS2: expresión ERG en el tejido tumoral fue ~ 98 veces más alta (
P
= 0,009) en pacientes con exoRNA TMPRSS2 urinaria detectable: expresión ERG. En otro caso, TMPRSS2:. ERG se detectó en el exoRNA urinaria, pero no fue detectable en el tejido limitada disponible para el análisis (ver Tabla 1, paciente 10)
de dibujos animados representativo que muestra la selección de benigna (azul) y el cáncer (rosa) regiones de una prostatectomía radical. El tumor y regiones benignas fueron examinados para TMPRSS2: ERG expresión de ARNm (Rojo '+' indica TMPRSS2 positivo: la expresión ERG, Azul '-' indica que no hay TMPRSS2: ERG expresión). T: E-TMPRSS2:. ERG, A-anterior, P-posterior, L-izquierdo, R-derecho
Para examinar más a fondo el uso de vehículos eléctricos para detectar TMPRSS2: expresión ERG, las muestras de orina al azar se obtuvieron de 207 hombres estratificados en 5 grupos: ecografía transrectal (ETR) de próstata biopsia negativa (Bx Neg, n = 39), BTE positivo (Bx Pos, n = 47), prostatectomía radical ( post-PR, n = 37), emparejados por edad los hombres que no se sometieron a biopsia (Bx n, n = 44) y controles (varones menores de 35 años; Cont, n = 40). Características de los pacientes se presentan en la Tabla 3. No hubo diferencias en la edad media, excepto para los machos de control (
P
& lt; 0,05). El PSA sérico sólo se redujo significativamente en el grupo post-PR (
P Hotel & lt; 0,001), en consonancia con la extirpación de la próstata
La incidencia de TMPRSS2: ERG expresión (figura 2a) era. más alta en el grupo Bx Pos con un 66% TMPRSS2 que expresa: ERG consistentes con los resultados anteriores [12-14]. Curiosamente, se encontró que 44% de los pacientes Bx Neg expresar TMPRSS2: ERG. pacientes post-PR no tenían TMPRSS2: ERG expresión consistente con la expresión específico de la próstata del gen, que se pierde después de la retirada de próstata [12]. Sólo el 5% de los varones control (& lt; 35 años de edad) expresado TMPRSS2: ERG en contraste con el 41% en los controles Sin Bx 'de la misma edad' (hombres de edad similar a los grupos Bx POS y Bx Neg pero que no tienen una indicación de biopsia de próstata). Asimismo, examinó el nivel de TMPRSS2: ERG por la expresión de RQ TMPRSS2: ERG en todos los grupos (Figura 2b). TMPRSS2: ERG expresión fue mayor en el grupo Bx Pos (
P = 0,013
) consistente con la presencia confirmada de cáncer (ver la figura S4 para la distribución cuadro de parcela de Delta C
t). También hemos seguido TMPRSS2 urinarias: detección de ERG en pacientes pre y post-RP, cuando esté disponible. Aunque limitada en tamaño de la muestra, los 3 pacientes que fueron exoRNA TMPRSS2: ERG se encontraron positivas antes de la RP no tener exoRNA TMPRSS2: expresión ERG post-PR, lo que sugiere que la TMPRSS2: ERG detectó en estos vehículos eléctricos urinario era en efecto específico de la próstata.
a) Tasa de TMPRSS2: ERG detección de vehículos eléctricos en la orina. Alineado bares-TMPRSS2: ERG, bares-no sólidos positivos TMPRSS2: ERG expresión. Porcentaje se refiere al TMPRSS2: ERG pacientes positivos. b) la cuantificación relativa (RQ) de TMPRSS2: ERG expresión frente a los pacientes Bx Neg. TMPRSS2: ERG expresión se estandarizó a KLK3 consistentes con otros estudios de biomarcadores de próstata [20]. negativo Bx Neg-biopsia (n = 39), Bx Pos-biopsia positiva (n = 47), varones y Lt de control Cont; 35 años de edad (n = 40), n ° Bx-sin biopsia (de edad equivalente de control) (n = 44), la prostatectomía RP-radical (n = 37). Los datos se presentan como RQ ± SEM.
Para determinar si los vehículos eléctricos urinarios podrían utilizarse para examinar otros genes asociados con el cáncer de próstata se determinó la expresión diferencial de los receptores de andrógenos (AR), BIRC5, ERG, de PCA3, TMPRSS2: ERG y TMPRSS2 en Bx Pos Neg frente a los pacientes Bx (figura 3a). El análisis de RQ mostró que todos los genes excepto AR fueron significativamente superiores en pacientes Bx Pos Neg frente a los pacientes Bx (véase la figura S5 para la distribución cuadro de parcela de Delta C
t). Análisis de la correlación entre la ERG y TMPRSS2: expresión ERG (Fig 3b) reveló que había una fuerte tendencia entre los dos genes (R
2 = 0,826), en consonancia con la célula urinaria y los datos de tejido que sugieren que la fusión más común (TMPRSS2 (exón 1) con ERG (exón 4)) puede dar lugar a una mayor expresión ERG [12,18]. Esta tendencia no fue evidente cuando TMPRSS2: ERG expresión se correlaciona con la expresión de PCA3 (R
2 = 0,110) (figura 3c). ROC análisis también se llevaron a cabo para determinar la capacidad de estos genes para discriminar el estado de biopsia (Fig 4). Los resultados confirmaron que BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG y TMPRSS2 fueron capaces de diferenciar Bx Pos de pacientes Bx Neg (Tabla 4)
a) cuantificación relativa (RQ) de la expresión génica para determinar si cualquier genes. son significativamente más altos en pacientes expresado Bx Pos. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), el PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) y TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45). Se encontró que todos los genes excepto AR tener expresión significativamente mayor en comparación con los pacientes Bx Neg. bares-Bx sólidos Neg, bares-BX forrado Pos. Los datos presentados como RQ ± SEM. b) Correlación entre la expresión de TMPRSS2: ERG y se determinó utilizando ERG delta Ct contra KLK3 en Bx Pos (negro) y Bx Neg (gris) de los pacientes. c) Correlación entre la expresión de TMPRSS2: ERG y PCA3 se determinó a través del delta C
t contra KLK3 en Bx Pos (negro) y Bx Neg (gris) de los pacientes. Delta C
t = C
t gen de interés - C
t KLK3
curvas ROC para AR individual, BIRC5, ERG, de PCA3, TMPRSS2:. ERG y TMPRSS2. T: E-TMPRSS2: ERG. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), el PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) y TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45) guía empresas
Discusión
el análisis de ARN en la orina tiene implicaciones importantes para el desarrollo de las pruebas no invasivas que examinan la expresión diferencial de genes y la detección de mutaciones. A pesar del enorme potencial que el análisis no invasivo de la enfermedad subyacente puede tener en la orientación de un médico, una limitación clave para el uso de biofluidos es si reflejan con precisión los cambios de expresión génica en el tejido de los padres. Nuestro análisis ha utilizado urinaria EV exoRNA para determinar si se trata de: 1) reflectante de la expresión génica de tejidos, y 2) capaz de diferenciar BxPos de pacientes BxNeg no invasiva. Debido a la ~ inherente tasa de falsos negativos del 25% de la biopsia de próstata BTEP en la detección de cáncer y la cantidad limitada de tejido encuestados durante la biopsia, se optó por utilizar los pacientes programados para someterse a RP con el fin de comparar la concordancia entre TMPRSS2: detección de ERG ARNm en el tejido en comparación con los vehículos eléctricos en la orina. TMPRSS: detección ERG fue elegido específicamente para determinar esta correlación debido a su especificidad conocida para el tejido de próstata. análisis urinario exoRNA fue capaz de detectar de manera no invasiva el tejido expresión de TMPRSS2: ERG ARNm con muy buena precisión y una concordancia general de 80%. En algunos casos, TMPRSS2: ERG expresión se detectó en las regiones de tejido "benignos". Esto puede ser debido a la presencia de micro focos de tumor en las secciones posteriores del tejido extraído para el análisis de RNA inferior a la analizada originalmente por el patólogo (Ver Fig S3). Este es un problema inherente a este tipo de análisis de tejidos RP pero puede explicar por qué algunas regiones "benignos" inesperadamente mostraron TMPRSS2 positivo:. ERG expresión
Tres de los 21 pacientes tenían detectable TMPRSS2: ERG expresión en el tejido, pero indetectable TMPRSS2: ERG en los vehículos eléctricos urinario. Tras una posterior análisis de estos datos se puede sugerir que la expresión de bajo nivel en el tejido puede no ser detectada en los vehículos eléctricos y puede ser visto como una limitación potencial. Sin embargo, esto debe ser considerado con precaución ya que sólo había tres de tales muestras disponibles para el análisis y tendría que llevarse a cabo para apoyar esta conclusión un estudio más amplio
En un caso, TMPRSS2:. ERG se detectó en la orina vehículos eléctricos, pero estuvo ausente en el tejido disponible para el análisis. Desde secciones de próstata todo el montaje no estaban disponibles para el análisis total de la glándula, es posible que el paciente puede haber tenido un TMPRSS2: ERG enfoque positivo en una región de tejido disponible para el análisis. Esto pone de relieve la ventaja potencial de los vehículos eléctricos urinario, ya que pueden reflejar una mayor proporción del volumen de próstata que lo que es obtenible a través de otros métodos de muestreo como la biopsia.
La capacidad de utilizar muestras de orina aleatorias (recogidos sin masaje de la próstata) nos permitió analizar una amplia gama de temas, entre ellos, los varones jóvenes sanos (& lt; 35 años) lo que indica, como se había anticipado, que muy pocos tenían detectable TMPRSS2: ERG niveles (5% (2/40)). Esto fue en contraste a los varones de edad avanzada en el Bx Pos (66%), Bx Neg (44%) y No Bx (41%) los grupos de pacientes. Esto sugiere que la probabilidad de una TMPRSS2: ERG evento de fusión que ocurre puede aumentar con el tiempo (es decir, con la edad), de acuerdo con informes anteriores que la incidencia de cáncer de próstata también aumenta con la edad [27]. Nuestra tasa de detección de TMPRSS2: ERG través exoRNA en pacientes Bx Pos, estaba en la parte superior de la gama de los reportados previamente para TMPRSS2: ERG detección mediante el análisis de células urinaria en pacientes positivos de cáncer de próstata que oscilaban entre 37-69% (22/32 (69%) [28], 10/15 (67%) [26], 8/19 (42%) [21], 56/138 (41%) [22], 29/78 (37%) [25 ], 9/13 (69%) [29]) con tasas de detección de tan solo 10/42 (24%) cuando no hay masaje de la próstata se realizó antes de la recogida de la orina [29] y 46/196 (24%) cuando un TMPRSS2 : ERG detección de corte de & gt; 10 copias se aplicó [30]. En los pacientes sin cáncer de próstata (determinar a través de biopsia negativa), la detección de TMPRSS2: ERG mediante el análisis de células urinaria era menor que nuestra tasa de detección a través de análisis EV con un rango de 7-21% (2/30 (7%) [25], 4/30 (13%) [26], 4/24 (17%) [28], 20/96 (21%) [22] y tan bajo como el 6% sin masaje de próstata previa, 15/247 (6%) [29] Si bien hubo un gran número de pacientes Bx Neg y n Bx con un TMPRSS2 detectable:. evento de fusión ERG en nuestro estudio actual, TMPRSS2: nivel de expresión ERG (analizada a través de RQ) fue mayor en el grupo Bx Pos coherente con el . la presencia confirmada del cáncer de expresión de bajo nivel en los grupos Bx Neg y Bx No se puede representar transcritos de ARN espurios en lugar de la contaminación ya que había una ausencia total de TMPRSS2: ERG exoRNA (0% (0/40)) en el post-40 pacientes de prostatectomía radical probados. el uso de una expresión de corte tal como la empleada por Leyten et al, [30] potencialmente podría permitir la diferenciación entre la expresión de genes no esenciales de bajo nivel (tal como la observada en Bx Neg y emparejados por edad Ningún paciente Bx) y la expresión génica estable observaron en pacientes Bx Pos. Uno sólo puede especular acerca de por qué el análisis detecta EV TMPRSS2 más positiva: ERG expresar los pacientes que el análisis de las células urinarias en particular en los grupos No Bx y Bx Neg. Una sugerencia puede ser debido a que los vehículos eléctricos representan un mayor estudio de la próstata, ya que están constitutivamente liberados por las células potencialmente todos. Esto está en contraste con el análisis de las células urinarios derivados de la próstata que son entregados a un ritmo mucho más lento. Así, el análisis de los vehículos eléctricos en Bx Neg (Bx) y n grupos puede dar una mayor oportunidad para detectar espurios TMPRSS2: ERG lee en comparación con el análisis de células de próstata urinaria
También se examinaron los niveles de expresión del gen ERG para determinar si. una correlación entre la expresión de exoRNA TMPRSS2: ERG y ERG era evidente. resultados EV urinarios apoyaron firmemente informes anteriores de que el aumento de expresión ERG puede estar asociada con la TMPRSS2: ERG evento de fusión [12,18,31]. Se encontró Análisis de la expresión ERG parece funcionar mejor que el análisis de TMPRSS2: ERG expresión en la diferenciación de Bx Pos de pacientes Bx Neg. Esto puede ser porque TMPRSS2: ERG detectado por nuestro ensayo puede dar cuenta de sólo una fracción de eventos de fusión relacionados ERG [18]. Por lo tanto, nuestro análisis de la expresión ERG por sí solo puede potencialmente recoger eventos de fusión adicionales más allá de ERG detectado por nuestra TMPRSS2: ERG ensayo haciendo ERG solo un marcador más sensible en nuestro estudio
Para examinar el uso de los vehículos eléctricos como una plataforma. de manera no invasiva diferenciar los pacientes Bx Pos Neg Bx y sin masaje de la próstata, se analizó la capacidad de otros genes previamente implicados en el cáncer de próstata para diferenciar a los pacientes Bx Pos Neg Bx y que utilizan la plataforma EV urinaria. El análisis demostró que la cuantificación relativa exoRNA para BIRC5, ERG, de PCA3 y TMPRSS2: ERG estandarizado para KLK3, diferenciada Bx Pos de pacientes Bx Neg. AR expresión era incapaz de diferenciar estos grupos. Esta tendencia se reflejó en el análisis ROC de estos genes. Es difícil postular por qué los cambios documentados en AR expresión en el cáncer no se reflejó en nuestro estudio exoRNA excepto que tal vez la expresión AR no se rige en el ARNm, sino más bien a nivel de proteínas.
Este estudio piloto demuestra la potencial utilidad de exoRNA para examinar la expresión de genes relacionados con la próstata aislada de una sola muestra de orina al azar. En concreto, el análisis EV tiene una precisión ~ 80% para la detección de TMPRSS2: ERG mutación, suponiendo que no hay falsos negativos en las muestras de prostatectomía radical, y está influenciada por el nivel de la expresión génica en el tejido. La capacidad de segregar Bx Pos de pacientes Bx Neg usando una muestra de orina no invasivo sin el uso de un masaje de próstata también se demostró, y apoya el desarrollo futuro de una prueba de diagnóstico basada urinaria potencial EV para el cáncer de próstata. cohortes más grandes que ahora se necesitan para confirmar estos estudios. Por último, debido a la liberación de los vehículos eléctricos en todas partes de las células, es posible que los vehículos eléctricos urinarios pueden llegar a ser una novela, no invasivo plataforma para examinar otros órganos del tracto genitourinario, incluyendo el riñón y la vejiga.
Información de Apoyo
S1 Fig. De dibujos animados de las secciones de tejido prostático tomadas para el análisis comparativo de TMPRSS2:. ERG Expresión génica en el tejido Versus urinaria exoRNA
Dibujos que muestran benigna (azul) y las regiones de cáncer (rosa) de una prostatectomía radical que fueron seleccionados para la extracción de RNA y análisis de la expresión génica . Tumor y regiones benignas positivos para TMPRSS2: ERG expresión se indican con una Red '+'. TMPRSS2 negativo: la expresión ERG se indica con un azul '-'. Púrpura '+' se utiliza para indicar TMPRSS2 positivo: la expresión ERG en una muestra conjunta de los tejidos. T: E-TMPRSS2: ERG, A-anterior, P-posterior, L-izquierdo, R-derecha. "Nivel" indica el área de la próstata encuestados para el análisis de la expresión génica (uretra para vesículas seminales)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154507.s001 gratis (TIFF)
S2 Fig. La detección de ARNm transcripciones en FFPE tejido.
Análisis Agilent Bioanalyzer chip de ADN de los amplicones generados a través de PCR en control sin molde (NTC) y muestras con reacción de la transcriptasa inversa (RT) y sin la transcriptasa inversa (No RT) de reacción. muestras del "No RT 'no ha podido generar amplicones consistentes con los cebadores específicos de ARN y la sonda para cada gen. Las muestras se someten a reacción de RT generan amplicones de tamaño similar a la ABI tamaño de amplificación. NTC no pudo generar amplicones que sugiere que no contaminación.