Extracto
motilidad celular es la base para la invasión de las células del cáncer y la metástasis. En el caso del cáncer de mama, el tipo más común de cáncer entre las mujeres, la metástasis representa la etapa más devastadora de la enfermedad. El papel central de la motilidad celular en el desarrollo del cáncer hace hincapié en la importancia de comprender los mecanismos específicos implicados en este proceso. En este contexto, el desarrollo de tumores y metástasis serían la consecuencia de una pérdida o defecto de los mecanismos que controlan la remodelación del citoesqueleto. Profilina que pertenece a una familia de pequeñas proteínas de unión a actina que se cree para ayudar en el alargamiento de filamentos de actina en el borde de ataque de las células que migran. Tradicionalmente, Profilin I ha sido considerado como un elemento esencial para el control de la polimerización de actina y la migración celular. La expresión de Profilin que es el regulado en el pecho y varias otras células cancerosas. En las células MDA-MB-231, una línea celular de cáncer de mama, aún más la inhibición de la expresión Profilin que promueve la hipermotilidad y diseminación metastásica, lo que contrasta con la función propuesta de Profilin en la mejora de la polimerización. En este informe, hemos aprovechado la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) de GFP-actina para cuantificar y comparar la dinámica de actina a nivel del borde de ataque, tanto en modelos de células no cancerosas, el cáncer y. Nuestros resultados sugieren que: (i) un alto nivel de dinámica de actina (es decir, una gran fracción móvil de los filamentos de actina y una facturación rápida) es una característica común de algunas células cancerosas; (Ii) la polimerización de actina muestra un alto grado de independencia de la presencia de factores de crecimiento extracelulares; y (iii) nuestros resultados también corroboran el papel de Profilin I en la regulación de la polimerización de actina, como el aumento de los niveles intracelulares de Profilin I disminuyó la relación de fracción móvil de los filamentos de actina y frenado su velocidad de polimerización; Por otra parte, el aumento de los niveles de Profilin también condujeron a una reducción de la velocidad de células individuales y la direccionalidad
Visto:. Lorente G, E Syriani, Morales M (2014) Los filamentos de actina en la vanguardia de las células del cáncer se caracterizan por una alta fracción móvil y el Reglamento Facturación por Profilin I. PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10.1371 /journal.pone.0085817
Editor: Yulia Komarova, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2013; Aceptado: 3 de diciembre de 2013; Publicado: 17 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Lorente et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Ministerio español de Investigación (SAF2010-16024; BFU 2012 a 17.537, una vez 2010 y 2011) y los fondos de la Fundación Rioja. GL fue becario de la Universidad de Barcelona. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
motilidad celular es un proceso complejo que se produce en todos los tipos de células [1]. Migración sobre una superficie plana implica la protrusión de un manto membrana delgada, la lamela, lleno de una intrincada actina ramificado red. La fuerza para el saliente de la membrana y la extensión es proporcionado por la polimerización de actina controlado y restringido en el borde más cercano de la membrana, el llamado borde de ataque. Durante el alargamiento, los filamentos de actina están polarizados con su extremo de púas (o extremo más) que apunta hacia la membrana [2], que es empujado por los filamentos, obligando a la extensión de la lámina. La extensión de lámina, por lo tanto, es lo que determina la dirección y con el movimiento de la célula [3]. Cerrar la regulación de la migración celular es esencial para el desarrollo, la curación de heridas y la respuesta inmune, mientras que la motilidad celular aberrante y no controlada es una característica recurrente en varios tipos de células cancerosas.
Un número de estudios indican que Profilin I (PfnI) , una proteína esencial de unión a actina, puede jugar un importante papel regulador en el proceso de la motilidad celular. Por lo tanto,
Dictyostelium amebas
mutantes para PfnI la motilidad de exposiciones y citocinesis defectos [4], al igual que "Chickadee", el mutante nulo para el homólogo de PfnI en
Drosophila
[5]. Del mismo modo, silenciando PfnI en las células endoteliales vasculares humanas induce la inhibición de la motilidad y defectos en la protrusión de la membrana [6]. Por otra parte, PfnI nocaut se ha demostrado que el resultado en la muerte celular embrionaria temprana en ratones [7].
De los miembros de la familia Profilin (PfnI a PFN IV), PfnI es el más ampliamente expresada. Se identificó originalmente como una proteína secuestrante G-actina [8], y desde entonces, se ha asignado varias otras funciones, incluyendo el tráfico nuclear-citoplasma de actina mediante la unión a exportin 6 [9], mRNA de empalme [10], así como la endocitosis vesicular mediante la interacción con clatrina y valosin que contienen proteínas [11]. Hoy en día, se acepta comúnmente que su función principal es promover la polimerización de actina, catalizando el intercambio de ADP por ATP en el monómero G-actina [12]. Además, la estructura de PfnI contiene un dominio de unión poliprolina (PLP) [13], [14] y dos sitios de unión phosphoinositide [15] - [17]. En virtud de la primera, PfnI interactúa con una profusión de proteínas ricas en prolina. Entre otros, se une directamente a Ena /VASP [18], N-WASP [19], WAVE [20] y la familia de nucleación actina de forminas [21]. Todas estas proteínas reclutan PfnI a las zonas de remodelación dinámica de la actina, como el borde delantero de la lamellipodia. La localización intracelular de PfnI confirma su asociación con las áreas de la polimerización de actina intensa, y por lo tanto PfnI se encuentra en microfilamentos PTK2 de fibroblastos marsupiales [22], sanguijuela neuronales conos de crecimiento [23], laminillas bovina malla trabecular [24], las áreas de rata que sobresale fibroblastos [25], y cerca del borde de avance de las células endoteliales [26].
una característica fundamental de invasión de células tumorales y la metástasis es un aumento de la capacidad de la motilidad y la migración de las células. Curiosamente, los niveles de expresión de PfnI están regulados hacia abajo en varios de mama invasivo, de páncreas y de tipos de células cancerosas hepáticas [27] - [31]. Una mayor reducción de los niveles de PfnI silenciando sus resultados de la expresión en aún mayor motilidad [29], [32] y la progresión del tumor [33]. Lo contrario también es cierto: un aumento en los niveles de PfnI reduce la invasividad celular y la motilidad, seguido de una regulación de la tensión y las fibras de adhesión focal [27], [29]. Por otra parte, PfnI sobreexpresión suprime tanto tumorigenicidad ectópico y ortotópico y micro-metástasis [32]. Para la actividad de supresión tumoral que se produzca a través de este mecanismo, tanto en los sitios de unión a actina y phosphoinositide en PfnI deben ser funcionales [30], [32], [34]. Por otra parte, la sobreexpresión PfnI ha informado hasta de regular la expresión de PTEN, por lo tanto, la supresión de la actividad de Akt indirectamente mediante el control de la producción fosfoinosítido [35].
La unión de PfnI fosfoinosítido es más importante de lo previsto anteriormente. La familia Ena /VASP de proteínas destapa los extremos de púas libres de actina, lo que permite su elongación progresiva [36]. Lamellipodin (LPD) se une Ena /VASP a través de un dominio EVH1, e interactuar específicamente con PI (3,4) P
2. De esta manera, el objetivo de la membrana de Lpd es capaz de reclutar Ena /VASP a la membrana. Una serie de hallazgos recientes sugieren que PfnI restringe el volumen disponible de PI (3,4) P
2. De esta manera, sería PfnI regular negativamente los niveles de fosfoinosítidos en la membrana, e indirectamente limitar Lpd-Ena /VASP orientación a la membrana [37]. En las células MDA-MB-231, PfnI agotamiento regula la acumulación Lpd, aumentando indirectamente la concentración Ena /VASP en el borde delantero, y promover en consecuencia polimerización de la actina y la hipermotilidad reportado después PfnI agotamiento [38]. Sin embargo, las consecuencias subyacentes de estas acciones represivas PfnI sobre el volumen de actina aún no se han dilucidado. La evidencia experimental indica que un dominio funcional de unión a actina de PfnI es crucial para la reducción de la motilidad de células de cáncer y el fenotipo del tumor [29], [30]. Dada la gran cantidad de evidencia experimental que apoya la importancia de PfnI en la regulación de la polimerización de actina y la migración celular, es desconcertante lo bajo que los niveles de expresión de PfnI están asociados con la motilidad celular mejorada, y cómo actina treadmilling se puede regular.
este informe, la cifra de negocios de la actina lamellipodial se examinó el uso de recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) [39]. Nuestros resultados indican que el citoesqueleto en el borde de ataque de las células cancerosas es mucho más dinámico que el de células no tumorales. Por otra parte, el aumento de los niveles de PfnI en células de cáncer conduce a la reducción treadmilling actina y la alteración de la motilidad celular. Por último, también hemos encontrado evidencia que sugiere que treadmilling actina en las células cancerosas es insensible a la regulación por factores de crecimiento extracelular.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células
MDA-MB-231 líneas de células de tumor de mama humanos se cultivaron en DMEM F12-Ham medio y 10% de FBS (Sigma). La línea celular MCF10A humano epiteliales mamarias se cultivó en el siguiente medio de cultivo: HEPES 15 mM, suero de caballo al 5%, EGF 20 ng /ml, hidrocortisona 0,5 mg /ml, la toxina del cólera 100 ng /ml, insulina humana 10 mg /ml, 50 mg /ml de penicilina y 50 U /ml de estreptomicina en DMEM F12 HAM (todo suministrado por Sigma). La línea A549 de pulmón humano de células tumorales, fibroblastos embrionarios de ratón MEF y el cuello uterino humano línea de células tumorales HeLa fueron cultivadas en DMEM, suplementado con 50 mg /ml de penicilina, 50 U /ml de estreptomicina y 10% de FBS (Sigma Aldrich). células MDA-MB-231 se adquirieron de ATTC (EE.UU.; Ref HTB-26.). MCF10A células, el paso 8, fueron un generoso regalo de LP Saucedo (CNIO, Madrid, España). A549 y células HeLa, paso 10, eran una forma generosa donación H. Aguilar (ICO, Barcelona, España). células MEF, paso 6, eran generoso regalo de A. Angulo (IDIBAPS, Barcelona).
La inmunocitoquímica y análisis de imágenes
En pocas palabras, para inmuno análisis, los cultivos de células fueron lavadas en PBS y se fijaron durante 15 min en 4% de paraformaldehído /PBS. a continuación, los cubreobjetos se lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante 30 min en solución de bloqueo (2% de suero de cabra, 2% de albúmina de suero, 0,1% de Triton X-100 en PBS). Los anticuerpos se diluyeron a la concentración apropiada en solución de bloqueo. Los cubreobjetos se incubaron durante 60 min en la solución de anticuerpo. Las muestras se lavaron posteriormente tres veces y se incubaron durante 30 min con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia apropiados. Por último, los cubreobjetos se lavaron cinco veces y se montaron con Mowiol. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un microscopio invertido (Olympus IX70), utilizando un monocromador TILL como fuente de luz. Fotos fueron tomadas con una cámara CCD adjunta enfriada (Orca II-ER, Hamamatsu)
Se utilizaron los siguientes anticuerpos:. Anticuerpo monoclonal anti-vinculina (. Chemicon, ref MAB3574) y anti-Profilin policlonales y anticuerpos monoclonales (Cell Signaling, ref. 3237 y el sistema de Synaptic, ref. 308 011). Los anticuerpos secundarios, Oregon verde faloidina y faloidina-Alexa Fluor ® 594 se compraron de Invitrogen. J software de análisis de imagen (Institutos Nacionales de Salud) se utilizó para cuantificar la adhesión focal y la difusión.
mediciones de área de la célula y adherencias focales cuantificación
En resumen, hasta 10000 células fueron sembradas en 12 mm cubreobjetos en 24 pozos de placas. Después de que el tratamiento correspondiente, las células se fijaron en 4% PFA y se tiñeron con faloidina Oregon-verde o faloidina-Alexa Fluor® 594. A pesar de la falta de fibras de estrés, faloidina tinción activar la medición de toda la superficie de la célula. área de la célula se cuantificó por análisis de umbral digital utilizando software Image J.
proteína recombinante
En algunos experimentos, los niveles intracelulares de Profilin fueron modificados utilizando una versión permeable membrana de PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-Profilin (21 kDa) se generó mediante la fusión de un dominio de transducción, PTD4 [41], a Profilin. La proteína recombinante se expresó en
E. Coli
y purificado como se describe anteriormente [40]. En pocas palabras, competente
E. Coli BL21
-pLys transformadas con el vector pRSETA-PTD4-Pfn I fueron inducidos por la adición de IPTG 1 mM (Sigma) a 37 ° C durante 6 h. Los sedimentos bacterianos se lisaron por protocolo de congelación y descongelación en N líquido
2, seguido por sonicación en hielo en presencia de ADNasa y un cóctel inhibidor de la proteína (Sigma). Los lisados celulares se resolvieron mediante centrifugación, y la proteína soluble se aisló mediante el empleo de Ni-NTA columnas de relleno con resina (Quiagen). lavado de la proteína y la elución se llevó a cabo con altas concentraciones de imidazol. El cambio de tampón y la concentración de la proteína recombinante se llevaron a cabo por centrifugación en Amicon Ultra-15 10000 MWCO filtros centrífugos (Millipore), en sustitución de los medios de comunicación de la elución con PBS. Las proteínas se congelaron en N líquido
2 y se almacenaron a -80 ° C en el 10-15% de glicerol-PBS. Las bacterias y las proteínas se manejan de acuerdo con las Directrices de seguridad para el personal de laboratorio de trabajo con Trans-Activación de transducción (TAT) Proteína de Transducción Dominios.
La transfección
La transfección se realizó usando el kit Efectene reactivo de transfección de Qiagen , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron varios vectores de expresión: CMV-GFP, CMV-GFP-actina y CMV-MembraneCherry amablemente proporcionados por el Dr. F Tebar (Universidad de Barcelona, España), y CMV-GFP-PfnI amablemente proporcionados por el Dr. Hitomi Mimuro (Universidad de Tokio, Japón).
Las líneas celulares estables
Las líneas celulares estables fueron generados a partir línea celular de cáncer MDA-MB-231 transfectadas con plásmidos que expresan GFP-actina, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI y GFP bajo un control del promotor CMV (todo el trabajo se realizó con pases celulares 6-8). Las transfecciones se realizaron con Efectene reactivo de transfección (Qiagen), como se describe en el protocolo. Se seleccionaron las células transfectadas con tres semanas de incubación en gentamicina 1 mg /ml (Sigma). FACS se utiliza para separar de alta y baja células que expresan GFP-actina. La solución de clasificación de células tampón usado consistió en EDTA 5 mM, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% de FBS (inactivado por calor) y PBS sin Ca
2 + /Mg
2 +. Los niveles relativos de expresión de proteínas recombinantes se analizaron por Western blot.
motilidad celular ensayo
MDA-MB-231 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (Nunc) a 40% de confluencia y se marcaron con DRAQ5, un tinte de ADN fluorescente rojo lejano penetra en las células, durante 5 minutos (Cell Signaling Technology). Las placas de cultivo fueron montadas en la etapa de un Leica DMITCS SL microscopio láser confocal de barrido espectral (Leica Microsystems Heidelberg, GmbH) unida a un microscopio invertido Leica DMIRE2 equipado con un sistema de incubación con temperatura y CO
2 de control. Todos los experimentos se realizaron a 35 ° C y 5% de CO
2. Para la visualización de los núcleos teñidos DRAQ5, las imágenes fueron adquiridas usando una lente de 40 × objetivo (NA 1,32) y excitado con una línea láser de 633 nm. El pinhole confocal se fijó en 4,94 unidades de Airy para minimizar la pérdida de fluorescencia. Fotos fueron tomadas cada 5 min durante 8 h. Image software de análisis de J (NIH) se utilizó para la velocidad y la cuantificación direccionalidad. direccionalidad de datos fue presentado como la distancia lineal (Fin) dividida por la longitud total distancia durante 8 h, según lo descrito por Pankov y col., 2005 [42].
recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP)
FRAP experimentos se realizaron con las siguientes exploraciones protocol:10 individuales (pre-blanqueo) fueron adquiridos a intervalos de 300 ms, seguido de 20 exploraciones de blanqueo en plena potencia del láser utilizando un área cuadrada de 24 m
2. Durante el período posterior a la decoloración, 30-60 exploraciones fueron adquiridas a intervalos de 300 ms, seguido de 100 imágenes tomadas a intervalos de 5 s, este período de tiempo era necesario para permitir la fluorescencia alcance el equilibrio. Con el fin de resolver la recuperación rápida inicial, algunos experimentos se realizaron con el Leica vuela adquisición modo; blanqueo se realizó durante la exploración hacia adelante X marcha utilizando la potencia del láser 100%, y durante la exploración hacia atrás, se leyó la fluorescencia con la intensidad del láser se establece en los valores de imagen (185 ms imágenes de intervalo), mientras que las imágenes post-blanqueo (30-60 s) se adquirieron en el mismo intervalo de tiempo. Para evitar photobleaching significativa, la intensidad de excitación se atenúa a ~ 5% de la potencia del láser durante la adquisición de imagen. recuperación de fluorescencia se cuantificó utilizando Procesamiento de Imágenes Leica Confocal Software. La fluorescencia de fondo se midió en un campo aleatorio fuera de la célula y se resta de todas las mediciones. La señal de fluorescencia se mide en la región de interés (ROI), se corrigió para la adquisición de photobleaching y las fluctuaciones de la fluorescencia total después de una doble método de normalización, determinada como sigue: Irel = It /I0 * T0 /Tt, donde es la intensidad media en retorno de la inversión en el tiempo t; I0 es la intensidad media del retorno de la inversión durante el período de pre-blanqueo; T0 es la intensidad durante la pre-blanqueo de la zona para no blanqueada (normalmente, una célula vecina o la región nuclear); y Tt es la intensidad en el tiempo t de esta zona. La introducción del factor de corrección (T0 /Tt) es responsable de posibles pequeñas fluctuaciones en la intensidad total de fluorescencia causada por la propia lejía, y se obtiene una estimación más precisa de la fluorescencia medida en el retorno de la inversión [43], [44].
la recuperación neta de fluorescencia (fracción móvil; Mf) medido en la región de interés se determinó como: Mf = Fend-Fpost /Fpre-Fpost, donde se Fend significa ROI intensidad en el estado estacionario; Fpost representa la intensidad de retorno de la inversión después de photobleaching; y Fpre es la intensidad media de retorno de la inversión de pre-blanqueo. La constante de tiempo de recuperación (τ) se obtuvo mediante el ajuste usando Prism Software (GraphPad) curva, asumiendo un modelo de un solo exponencial (abajo, a continuación, se eleva a la parte superior).
cantidades intracelulares de Profilin recombinante
Cálculo de las cantidades intracelulares de PTD4-PfnI hecho por densitometría Western blot. Brevemente, las células crecen en 25 cm
2 matraces se lavaron cinco veces, con tripsina, y se lavaron a fondo por centrifugación para reducir la concentración de proteína extracelular. Los lisados celulares se corrieron en un gel de SDS-poliacrilamida. cantidades diluidas de recombinante purificada PTD4-PfnI, fueron cargados en los mismos pozos. Ambas proteínas endógenas, Profilin y PTD4-PfnI se distinguen fácilmente por sus pesos moleculares y se sondearon con un anticuerpo monoclonal contra Profilin I.
Estadísticas
Todos los datos se representan como medias ± SEM y fueron analizaron usando el software Prism (versión 4.0 y 6.0, GraphPad). Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student cuando sea apropiado. Los niveles de significación se observaron los siguientes:. * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001
Resultados
dinámica de la actina de las células cancerosas se caracterizan por un alto móvil fracción y la recuperación corto tiempo
con el fin de estudiar la dinámica del citoesqueleto de actina en la creciente borde de ataque de las células tumorales, hemos optado por la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231. Esta línea celular lleva el
KRAS
G13D y los
BRAF mutaciones
G464V [45] y es particularmente adecuada para los estudios pre-clínicos, ya que es muy agresivo, tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
[46]. MDA-MB-231 células en cultivo exhiben una extensión de láminas continua y de alta movilidad, que presenta numerosos volantes a lo largo de la membrana, lo que hace que este tipo de células en un candidato excelente para estudiar la rotación de actina lamellipodial usando FRAP. Con el fin de facilitar los experimentos de imagen, que había generado previamente una línea celular MDA-MB-231 transfectadas estable que expresa la construcción GFP-actina. El nivel relativo de expresión de GFP-actina fue examinado por Western-blot y se compara con GFP expresada línea celular como un control, en promedio, la expresión de la proteína de fluorescencia resultó en 5,2% de la Profilin total (datos no mostrados).
El borde de ataque característica de las células MDA-MB-231 es una amplia estructura de 2 micras enriquecido en GFP-actina y fácilmente identificado por faloidina-Alexa 594 tinción (Figura 1A). se photobleached Un área rectangular lo suficientemente grande como para cubrir todo el borde de ataque (4 m de ancho y 6 m de largo) [39] (Figura 1B). Como se muestra en la Figura 1C, MDA-MB-231 células mostraron una recuperación de la fluorescencia cerca de un 70% después de 15 s. La cinética de recuperación fue descrito por una curva exponencial de dos componentes que evidencia un componente rápido inicial seguido de un segundo componente más lento. El componente inicial tuvo un tiempo de recuperación de cerca de 500 ms, similar al valor obtenido cuando la recuperación se examinó en las células transfectadas con GFP monoméricos (tau 100-200 ms; Figura S1). Esto es más probable debido a la rápida difusión de monómeros GFP-actina. El componente inicial rápida sólo se detectó cuando se empleó un protocolo rápido de la adquisición, y por lo tanto fue descuidado en la mayoría de los experimentos. El segundo componente más lento fue impulsado por la polimerización de actina [47], [48], lo cual fue confirmado por la adición de 90 nM de citocalasina D (un bloqueador de púas de extremo reversible) al medio de cultivo de cinco minutos antes del experimento FRAP. En presencia de citocalasina D, la fluorescencia de GFP-actina no logró recuperarse (Figura 1C), lo que confirma que la polimerización de actina impulsa la recuperación de la fluorescencia. En promedio, la fracción móvil mide 30 segundos después de que se estima el tiempo de blanqueo máximo para ser 71,5 ± 4%; este segundo componente fue equipado por una curva de un solo exponencial con un valor tau media de 4 ± 0,3 segundos (rojo línea de puntos en la Figura 1C).
) MDA-MB-231 células transfectadas con GFP A-actina, doble teñidas con faloidina-Alexa 594 (a). fluorescencia de la actina se acumula principalmente en la zona del borde de ataque. La barra de escala 5 micras. Nótese que la MDA-MB-231 células tienen una evidente falta de fibras de estrés de actina. Parte específica del borde de ataque, que muestra la acumulación de GFP-actina (b) y los filamentos de actina (c): rigth. Barra de escala 2 micras. B) imagen representativa de los marcos FRAP experimentos secuenciales. Antes de FRAP (pre-blanqueo), después de la exposición de alta intensidad de láser (blanqueo), durante la fase inicial de recuperación (5 s) y al final de la parte estable de la curva (30 s). La zona de borde de ataque blanqueada se indica por la caja blanca (4 × 6 m). C) Ejemplo de un experimento FRAP; fluorescencia se recupera a un valor medio de 71,5 ± 4% después de un transcurso de tiempo monoexponencial (FIT representado por una línea roja punteada). La incubación con citocalasina D (90 nM) inhibe la recuperación de fluorescencia (CytD). Gráfico D) Resumen de las fracciones medias móviles de las células MDA-MB-231. Las células transfectadas estables (s, n = 44), los altos expresadores GFP-actina (alta, n = 10), expresadores bajas GFP-actina (bajo, n = 10) y transitoriamente células transfectadas (231T, n = 6). Los valores medios de la fracción móvil no muestran diferencias estadísticas en cualquier condición experimental en comparación con la línea celular estable transfectada (prueba t de Student).
A continuación pregunta si los valores de fracción móviles observadas dependían de los niveles de expresión de GFP-actina. Con este fin, se analizaron los niveles de recuperación para las tres condiciones diferentes: células con niveles de expresión de GFP-actina de alta o baja (poblaciones ordenados por citometría de flujo de la línea de células GFP-actina estable generada) y después de una transfección transitoria durante 48 horas. Los resultados, resumidos en la Figura 1D, indicaron que la fracción móvil media fue similar para todas las tres condiciones, apoyando la hipótesis de que la tasa de recuperación de la actina no era dependiente de la concentración intracelular de GFP-actina.
Para explorar si este rango de la recuperación de la actina es específico para las células MDA-MB-231 o es una característica común de la mayoría de los cánceres de origen epitelial, se estudiaron dos líneas celulares de cáncer adicionales. Por lo tanto, la dinámica de actina en el borde delantero de HeLa y células A549, un cuello uterino y un adenocarcinoma pulmonar humano, respectivamente [49], [50], se examinaron después de la transfección transitoria con GFP-actina (Figura 2A). Ambas líneas celulares mostraron una fracción móvil grande después de 30 segundos, con valores medios similares a los de MDA-MB-231 células (los valores de 62 a 64%; Figura 2B) y los tiempos de recuperación varían dentro de un rango similar, de 2 a 5 segundos (Figura 2C). Por cierto, las células A549 exhiben la recuperación más rápida, con un valor de tau cerca de 2 segundos (Figura 2C).
A) Dos ejemplos de recuperación de fluorescencia individual de GFP-actina obtenido a partir de A549 y células HeLa. B) Gráfico de barras de la fracción promedio móvil comparando MDA-MB-231, células HeLa y A549. Los valores medios calculados fueron 62,4 ± 4,2% para HeLa (n = 12) y 64,7 ± 4,3% para A549 (n = 10). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en comparación con las células MDA-MB-231. C) Los valores medios de los valores exponenciales tau obtenidos a partir de las curvas de recuperación de montaje. MDA-MB-231 células se recuperaron con un valor de tau de 4,1 ± 0,6 s, mientras que las células HeLa muestran una tau de 5,5 ± 1,7 s. Las células A549 demostraron la recuperación más rápido de todos, con una tau de 1,9 ± 0,35 s, que fue estadísticamente diferente del tiempo de recuperación MDA-MB-231 (p & lt; 0,005, prueba t de Student).
Desde MDA-MB-231 células de cáncer de mama tienen un origen epitelial, también en comparación con su dinámica de actina de una línea de célula no cancerosa del MCF10A, una línea de células epiteliales mamarias humanas transfectadas con GFP-actina. Los resultados (resumidos en la Figura 3) indica que el citoesqueleto de MCF10A tenía una fracción móvil actina menor que la de la línea celular de cáncer de contrapartida (50% versus 70%: Figura 3A-B). El tiempo de recuperación también fue diferente, con un valor medio cercano a 7 segundos. Se obtuvieron resultados similares cuando se examinaron células de fibroblastos de origen no relacionada. Murinos fibroblastos embrionarios (MEFs) tenían un valor de la fracción móvil cerca del 40%, con un tiempo de recuperación de alrededor de 8 segundos (Figura 3A-C). En resumen, los datos experimentales indican que las células cancerosas analizadas muestran un citoesqueleto mucho más dinámica que las células no cancerosas.
A) Dos ejemplos de curvas de recuperación actina individuales en el borde de ataque después de photobleaching de GFP-actina de MCF10A células MEF (murinos) (humano) y. La recuperación de las células MDA-MB-231 se representa como una línea de puntos de color rojo para la comparación. B) resumieron los datos de las fracciones móviles de MEFs (39 ± 4,2%, n = 18) y MCF10A (51,7 ± 1%, n = 6) en comparación con células tumorales MDA-MB-231. Cada tipo de célula muestra diferencias estadísticas en comparación con la recuperación fracción móvil MDA-MB-231 (p & lt; 0,005, prueba t de Student). Las fracciones móviles de MCF10A y células MEF no fueron estadísticamente diferentes (prueba t de Student). C) Los tiempos de recuperación de ambos MEFs (tau = 7,5 ± 1,6 s) y células MCF10A (tau = 6,5 ± 0,4 s) fueron estadísticamente diferente a la de MDA-MB-231 células (P & lt; 0,005 y p & lt; 0,05; t de Student -test).
MDA-MB-231 dinámica de la actina son independientes de la presencia de factores de crecimiento extracelulares
independencia Adquirido de señalización del factor de crecimiento extracelular es una característica típica de las células del cáncer de mama [51]. En las líneas celulares no cancerosas, la motilidad celular y la polarización son dirigidas por una acumulación local de PIP
3; impulsado principalmente por la activación de PI3K o activación de la integrina local. De hecho, la señalización de PI3K aberrante es un tema que se repite tanto en la iniciación y progresión de una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de mama [45]. El próximo querían probar la dependencia de la dinámica de la actina en la vanguardia de la presencia de factores de crecimiento extracelular. Con este fin, se estudió la dinámica de la actina de cáncer y líneas celulares no cancerosas después de un período de privación de suero de 16 horas. Los resultados indican que MDA-MB-231 fracción móvil no se vio afectada por la condición de la privación de suero (Figura 4A), con un valor medio móvil fracción de 58 ± 3%, y un tau media de recuperación de 6,6 segundos, que no fue estadísticamente diferente a partir de los valores obtenidos en presencia de suero (Figura 4B y D). Una consecuencia inmediata de la ausencia de factores de crecimiento es la reducción del PIP
3 de señalización a nivel de la membrana. Para confirmar la influencia de PIP
3 en la modulación de la actina, se analizó la dinámica de actina en el borde de ataque 30 minutos después de haber tratado las células con el inhibidor de PI3K LY294002 (20 M). La fracción móvil mostró un valor medio de 57 ± 2%, y la fluorescencia se recuperó con una constante de tiempo de 4,2 segundos, que no fue estadísticamente diferente de la bajo control o de suero condiciones de inanición (Figura 4B y D).
a) Ejemplo de recuperación después de fluorescencia FRAP en condiciones de control (10% de SFB, la trama de FBS) y la privación de suero durante 16 horas (Starving trama). los datos B) Resumen de la fracción media móvil en las células MDA-MB-231. La fracción móvil media bajo condiciones de FBS era 62 ± 5,2% (n = 6), en comparación con 58 ± 3% después de 16 horas de inanición y 57 ± 2% (n = 6) después de la inhibición de PI3K con LY294002 (n = 6) . Cabe señalar que hemos incluido nuevas células de control, que crecen en paralelo y se analizaron en el mismo día y en las mismas condiciones; Por lo tanto, la fracción móvil promedio tiene un valor ligeramente diferente que el promedio de la media global (70% versus 65%). C) La fracción móvil de las células no cancerosas en condiciones privadas de suero se redujo a 27 ± 5,2% (n = 10) en fibroblastos de ratón y a 28 ± 2,4% en MCF10A (n = 6), (p & lt; 0,05; Student de t-test). D) gráfico de resumen del tiempo de recuperación. MDA-MB-231 que crece en FBS tendían a mostrar la dinámica más rápida (4,14 ± 0,6 s) no estadísticamente significativas de la de las células de hambre (6,6 ± 1,7 s). El uso de LY294002, un inhibidor químico de PI3K, no afectó el tiempo de recuperación (4,2 ± 1,0 s). E) Por el contrario, la privación de suero afectado el tiempo de recuperación de las células no cancerosas, lo que aumenta la constante de tiempo de 8,2 ± 0,2 s a 9,5 ± 0,1 s para los MEF (p & lt; 0,05) y 6,5 ± 0,4 s a 8,0 ± 1,2 s para MCF10A las células (p & lt; 0,05; prueba t de Student)
Por el contrario, la fracción de células MCF10A móvil se redujo en condiciones de privación de suero (valor de 28 ± 2.4% comparado con el 51% en condiciones de control significar. ; Figura 4C). Se observó la dependencia similar de suero extracelular en MEFs, cuya fracción móvil disminuido desde un valor cercano al 40% a un valor en torno al 27% (Figura 4C). El tiempo de recuperación también se vio afectada, en las células MCF10A aumentó de 6,5 ± 0,4 segundos en 8,0 ± 1,2 segundos, mientras que en las células MEF aumentó de 8,2 ± 0,2 a 9,5 ± 0,1 segundos (Figura 4E).
A partir de los resultados obtenidos en esta sección, se concluye que en las células MDA-MB-231, tanto la fracción móvil de la actina y la evolución temporal de la recuperación no se ven afectadas por la presencia de factores de crecimiento extracelulares y la regulación de la membrana de PIP niveles
3.
PfnI regulación aumenta el tamaño celular y el número de conjuntos combustibles
varias proteínas de unión a actina se desregulado en líneas celulares de cáncer [28], [52], entre ellos Profilin (PfnI), que fue propuesto como una proteína supresora de tumores [27], [30]. PfnI niveles de expresión son significativamente las reguladas en diversos tipos de células de adenocarcinoma.