Extracto
Los genes de desarrollo son silenciados en las células madre embrionarias mediante una marca de la cromatina basada en la histona bivalente. Se ha propuesto que esta marca también confiere una predisposición a aberrante promotor de ADN hipermetilación de genes supresores de tumores (ETG) en el cáncer. Presentamos aquí que el silenciamiento de una proporción significativa de estos ETG en células madre embrionarias y adultas humanas está asociado con la hipermetilación del promotor de ADN. Nuestros resultados indican un papel de la metilación del ADN en el control de la expresión génica en las células madre humanas y sugieren que, para los genes reprimidos por la hipermetilación del promotor en las células madre
in vivo
, el proceso aberrante en el cáncer podría entenderse como una defecto en el establecimiento de un promotor metilado durante la diferenciación, en lugar de como un proceso anómalo de
de novo
hipermetilación
Visto:. Calvanese V, Horrillo a, Hmadcha a, B Suárez-Álvarez, Fernández AF , Lara E, et al. Genes (2008) Cancer hypermethylated en células madre embrionarias humanas. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10.1371 /journal.pone.0003294
Editor: Maarten van Lohuizen M. S., Instituto del Cáncer de Holanda, Países Bajos
Recibido: 30 de abril de 2008; Aceptado: 1 de septiembre de 2008; Publicado: 29 Septiembre 2008
Derechos de Autor © 2008 Calvanese et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado principalmente por la Unión Europea (LSHG-CT-2006 a 018739; ESTOOLS). MFP está financiado por el Ramón & amp español; Programa Cajal y el Departamento de Salud del Gobierno español (PI061267). El grupo de Epigenética del Cáncer del CNIO es apoyada por la Salud (FIS01-04) y Educación y Ciencia (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC y Consolider MEC09-05) Departamentos del Gobierno español, el europeo subvención TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, y la Asociación española contra el cáncer (AECC). VC es un beneficiario de una beca del Programa de Investigación FPU español. CLL y BSA son apoyados por el Departamento de Salud del Gobierno español (PI051707). El BACM es apoyado por la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (0029 y 0030/2006 a PM) y el Ministerio de Sanidad español a PM (FIS PI070026). CB es apoyado por la Fundación Internacional José Carreras contra la Leucemia (EDThomas-05) y el ISCIII (FIS 3 + 3 contrato). El Instituto de Neurobiología Reconstructiva recibió fondos adicionales de la DFG y la Fundación Hertie. BS, ABH y ANH son apoyados por la Fundación Progreso y Salud y el Instituto de Salud Carlos III-Red Española de Terapia Celular (RD06 /0010/0025). PWA, NH y HDM también son apoyados por el MRC
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En el curso del desarrollo embrionario. , las células totipotentes son inicialmente pero, al cabo de unos divisiones, comienzan a perder potencia y se transformó en células pluripotentes, finalmente, convertirse en células somáticas diferenciadas terminalmente. La pérdida progresiva de la potencia durante la diferenciación tiene implicaciones fundamentales para la enfermedad debido a la recuperación de la pluripotencia través de la reprogramación nuclear es uno de los principales desafíos para la medicina regenerativa [1], y debido a la interrupción del proceso de desarrollo que da lugar a una célula somática terminales diferenciadas a partir de su células progenitoras correspondiente puede dar lugar a la transformación maligna [2].
la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) requiere la represión de factores de transcripción implicados en el mantenimiento de la pluripotencia y la activación de los genes de desarrollo. Ambos procesos son dirigidos por mecanismos epigenéticos específicos. Un ejemplo del primer tipo es el promotor represión dependiente de hipermetilación de genes pluripotencia-mantener como NANOG y OCT4 como células madre se diferencian [3]. Hasta el momento, la activación de los genes de desarrollo durante la diferenciación de células madre en la metilación del ADN se ha estudiado tan a fondo. En su lugar, estos genes de desarrollo han sido reportados como miembros de un estado reprimido durante las primeras etapas de desarrollo, debido a la creación de un patrón específico de modificación de las histonas, denominado "dominios bivalentes", que consiste en grandes regiones de H3 lisina 27 de metilación que albergan las regiones más pequeñas de H3 lisina 4 metilación [4]. Este estado de la cromatina-represiva está mediada por el grupo Polycomb de proteínas [5], [6] y se cree que predisponen a la hipermetilación aberrante en el cáncer [7] - [9]. El hallazgo de que el tratamiento de hESCs con el fármaco de desmetilación 5'-aza-2'- desoxicitidina provoca la diferenciación cardiaca y la reactivación de genes [10] nos llevó a examinar si la metilación del ADN promotor podría contribuir a la creación y el mantenimiento de la represión de genes específicos en hESCs . Para establecer su existencia y su supuesta relación con el promotor hipermetilación aberrante en el cáncer, se compararon los patrones de metilación de ADN promotora de un panel de 800 genes relacionados con el cáncer entre hESCs y diferentes tipos de tejidos adultos terminalmente diferenciadas y las líneas celulares de cáncer.
resultados
ADN promotor perfiles de metilación en hESCs, tejidos diferenciados normales y muestras de cáncer
Se utilizó Illumina Goldengate metilación matrices © comparar el estado de metilación de ADN de 1.505 secuencias (de 807 genes) en ocho hESCs aislados independientemente líneas, 21 tejidos normales humanos primarios (NPTS) correspondientes a seis tipos normales de tejido (NTTS) y 21 líneas celulares de cáncer humano (LCC) (ver Métodos). Los genes incluidos en las matrices de metilación se eligieron sobre la base de su importancia para el comportamiento celular y la diferenciación y se incluyen genes previamente reportados para ser diferencialmente metilado, así como supresores de tumores genes, oncogenes y genes que codifican para factores implicados en el ciclo celular punto de verificación [ ,,,0],11]. Nos primera seleccionaron los genes autosómicos (766) de las matrices con el fin de excluir genes de ADN dependiente de la metilación del cromosoma X inactivado. Como se informó anteriormente, el agrupamiento no supervisado de las muestras usando exclusivamente las señales de metilación de los genes autosómicos (1.421 secuencias) contenidos en las matrices de activar la clasificación correcta de cada muestra dentro de su correspondiente grupo (células madre, NPT, o CCL) (Figura 1 A, y ver Figura S1 en los datos suplementarios en línea para este artículo), confirmando de ese modo que cada grupo de muestras tiene una firma específica de metilación del ADN [11]. Posteriormente, se trató de clasificar los genes en la matriz en relación con su estado de metilación en los tres tipos de muestra analizada (células madre, CCL, y NPT) (Figura 1A, y en las Tablas 1 y S1). Se encontró que el 65.31% (928 /1.421) de las secuencias no fueron hypermethylated frecuencia en hESCs (array signal≤0.7 in≥25% (2/8) de las muestras) y que la mitad de ellos (464/928) fueron hypermethylated frecuencia en el CCL (señal array & gt; 0,7 in≥25% (6/21) de las muestras). La gran mayoría de estas secuencias (99,78%, 463/464) eran no metilado en al menos uno de los tractores de vía estrecha analizados (señal array & lt; 0,3 in≥1 /6 tractores de vía estrecha). Este hallazgo es consistente con la opinión de que genes aberrantemente hypermethylated en el cáncer (es decir, no hypermethylated en los tejidos normales) no están hypermethylated en hESCs [8]. Llamamos a este grupo de genes Clase clásica un cáncer hypermethylated genes (Tablas 1 y S1).
(A) los perfiles de metilación de la clase IA (350), A-II (94), BI (20), y B-II (107) genes en hESCs (8), normales (21), y cáncer (21) muestras obtenidas por arrays Illumina. Los niveles de metilación varían de completamente metilado (rojo) al completamente no metilado (blanco). Las columnas de la derecha muestran el estado de metilación de las histonas H3 y la ocupación Polycomb de los mismos genes obtenidos a partir de los datos publicados anteriormente [5], [12], [16]. Azul, metilación en K4 y K27; naranja, metilación en K4 solo; verde, no metilación en K4 o K27; negro, la presencia de la proteína Polycomb SUZ12. (B) el enriquecimiento de la SUZ12 proteínas Polycomb, la firma de la cromatina bivalente (K4 /K27) o la ausencia de ambas marcas (ninguno) en los genes de Clase A y Clase B (panel superior) y la Clase I y Clase II genes (panel inferior) .
de manera significativa, se encontró que 34,69% (493 /1.421) de las secuencias fueron con frecuencia hypermethylated en hESCs (señal array & gt; 0,7 in≥25% (2/8) de las muestras ). La mayoría de estos (79,72%, 393/493) también fueron hypermethylated frecuencia en CCLs (señal array & gt; 0,7 in≥25% (6/21)) de las muestras). De nuevo, muchos de ellos (32,32%, 127/393) eran no metilado en al menos uno de los tractores de vía estrecha analizados (señal array & lt; 0,3 in≥17% (1/6) tractores de vía estrecha) (Figura 1, y Tablas 1 y S1). En contraste con la Clase A de cáncer hypermethylated genes, los de este grupo también se hypermethylated frecuencia en hESCs, por lo que proponemos que puedan ser considerados miembros de una categoría diferente de los genes del cáncer metilado, que hemos denominado los genes del cáncer de Clase B hypermethylated. De las 697 secuencias de frecuencia hypermethylated en el cáncer y no metilados en al menos uno de los tractores de vía estrecha analizó, 444 (66,70%) y 127 (18.22%) fueron clasificados, respectivamente, como genes de Clase A y Clase B (Figura 1, y Tablas 1 y S1) , que indica, contrariamente a lo esperado, que una proporción sustancial (alrededor de 20%) de los genes del cáncer metilado también se hypermethylated frecuencia en hESCs.
Curiosamente, no todos los genes con frecuencia hypermethylated en CCLs eran completamente no metilado en toda la tractores de vía estrecha analizado (Figura 1, y Tablas 1 y S1). La frecuencia de hipermetilación en los tejidos normales sólo es de importancia moderada para los genes del cáncer de Clase A clásica metilados, ya que la mayoría de ellos (78,83%; 350/444 secuencias) están metilados en las TNF. Por otro lado, sólo 20 secuencias correspondientes a genes de Clase B se no metilado en toda la tractores de vía estrecha analizada (Tabla 1). Cuando un gen es metilado en algunos pero no todos los tejidos normales, la metilación es probablemente involucrados en la especificación de un tipo de tejido durante el desarrollo [12]. Cuando el gen no se hypermethylated en hESCs, debe ocurrir la metilación selectiva de tejido de tipo dependiente. Por el contrario, cuando el gen es frecuentemente hypermethylated en hESCs, lo más probablemente, se convierte en desmetila selectivamente la diferenciación como un mecanismo epigenético que es capaz de facilitar la especificación de tejidos. A la inversa, cuando un gen no está metilada en todas las células diferenciadas normales y hypermethylated en las células madre, es más probable que participen en los procesos de diferenciación temprana que en la especificación de tejidos [12] de la pérdida de la metilación del promotor que se produce necesariamente durante la diferenciación. Por lo tanto, definimos dos nuevas subcategorías para ambos cáncer metilado genes de Clase A y B: Subcategoría I, para los genes que son siempre no metilado en los tejidos normales, y la subcategoría II, para los genes que a veces están metilados en los tejidos normales (Figura 1 y las Tablas 1 y S1). El porcentaje de genes de clase B-II Clase A-II y es bastante similar (7,53% y 6,61%) (Tabla 1). Sin embargo, el porcentaje de genes de la clase A-I (24,63%) es mucho más alta que en la clase B-I (1,41%). Los genes en estas cuatro categorías (A-I, A-II, B-I y II-B) representan el 58,2% del total de las secuencias presentes en las matrices de metilación. Al tener en cuenta el estado de metilación de los tres grupos de muestras (hESCs, NPT, y CCL) fuimos capaces de agrupar la mayor parte de los genes restantes de la matriz en ocho categorías adicionales (Tabla 1), que incluían, por ejemplo, dos categorías de genes que definimos como constitutivamente metilado (metilados en hESCs, CCL, y todos los tractores de vía estrecha; 11,19%) o constitutivamente no metilado (no metilado en hESCs, CCL, y todos los tractores de vía estrecha; 28,43%) los genes, respectivamente. Por tanto, proponemos que la metilación del ADN no es importante para la regulación de los genes en estas categorías. La clasificación de los genes en función de su estado de metilación en CMEh, CCL, y tractores de vía estrecha, y la interpretación de la función biológica de la metilación del ADN en los genes de cada grupo se resume en la Tabla 1. Tabla S1 enumera los genes en cada grupo.
es importante señalar aquí que todos los porcentajes descritos anteriormente se refieren a los 807 genes incluidos en matrices de metilación, mientras que el porcentaje global de genes en cada grupo podría ser diferente si se considera todo el genoma. El umbral de clasificación que se empleó para identificar los genes con frecuencia hypermethylated en hESCs (más de 70% de promotor de metilación de CpG en más de 25% de las muestras analizadas) es la que se utiliza comúnmente para definir un gen como se hypermethylated frecuencia en el cáncer [13] . Para evaluar si nuestras observaciones son válidas para los umbrales de clasificación astringentes volvimos a examinar nuestros datos en busca de: i) secuencias hypermethylated en la mayoría de las hESCs analizados (señal de la serie & gt; 0,7 in≥75% (6/8) de la hESCs) y, ii ) secuencias "totalmente metilados" en algunas de las hESCs analizados (señal array & gt; 0,8) in≥25% (2/8) de la hESCs) (Tabla S2). Se encontró que el 5 de BI y 84 secuencias B-II equipados con el primer criterio, y el 13 de BI y 86 secuencias B-II se ajustaba a la segunda (Tabla S2), lo que indica que nuestras conclusiones siguen siendo válidas incluso con estos umbrales de clasificación más estrictos.
recientemente se ha demostrado que la prolongada
in vitro en Francia culture de hESCs está asociado con la metilación del ADN inestabilidad [14], [15]. Para evaluar si la hipermetilación del promotor de los genes de clase B se asocia con el
in vitro
proceso de cultivo en, comparamos nuestros datos con los publicados anteriormente por Bibikova
et al.
[11]. Estos autores utilizaron la plataforma de metilación Goldengate para comparar el estado de metilación de los 1505 sitios CpG contenidos en las matrices en diez líneas de células madre en pasajes bajos y altos. Ellos encontraron que, aunque se produjeron cambios en la metilación con el número de paso, estos cambios eran pequeños en comparación con las diferencias entre los tipos de células. Ellos encontraron cinco genes (
ascl2
,
GALR1
,
MEST
,
NPY, España y
SLC5A8
) para ser consistente hypermethylated con el número de paso (aumento en el nivel de metilación & gt; 0,34 en al menos dos líneas celulares (20%)). Tres de esos genes (
ascl2
,
NPY, España y
SLC5A8
) son miembros de la clase B-I, pero, curiosamente, ninguno era un gen B-Clase II. Estos resultados sugieren que la prolongación de
in vitro Francia culture sólo era responsable de la hipermetilación del promotor de una pequeña fracción (3/97, 3%) de los genes de clase B, y que el efecto parece ser mayor en BI Clase los genes.
Como se dijo anteriormente, recientemente se ha propuesto que los genes de desarrollo son silenciados en las células madre embrionarias mediante una marca de la cromatina basada en la histona bivalente Polycomb dependiente [4], [5], que se piensa que predisponen a aberrante promotor de ADN hipermetilación de ETG en el cáncer [7] - [9]. Como se encontró que un subconjunto de los genes del cáncer metilado también puede ser metilado en hESCs hemos querido investigar la relación entre la hipermetilación del promotor y el patrón de modificación de las histonas Polycomb-dependiente en hESCs. Con este fin, hemos comparado nuestros datos de metilación de la Clase AI, A-II, BI, y los genes B-II con el perfil modificación de las histonas se informó anteriormente y la ocupación Polycomb de los mismos genes en células madre embrionarias [5], [12] , [16] (Figura 1 y Tabla S3). Coherente con un informe anterior [9], se encontró que alrededor del 35% de las secuencias con frecuencia hypermethylated en el cáncer y no metilados en al menos uno de los tractores de vía estrecha marcas analizadas contenían cromatina represiva en sus promotores (228-277 /697 albergaba meK27, y 236/697 contenían SUZ12). Curiosamente, la comparación de nuestros datos de metilación con las de Mikkelsen
et al.
[16] se observó que la gran mayoría (96,4%) de genes que albergan meK27 también contenía MEK4 y que sólo alrededor del 30% de los genes hypermethylated frecuencia en el cáncer presentado el dominio de la cromatina bivalente (MEK4 /meK27) en hESCs (Tabla S3).
Cuando se compararon los patrones de la cromatina y la ocupación Polycomb en la Clase AI, a-II, BI, y los genes B-II encontramos que cada grupo tenga una firma cromatina específica (p & lt; 0,00001). genes de Clase A eran más enriquecido en Polycomb y marcas bivalentes (47,5% y 45,5 a 57,3% de los genes, respectivamente) que los genes de clase B (19,7% y 21,4 a 32,7%, respectivamente) (p & lt; 0,00001) (Figura 1B y Tabla S4 ). El enriquecimiento de la marca bivalente en los genes de clase A se debe principalmente a los bajos niveles de esta firma de la cromatina en los genes de clase B-II (Tabla S4). De hecho, los genes Clase B-I presentan niveles similares de MEK4 /meK27 a los genes de la Clase A (Tabla S4) (p & lt; 0,00001). Curiosamente, los genes de clase II, se ocupaban mucho menos frecuentemente por proteínas Polycomb y exhiben menos marcas bivalentes (33,3% y 26,5 a 38,8% de los genes, respectivamente) (p & lt; 0,00001) que los genes de clase I (45,7% y 47,6 a 59,3 %, respectivamente), (Figura 1B y Tabla S4). Los niveles más bajos de la marca bivalente de la clase II genes se debieron principalmente a los bajos niveles de esta firma de la cromatina en los genes de clase B-II (Tabla S4). De hecho, los genes de Clase A-II tenían niveles similares de MEK4 /meK27 a los de los genes de clase I (Tabla S4) (p & lt; 0,00001).
ETG reprimidos por la hipermetilación del promotor en hESCs
Para probar las hipótesis formuladas sobre la base de los datos obtenidos a partir de las matrices de metilación, nos centramos nuestra atención en cuatro genes de clase B (con frecuencia hypermethylated en el cáncer y hESCs) que fueron previamente ampliamente informado de que los genes con propiedades supresoras de tumores y que están hypermethylated frecuencia en el cáncer. Se seleccionaron dos (MGMT y SLC5A8) [17], [18] a partir de la subcategoría de Clase BI (no metilado en todos los tractores de vía estrecha) y dos (PYCARD y RUNX3) [19], [20] de la clase B-II (no metilado en una serie de tractores de vía estrecha). Nos primera empleó secuenciación de bisulfito de múltiples clones para determinar con precisión el estado de metilación del promotor de ADN de estos genes en hESCs y tejidos normales (Figura 2A, y las figuras S2, S3, S4, S5). En todos los casos, los datos de secuenciación de bisulfito corroboraron los resultados obtenidos de los arrays y demostraron que la hipermetilación observado en hESCs afectó a la mayoría de las CpG que rodean la puesta en sitio de la transcripción de los genes seleccionados. MGMT y SLC5A8 (Clase BI) presentan densa promotor hipermetilación en hESCs pero no en tejidos diferenciados normales (Figura 2A, y las figuras S2, S3), mientras que los genes de Clase B-II fueron hypermethylated frecuencia en hESCs y algunas veces en los tejidos normales (Figuras S4, S5 ). Para entender mejor el papel de promotor de la hipermetilación de nuestros ETG seleccionados en hESCs y tractores de vía estrecha, se utilizó q-RT-PCR para medir su expresión en los dos grupos de la muestra (Figura 2B, y las figuras S2, S3, S4, S5). Se encontró que la hipermetilación del promotor siempre se asoció con la represión de genes, pero su ausencia en tejidos primarios somáticas no implica necesariamente la regulación al alza del gen. Por ejemplo, mientras que
SLC5A8
se hypomethylated en todos los tejidos normales analizados (Figura S3 A, B), se sobreexpresa únicamente en el cerebro, el hígado y el colon (Figura S3C).
(A ) secuenciación genómica de bisulfito de múltiples clones de la Gestión de promotor en hESCs (I3, H14), tejidos primarios normales (linfocitos piscina, mama normal) y dos de las CCL linfoide y el origen de mama (U937 y MDA-MB-231, respectivamente). Negro, CpG metilado; blanco, CpG no metilado; rojo, CpG no está presente. La barra verde arriba del diagrama de la isla CpG MGMT indica la ubicación de la sonda utilizada en las matrices de metilación. (B) Relación entre Gestión de promotor hipermetilación y la expresión en células madre, las muestras normales y cancerosas. El panel superior muestra la señal de metilación relativa obtenida con las matrices de metilación y el panel inferior a los niveles de expresión de ARNm MGMT relativos a GAPDH.
Pérdida de la hipermetilación del promotor y la activación de genes durante la
in vitro
diferenciación de hESCs
Para demostrar aún más que la diferenciación de hESCs se asocia con menos metilación del ADN en la región promotora de ciertos genes, se indujo la
en la diferenciación in vitro Red de la línea de células madre Shef -1 en dos linajes de células (células similares a fibroblastos y precursores neuronales) (Figura 3A). Se evaluó la especificación de linaje utilizando marcadores publicados previamente [21] (Figura 3A, paneles de la derecha) y luego se usa matrices de metilación para identificar los genes que se convirtió en hypomethylated durante la diferenciación. Se encontró que el 12,98% (37/285) de los genes en hypermethylated Shef-1 (que no estaban metilados en toda analizó la tractores de vía estrecha) se convierten en no metilado durante la
in vitro
diferenciación. De éstos, 12 se convierten en los genes metilados durante la diferenciación neuronal y 25 durante la diferenciación espontánea (cuadro S5). Tres de estos genes eran comunes a ambos grupos (Figura 3B) y dos de ellos pertenecían a la clase B-II. Es de particular interés que, mientras que 9/25 de los genes metilados durante la diferenciación espontánea eran de la clase B-II, ninguno de los 12 genes metilados durante la diferenciación neuronal pertenecía a esta categoría.
(A) izquierda- imágenes de mano, Shef-1 línea de células madre (superior) y las mismas células después de la diferenciación neuronal (medio) y la diferenciación espontánea de células similares a fibroblastos (inferior). Los paneles del lado derecho muestran los niveles relativos de ARNm de pluripotencia (NANOG, Oct4), neuroectodérmico (PAX6, NeuroD1), y mesodérmico (COL1A1, FN1) marcadores antes y después de Shef-1 diferenciación. (B) Número de secuencias hypomethylated durante Shef-1 neuronal (círculo rojo) y la diferenciación espontánea (círculo azul), y su superposición con los genes de clase B-II (círculos negros) Clase B-I y. (C) de bisulfito de la secuencia genómica de múltiples clones del promotor DLC1 en Shef-1 línea de células madre (superior) y las mismas células después de la diferenciación neuronal (medio) y diferenciación espontánea a las células similares a fibroblastos (inferior). El código de color es como para la Figura 2. Relación (D) entre el promotor DLC1 hipermetilación y la expresión durante la diferenciación de las células Shef-1. El panel superior muestra la señal de metilación relativa obtenida con las matrices de metilación y el panel inferior a los niveles de expresión de ARNm DLC1 relativos a GAPDH.
Para demostrar que algunos ETG que se hypermethylated con frecuencia en el cáncer y pueden los CMEh perder la metilación durante la diferenciación, nos centramos nuestra atención en DLC1. Elegimos este gen debido a que las matrices de metilación habían demostrado que perdió la metilación del promotor durante la diferenciación espontánea de Shef-1, y debido a que es conocido por ser un TSG que se hypermethylated frecuencia en el cáncer (Figura S6) [22], [23]. secuenciación de bisulfito de múltiples clones corrobora los resultados obtenidos con las matrices de metilación y mostró que el promotor DLC1 se hypermethylated en Shef-1 y se convierte en no metilado durante espontánea, pero no neural, la diferenciación (Figura 3C). En Q-RT-PCR experimentos DLC1 se expresó mal en la línea celular Shef-1 y se hizo sobreexpresa durante espontánea, pero no neuronal, la diferenciación (Figura 3D).
ETG reprimidos por la hipermetilación del promotor en progenitores de células madre hematopoyéticas
Después de haber demostrado que algunos genes del cáncer se hypermethylated y reprimidos en hESCs y que se puede perder durante la metilación
in vitro
diferenciación de hESCs, se investigó si este fenómeno se limita a desarrollo embrionario o, a la inversa , es un mecanismo epigenético asociado con el estado de stemness independientemente de la etapa ontogénica de la célula. Utilizamos matrices de metilación para identificar genes hipermetilados en CD34 + progenitores de células madre somáticas (Figura S7) en comparación con los linfocitos y neutrófilos de sangre periférica, dos tipos de células primarias adultas derivadas de los progenitores CD34 + hematopoyéticos. Se identificaron 362 secuencias hypermethylated significativamente en las células CD34 + (señal array & gt; 0,7) (Tabla S6). La gran mayoría de estas secuencias (92,27%, 334/362) también se metilado en hESCs y la mayoría fueron con frecuencia en hypermethylated CCL (83,43%, 302/362) (Figura 4A y Tabla S6). Estos resultados sugieren que la hipermetilación de los genes del cáncer se puede producir en las células madre, independientemente de la etapa de ontogénica (embrión vs. adulto). A continuación identificaron nueve secuencias que fueron hypermethylated significativamente en células CD34 + con relación a los linfocitos periféricos, y 16 secuencias que se hypermethylated en estas células progenitoras relativos a los neutrófilos (Tabla S7). La mayor parte de las secuencias identificadas fueron también hypermethylated frecuencia en hESCs (8/9 para los linfocitos y 14/16 para los neutrófilos) y CCL (6/9 para los linfocitos y 13/16 para los neutrófilos). Además, no había secuencias comunes a los linfocitos y neutrófilos, y la mayoría de ellos eran a veces hypermethylated en las TNF. Curiosamente, 28 de estas secuencias fueron clasificados previamente como los genes de clase B-II, mientras que ninguno de ellos era de la Clase BI (Figura 4A).
(A) El panel de la izquierda muestra el número de secuencias que se hypermethylated en las células madre somáticas CD34 +, y hypermethylated en hESCs y CCL. Tenga en cuenta que la mayor parte de las secuencias de hypermethylated en las células madre somáticas también están hypermethylated en las células madre embrionarias. El panel de la derecha muestra el número de secuencias hypermethylated en las células CD34 + (círculo negro) clasificados como genes de clase B-II (círculo rojo). Hypermethylated secuencias en las células CD34 + no fueron clasificados como genes de clase B-I (círculo azul). (B) secuenciación genómica bisulfito de múltiples clones del promotor AIM2 en Shef-1 y líneas de células madre I3 (superior), CD34 + progenitores de células madre hematopoyéticas (medio), y las células hematopoyéticas diferenciadas terminalmente (linfocitos periféricos y neutrófilos). El código de color es como para la Figura 2. Relación (C) entre
AIM2
y
RUNX3
hipermetilación del promotor y de expresión en CD34 + progenitoras somáticas de células madre hematopoyéticas y las células hematopoyéticas diferenciadas terminalmente (linfocitos periféricos y neutrófilos ). El panel superior muestra la señal de metilación relativa obtenida con las matrices de metilación y el panel inferior a los niveles de expresión de
AIM2
y
RUNX3
ARNm relativa a GAPDH.
por último, para demostrar que algunos genes del cáncer metilado son también frecuentemente metilado en las células madre progenitoras somáticas y que su metilación es importante para la especificación del linaje, hemos considerado dos genes:
RUNX3
y
AIM2
. Seleccionamos
RUNX3
porque, de acuerdo con los datos publicados anteriormente [24], nuestras matrices de metilación mostraron que, en comparación con las células CD34 +,
RUNX3
se hypomethylated en los linfocitos periféricos, pero no en los neutrófilos periféricos.
AIM2
fue seleccionado porque se pensaba previamente que una ETG que se hypermethylated con frecuencia en el cáncer (Figura S8) [25] y porque, a diferencia de
RUNX3
, se convierte en metilado específicamente en la mieloide linaje (Figura 4B, C). Los datos de secuenciación de bisulfito confirmaron los resultados obtenidos con las matrices, lo que demuestra que las células CD34 + y los linfocitos periféricos se metilado densamente en el promotor de
AIM2
gen, mientras que los neutrófilos periféricos eran casi no metilado (Figura 4B). Para determinar el papel de la hipermetilación del promotor de
AIM2
y
RUNX3 Hoteles en la diferenciación hematopoyética, que utiliza Q-RT-PCR para analizar su expresión en nuestros grupos de muestras (Figura 4C). Se encontró que la hipermetilación del promotor siempre estuvo asociada con la represión de genes en ambos genes y que la pérdida de metilación en el promotor
AIM2
y
RUNX3 Hoteles en linfocitos periféricos y neutrófilos, respectivamente, se asoció con su reexpresión ( Figura 4C).
Discusión
aberrante promotor hipermetilación de las ETG y factores de diferenciación es una alteración epigenética central en el cáncer [26], [27]. Se han notificado los genes sometidos a este tipo de alteraciones en el cáncer de ser reprimidos en hESCs por el establecimiento de "dominios de la cromatina bivalentes" que consiste en la activación (H3 lisina 27 de metilación) y reprimiendo (H3 lisina 4 metilación) marcas de histona que los mantienen contrapesado para la activación, pero , al mismo tiempo, los predispone a aberrante hipermetilación promotor en cánceres en adultos [7] - [9]. En este documento se demuestra que existe otro nivel de complejidad por lo que algunos de los genes con frecuencia de manera aberrante hypermethylated en el cáncer también están hypermethylated frecuencia en hESCs. Nuestros resultados sugieren que, como se ha propuesto previamente para células de ratón [28], el promotor de la metilación del ADN puede ser un factor importante en la regulación de genes en hESCs.
Sobre la base del estado de metilación en hESCs establecimos dos categorías de cáncer de genes metilados: genes de clase a, que son con frecuencia no metilado en hESCs, y los genes de clase B, que son hypermethylated frecuencia en hESCs. Como hemos encontrado inesperadamente que una proporción sustancial de los genes incluidos en ambos grupos fueron también frecuentemente hypermethylated en los tejidos diferenciados normales, establecimos dos nuevas subcategorías de genes del cáncer metilado: subcategoría I, para los genes que son en su mayoría no metilado en los tejidos normales, y la subcategoría II , para los genes que a veces se hypermethylated en los tejidos normales. La interpretación biológica de la metilación aberrante en cáncer metilado genes de las clases A y B y sus dos subcategorías es completamente diferente. genes de Clase A-I son frecuentemente hypermethylated en el cáncer pero no en tejidos normales o hESCs. No se supone que estos genes están regulados por la metilación del ADN durante el desarrollo normal y por lo tanto la hipermetilación en el cáncer siempre debe ser interpretado como un proceso aberrante. genes de la clase A-II son frecuentemente metilado en el CCL y algunas veces en los tejidos normales, pero rara vez en hESCs. La metilación de estos genes puede ser importante para la especificación de linaje y se debe considerar aberrante en el cáncer cuando se produce en un tipo de tumor en cuyo tejido normal correspondiente no se hypermethylated. BI genes de clase (con exclusión de
ascl2
,
NPY, España y
SLC5A8
genes, cuyo promotor hipermetilación del ADN en líneas de células madre podría ser debido a la
in vitro
proceso de cultivo [11]) se hypermethylated frecuencia en hESCs y células líneas de cáncer, pero nunca en tejidos normales, lo que sugiere que la pérdida de metilación en los promotores de estos genes podría ser una influencia importante en la pérdida de pluripotencia durante el desarrollo. Su hipermetilación en el cáncer siempre debe ser considerada como aberrante. genes Clase B-II están frecuentemente hypermethylated en hESCs y las células cancerosas, pero, ya que a veces también se metilados en los tejidos normales, su hipermetilación en cáncer sólo se puede considerar aberrante en tipos de tumores en cuya normal de homólogos que son completamente no metilado. Aparte de esto, el hecho de que no todos los genes con frecuencia hypermethylated en el cáncer eran completamente no metilado en todos los tejidos normales analizados es un hallazgo muy importante en la epigenética del cáncer [26] debido a que la hipermetilación del promotor de un gen en un tipo de tumor particular no debe ser