Extracto
Antecedentes
formación de metástasis óseas son una consecuencia común e incapacitante de cáncer de próstata (CaP). El papel potencial de actividad de los osteoclastos en las metástasis óseas de CaP no se explica por completo. En este estudio, se investigó
ex vivo
si la actividad osteolítica está presente y cómo se resolvió en pacientes con metástasis de CaP formadoras de hueso.
Metodología
Cuarenta y seis pacientes afectada por CaP recién diagnosticado y controles sanos se inscribieron. Al momento del diagnóstico, 37 pacientes sólo tenía un tumor primario, mientras que el 9 tenían tumor primario y la metástasis formadoras de hueso concomitantes. En todos los pacientes que no había evidencia de metástasis a otros sitios no óseos. Para todos los pacientes y controles se recogieron muestras de sangre y orina. Se evaluó la homeostasis ósea de los pacientes; hicimos culturas periférica de células mononucleares (PBMC) para detectar
in vitro
osteoclastogénesis; que dosificamos expresión sérica de moléculas implicadas en el cáncer inducido osteoclatogenesis, como RANKL, OPG, TNF-alfa, DKK-1 y IL-7. Por PCR en tiempo real, cuantificamos DKK-1 e IL-7 la expresión de genes en tumores micro-disecados y secciones de tejidos sanos.
Principales Hallazgos
óseas metastásicas CaP pacientes mostraron alteración del metabolismo óseo con aumento de la resorción y formación ósea en comparación con los pacientes metastásicos no óseo y controles sanos. Los cultivos de PBMC CaP mostraron una osteoclastogénesis mejorado en pacientes con metástasis óseas, debido a un aumento de la relación de RANKL /OPG. Hemos detectado un aumento de DKK-1 y los niveles séricos de la expresión génica de tejidos en pacientes en comparación con los controles. IL-7 dio de alta en el suero de los pacientes, pero su expresión génica del tejido fue comparable en pacientes y controles.
Conclusiones
Hemos demostrado
ex vivo Windows que es un activo osteoclastogénesis mecanismo de anidación en el tumor óseo de la formación de cáncer metastásico y que el suero de DKK-1 en los niveles están aumentados en pacientes con NAC, lo que sugiere que investigue profundamente su papel como marcador tumoral
Visto:. Roato I, D'Amelio P, e Gorassini , Grimaldi A, Bonello L, Fiori C, et al. (2008) Los osteoclastos son activos en la formación de hueso metástasis de cáncer de próstata pacientes. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10.1371 /journal.pone.0003627
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2008; Aceptado: 15 octubre de 2008; Publicado: 3 Noviembre 2008
Derechos de Autor © 2008 Roato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Compañía de San Pablo y la Región Piamonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
próstata cáncer (CaP) es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres [1]. Una característica típica de la NAC es la capacidad de metastatizar en el hueso, ya que más del 80% de los hombres que murieron por CaP desarrolló metástasis óseas [2]. El crecimiento de la tapa dentro del hueso promueve principalmente lesiones osteoblásticas con zonas osteolíticas subyacentes [1]. En condiciones fisiológicas de los osteoclastos (OC) y la actividad de los osteoblastos está bien equilibrado, pero en condición patológica se interrumpe este equilibrio (homeostasis ósea). El papel de los anticonceptivos orales en metástasis osteolíticas se ha demostrado claramente, y se ha sugerido que las OC pueden jugar un papel importante en la metástasis osteoblásticas también. Las interacciones entre CaP células, los osteoblastos y los anticonceptivos orales sugieren que tropismo óseo podría ser causado por la dependencia de tumor en uno o más factores de osteoblastos /OC-derivado para el crecimiento de células de cáncer y mantenimiento [3].
previamente demostrado que los pacientes con metástasis óseas osteolíticas de tumores sólidos diferentes mostraron una mayor osteoclastogénesis espontánea, debido al aumento de la liberación de células T de factores pro-osteoclastogenic, como el TNF-alfa, IL-7 y RANKL [4]. El papel de eje /RANKL OPG en el componente de las metástasis óseas osteolíticas mediadas por CaP se ha dilucidado [5], mientras que el TNF-alfa y la IL-7 posibles funciones en lesiones óseas CaP siguen sin estar claros.
Otros factores clave en la biología del hueso son WNTs, una familia de pequeñas glicoproteínas secretadas, que inhibe la diferenciación OC [6], estimula la actividad osteoblastogénesis y mineralización de los osteoblastos [7]. La actividad de la familia WNT es antagonizado por varios factores secretados, tales como proteínas Dickkopf (DKK). Los datos recientes informaron de DKK-1 de expresión en algunas muestras humanas de tumores, lo que sugiere que una modulación del cáncer mediada por la actividad de WNT influye en el fenotipo metastásico [8], [9].
Esta investigación transversal se diseña para estudiar cómo formar metástasis ósea por CAP afecta el recambio óseo, la formación de OC por las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), y la producción de factores osteoclastogenic y anti-osteoclastogenic en pacientes afectados por el hueso CaP metastásico.
Se presenta un mayor osteoclastogénesis en pacientes con metástasis óseas CaP, debido a un aumento en la relación de suero RANKL /OPG, lo que sugiere que la formación de OC mejorado desempeña un papel activo en las metástasis formadoras de hueso. Se detectaron altos niveles en suero y la expresión génica de DKK-1 en pacientes con NAC en comparación con los controles sanos.
Resultados
El recambio óseo se incrementa en pacientes metastásicos óseos
Los marcadores de hueso facturación fueron mayores en pacientes con metástasis óseas en comparación con los pacientes metastásicos no óseo y controles sanos (Tabla 1). En detalle, los pacientes con NAC no mostraron diferencias significativas en la densidad ósea, pero tuvo mayor PTH, BAP, BGP, TRAPC5b y los niveles de reticulación que los controles sanos. Estos resultados confirman la alteración en la homeostasis ósea con aumento de la resorción y formación ósea en pacientes metastásicos.
osteoclastogénesis se incrementa en las metástasis óseas CaP
Para evaluar si el aumento de la resorción ósea en metastásico los pacientes se debe a un aumento en la formación de OC, se analizó la capacidad de los
in vitro
PBMCs de diferenciar de forma espontánea en los anticonceptivos orales en pacientes con o sin metástasis en los huesos y en los controles sanos.
la diferenciación OC se demostró por la presencia de células positivas /TRAP multinucleadas de paciente de cáncer y PBMCs de control sanos (Fig. 1A-C). Como se muestra en la Fig. 1D el número de AO fue significativamente mayor en pacientes con metástasis óseas (media ± SE, 216,22 ± 39,55) que en los pacientes sin metástasis óseas (112,71 ± 14,76) y en los controles sanos (73,55 ± 11,69),
p Hotel & lt ;. 0.001
TRAP se identificaron células multinucleadas positivas como los anticonceptivos orales y se contaron, en pacientes y controles sanos, culturas (a). El número OC en pacientes con metástasis óseas fue significativamente mayor que en pacientes con metástasis óseas no,
p Hotel & lt; 0,004 y en los controles sanos,
p
. & Lt; 0,001 (B)
relación RANKL /OPG se incrementa en pacientes metastásico
con el fin de investigar los factores responsables del aumento de la osteoclastogénesis en los pacientes, que cerró la los niveles séricos de TNF-alfa, RANKL y OPG. Los niveles séricos de TNF-alfa no fueron significativamente diferentes entre los tres grupos (datos no presentados), mientras que se observó un aumento significativo en relación RANKL /OPG en suero metastásica ósea (19,62 ± 6,52) en comparación con los pacientes no metastásicos (5,48 ± 2,48) y controles sanos (6,89 ± 2,6),
p
. & lt; 0,03
nivel de IL-7 en suero se incrementa en pacientes con cáncer
mide la IL-7 en los niveles séricos pacientes y controles. Séricos de IL-7 niveles fueron significativamente mayores en pacientes con metástasis óseas (media ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) que en los controles sanos (7,07 ± 1,27 pg /ml), p & lt; 0,001. Nos dosificamos niveles comparables de IL-7 en metastásico no óseo (19,75 ± 3,55 pg /ml) y los pacientes de hueso metastásico (19,86 ± 2,01 pg /ml), (Fig. 2A). Este resultado nos llevó a investigar si las células tumorales eran responsables del aumento de la producción de IL-7; Por lo tanto, hemos examinado la expresión cuantitativa de IL-7 en la tapa y en los tejidos de la próstata sana. Las células tumorales expresan niveles bajos y comparables de IL-7 en los pacientes y controles sanos (Fig. 2B). Esto sugiere que el aumento circulantes de IL-7 podría depender de la producción por la célula del sistema inmunitario, como los linfocitos T y B [4].
IL-7 niveles en suero en pacientes con /sin metástasis en los huesos y en controles sanos se midieron por ELISA. Metastásica ósea (
p Hotel & lt; 0,01) y pacientes con metástasis óseas (no
p Hotel & lt; 0,03) tuvieron significativamente más altos de IL-7 niveles en suero en comparación con los controles sanos (A). PAC y los tejidos sanos fueron analizados por PCR en tiempo real con el fin de cuantificar la IL-7 la expresión génica. La cuantificación de IL-7 se expresó como IL-7 en β-actina (el gen de control) número de copias del plásmido. El histograma mostró comparables IL-7 niveles de expresión en cáncer de próstata y tejidos sanos.
DKK-1 de expresión es mayor en los pacientes con NAC
Los datos bibliográficos informó que DKK-1 está implicado en el hueso homeostasis [8]. Nos dosificamos DKK-1 nivel en suero en pacientes con NAC y controles sanos. pacientes con NAC mostraron mayores niveles de DKK-1 que los controles sanos,
p Hotel & lt; 0,004 (Fig. 3A). Para evaluar si o no DKK-1 es producida por los tejidos de cáncer, se estudió su expresión en el casquillo y los tejidos sanos por RQ-PCR. Nuestros datos demuestran que el tejido CaP expresó significativamente más DKK-1 que el tejido sano, p & lt;. 0.001 (Fig. 3B)
DKK-1 en los niveles fueron dosificados en pacientes de suero con /sin metástasis en los huesos y en los controles sanos por ELISA. Metastásica ósea (
p Hotel & lt; 0,004) y pacientes con metástasis óseas (no
p Hotel & lt; 0,01) tuvieron significativamente más altos de DKK-1 los niveles en suero en comparación con los controles sanos (A). PAC y los tejidos sanos fueron analizados por PCR en tiempo real con el fin de cuantificar la expresión de DKK-1gene. La cuantificación de DKK-1 se expresó como DKK-1 en la β-actina (el gen de control) el número de copias del plásmido. El histograma mostraron mayores de DKK-1 los niveles de expresión en el casquillo de que en los tejidos sanos,
p
. & Lt; 0,001 (B) guía empresas
Discusión
El cáncer de próstata se desarrollan con frecuencia la formación de metástasis ósea; no obstante, una actividad osteolítica a paso ligero está presente en metastásico en comparación con los pacientes no metastásicos [10]. Los mecanismos mediante los cuales CaP promueve la remodelación ósea aberrante no están claramente definidos. La divulgación de anidación del tumor en el hueso podría proporcionar nuevas herramientas para el diagnóstico precoz de las metástasis óseas y proponer nuevos regímenes terapéuticos para el control de la progresión del CaP. El objetivo de nuestro estudio fue investigar cómo el componente osteolítica de metástasis ósea afecta el recambio óseo, la formación de OC por PBMC, y la producción de osteoclastogenic y anti-osteoclastogenic factores en los pacientes afectados por el hueso CaP metastásico.
En el la selección de los casos de CaP, decidimos evitar que los pacientes con una enfermedad metastásica avanzada, ya que los regímenes terapéuticos podrían representar un sesgo para nuestro análisis. En este estudio, tenemos un desequilibrio entre el hueso y no óseo número 'metastásicos pacientes, que depende de la presencia de una cantidad menor de metástasis ósea en comparación con los pacientes de CaP metastásico no óseo al diagnóstico [3]. De hecho, en la historia natural de la enfermedad, las metástasis óseas son un acontecimiento frecuente, pero tarde [11].
El recambio óseo fue mayor en pacientes con metástasis óseas, en particular, se observó un aumento tanto en la formación ósea y los marcadores de resorción. nivel de PTH se aumentó ligeramente en pacientes con metástasis ósea en comparación con los controles sanos, de acuerdo a la capacidad de PTH para promover el crecimiento y la invasividad de las células de cáncer de próstata en el hueso [12].
El aumento observado en la resorción ósea y la demostró previamente osteoclastogénesis espontánea en pacientes con cáncer con metástasis osteolíticas [13] nos llevó a investigar la osteoclastogénesis a partir de PBMC 'Cap pacientes
in vitro
. la formación de CO fue mayor en pacientes con metástasis óseas en comparación con los dos pacientes con metástasis óseas y no controles sanos. Para identificar los factores responsables del aumento de la formación de OC, que mide las moléculas involucradas en su mayoría osteoclastogénesis, como el TNF-alfa, RANKL, OPG, IL-7 y DKK-1. Los niveles séricos de TNF-alfa no aumentaron significativamente en los pacientes de CaP, a diferencia de otros tumores metastásicos de huesos, donde TNF-alpha juega un papel importante en la osteoclastogénesis [14]. De lo contrario la relación RANKL /OPG fue mayor en los pacientes con metástasis óseas, que explica el aumento de la osteoclastogénesis y de acuerdo con datos de la literatura anteriores [15].
La interacción entre las células tumorales, el sistema inmune y el tejido óseo se ha convertido en una objeto relevante de estudio intensivo. Dado que la IL-7 participación en la metástasis ósea se demostró anteriormente en otros tumores [4], [16], hemos investigado este problema mostrando un aumento en suero de IL-7 niveles en pacientes con NAC con y sin lesiones óseas. El aumento de IL-7 podría explicar la augment RANKL /OPG, ya que IL-7 estimula la producción de RANKL a partir de células T [17]. Se evaluó la IL-7 la expresión génica en cáncer de próstata y los tejidos normales de la próstata, que muestra la expresión comparables IL-7 en el cáncer de próstata y los tejidos normales. Este resultado difiere de nuestros datos publicados sobre el cáncer de pulmón, en el que el tejido tumoral expresa altos niveles de IL-7 en comparación con la contraparte normal [18]. Sugerimos que esta discrepancia puede deberse a la diferente tipo de tumor y el comportamiento metastásico de hueso, como el cáncer de pulmón hace metástasis osteolíticas, mientras CaP produce principalmente hueso que forma las lesiones. El nivel sérico IL-7 aumento puede depender de la activación del sistema inmune contra el tumor. De hecho, se ha demostrado previamente que las células T y B producen IL-7, en ambos tumores y otras patologías asociadas a la resorción ósea [4], [19], [20]. la señalización de Wnt desempeña un papel importante en el desarrollo óseo, ya que inhibe la diferenciación OC [6], estimula la actividad osteoblastogénesis y mineralización de los osteoblastos [7]. proteínas Wnt se expresan también por CAP y puede promover la invasión tumoral ósea [21]. DKK es un inhibidor soluble de la señalización de Wnt canónica [22]. Un estudio reciente asocia DKK-1 de expresión en el cáncer de mama con la presencia de metástasis óseas [23]. Los datos con respecto DKK-1 de expresión en cáncer de próstata son escasos: algunos autores informan de un aumento de DKK-1 de expresión en las lesiones osteolíticas, pero no en los tumores primarios [8]. Salón
et al
informó que derivado de CaP DKK-1 está implicado en la actividad osteoblástica en las metástasis óseas, ya que DKK-1 de señalización podría dar cuenta de la conmutación de la respuesta del hueso a las células de CaP osteolítica a osteoblástica y viceversa [24 ]. En este trabajo se estudiaron sólo los pacientes con metástasis óseas que forman, por lo tanto, no somos capaces de correlacionar la actividad osteolítica inducida por las células de CaP y DKK-1 de expresión, tal como [8] se describe anteriormente. Sin embargo, nos encontramos con una gran cantidad de DKK-1 en muestras serológicas de pacientes con cáncer y un expresión génica de DKK-1 mejorado en los tejidos de la borda, lo que sugiere que los niveles de DKK-1 aumento en suero en pacientes con NAC podría depender de la secreción de células de CaP. Este resultado será profundamente estudiar con el fin de evaluar el papel potencial de DKK-1 como marcador tumoral en cáncer de próstata. Por otra parte, se podría especular que las células de CaP estimulan entorno de la médula ósea para aumentar la liberación DKK-1 a través de mecanismos desconocidos. En nuestros pacientes metastásicos de huesos, los niveles séricos DKK-1 ligeramente se aumentaron en comparación con los pacientes no metastásicos, sin una diferencia estadísticamente significativa. Esto podría depender de nuestro escaso número de pacientes, pero la investigación de un gran número de pacientes, podemos esperar para mostrar una diferencia entre los dos grupos, lo que confirma los datos de la literatura [23].
Materiales y Métodos
los pacientes y los marcadores de recambio óseo
el proyecto experimental y todos los estudios realizados sobre los pacientes fueron aprobados por el Comité de ética de nuestra institución (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Juan Bautista en Turín) y el consentimiento informado por escrito de se obtuvieron los pacientes y controles sanos. La población estudiada incluyó a 46 pacientes afectados por recién diagnosticado de cabeza (37 sólo tenía un tumor primario, mientras que el 9 tenían tumor primario y la metástasis formadoras de hueso concomitantes) y 20 hombres sanos. En todos los pacientes que no había evidencia de metástasis a otros sitios no óseos. Se ha demostrado que la pérdida de estrógenos afecta significativamente a la formación de osteoclastos [25]. Por lo tanto hemos estudiado gorra que, al ser un único tumor varón, evita por defecto todas las posibles sesgos debido a las variaciones cíclicas de estrógeno después de la menopausia y la caída en los niveles de estrógeno en las mujeres. Los pacientes y los controles fueron agrupados por edad e índice de masa corporal. La densidad mineral ósea (DMO) se midió por doble emisión de absorciometría de rayos X con un Hologic QDR 4500 en la columna lumbar y el cuello femoral tanto en pacientes y controles. Se excluyeron los sujetos con enfermedades de malabsorción intestinal, otro tipo de estado nutricional deficiente, osteoporosis secundaria o tomar fármacos activos sobre el recambio óseo o la terapia contra el cáncer. La presencia de metástasis óseas se confirmó mediante gammagrafía ósea
99 Tc y otros estudios de imágenes de acuerdo con la práctica clínica habitual.
Con el fin de investigar el estado de metabolismo óseo, los pacientes y los controles fueron sometidos a un análisis de los marcadores clínicos estándar del metabolismo óseo, tales como la PTH en suero, la fosfatasa alcalina ósea (BAP), calcio, fosfato, osteocalcina (BGP) y deoxipiridinolina urinaria (reticulaciones urinario) [26]. En particular, se entrecruza la dosis ha sido elegido en la práctica clínica para controlar la enfermedad metastásica ósea y la respuesta a los tratamientos anti-resorción tales como los bifosfonatos [27], [28]. Como marcadores de resorción ósea también medimos tartrato resistente de la fosfatasa ácida 5b (TRAP5b) en el suero [29], mediante el kit ELISA BoneTrap (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, FIN). marcadores serológicos, tales como PSA y la clasificación histológica, según Gleason, se registraron para todos los pacientes incluidos en este estudio [30], [31]. Todas las mediciones bioquímicas se realizaron en una sola muestra de sangre o de orina en un solo punto de tiempo por sujeto.
Los cultivos de células
Tal como se describe anteriormente [13], para todos los pacientes y controles sanos, PBMCs se aislado de la sangre periférica y se cultivaron en α-MEM, suplementado con 10% FBS, penicilina 100 U /ml y estreptomicina 100 mg /m (Cambrex, Bio Science, Walkersville, MD), sin la adición de factores estimulantes exógenos tales como m-CSF y RANKL. Después de 15 días se detuvo, las culturas, los anticonceptivos orales maduras se identificaron como células multinucleadas que contienen tres o más núcleos y positiva para la expresión de TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
Las citoquinas dosis
con el fin de evaluar los factores que intervienen en la osteoclastogénesis la cantidad de RANKL sérico total (libre y OPG-bound), OPG, TNF-alfa, IL-7 y DKK-1 se determinaron por ELISA kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron por duplicado y los datos se expresaron como valores medios. Las sensibilidades fueron: 1,56 a 30000 pg /ml para RANKL totales (Apotech Corporation, Epalinges, CH); 0 a 4.000 pg /ml para OPG; 0,12 a 32 pg /ml para TNF-alfa; 0,1 a 16 pg /ml para IL-7 (amp; R y del sistema D, Abingdon, Reino Unido) y 0,38 a 50 pmol /L de DKK-1 (Biomedica, Wien, A)
extracción de RNA a partir de formalina. , incluidas en parafina (FFPE tejidos) PAC está fijado
Se extrajeron ARN a partir de FFPE PAC y tejidos sanos. Para 19 pacientes, se obtuvieron muestras de los bloques de tejido sanas y tumor, se seleccionaron las áreas tumorales en las secciones de hematoxilina /eosina por microscopio y disecados manualmente. Se aisló ARN de bloque de tejido FFPE CaP (10 micras secciones) usando el kit de aislamiento de RecoverAll total de ácidos nucleicos (Ambion, Huntingdon, Reino Unido). 1 g de ARN se convirtió hasta ADNc monocatenario por la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido).
Generación de la norma plásmido paciente
cebadores de PCR para IL -7, DKK-1 y β-actina fueron diseñados utilizando el software Primer Express v2.0 y sintetizados por Applied Biosystems (Warrington, UK). La secuencias de ß-actina IL-7 y se publicaron anteriormente [18], mientras que las secuencias de DKK-1 fueron: sentido 5'-GGAAGCGCCGAAAACG-3 'y antisentido 5'-ACACACATATTCCATTTTTGCAGTA-3'. Purificada productos PCR frescas de 80 pb para la IL-7, 75-bp para DKK-1 y 78 pb para β-actina se clonaron directamente usando TA Cloning Kit Dual Promoter (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se describe anteriormente [18] . Los clones positivos se secuenciaron para confirmar su identidad. 10 g del plásmido seleccionado para los genes fueron digeridos con la enzima de restricción 8 U de HindIII durante la noche a 37 ° C. plásmidos linealizados fueron finalmente purificadas con NucleoSpin limpiar kit de extracción (Macherey-Nagel, Düren, D), se resuspendió con 1 x TE y DO
260 fue determinada. El número de copias se calculó a partir de la concentración de plásmido, peso molecular medio de los nucleótidos (660 g /mol) y el plásmido además insertar longitud.
Real-Time El análisis cuantitativo de la IL-7 y DKK-1 la expresión génica
Teniendo en cuenta la mayor cantidad de suero IL-7 y DKK-1 en pacientes CaP con y sin metástasis óseas, decidimos investigar si estos factores son producidos por las células tumorales. Se realizó el análisis cuantitativo de IL-7 y DKK-1 de expresión de Real-Time PCR cuantitativa (RQ-PCR), β-actina fue el control de limpieza. análisis de RQ-PCR de IL-7 y DKK-1 se llevó a cabo utilizando el sistema de iCycler iQ ™ (Bio Rad, Hercules, CA, EE.UU.). sondas TaqMan fueron diseñados utilizando el software Primer Express v2.0 y sintetizados por Applied Biosystems (Warrington, UK). sondas TaqMan específica de IL-7 y β-actina se utilizaron anteriormente [18], mientras que la sonda de DKK-1 era (5'-ATGCGTCACGCTATGTGCTGCC-3 '). Todas las sondas se marcaron en el extremo 5 'con 6-carboxi fluoresceína (FAM) y el extremo 3' con 6-carboxi-tetrametil rodamina (TAMRA). Reacciones para IL-7, DKK-1 y cuantificación β-actina se realizaron en un volumen final l 25 con 2 l de cDNA de la muestra, 1 × iQ Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, EE.UU.), 0,3 mM de cada cebador y 0,4 M de las sondas. Los cebadores de PCR fueron los mismos utilizados para IL-7, DKK-1 y la clonación β-actina. Las condiciones de amplificación para la cuantificación fueron: 95 ° C durante 15 minutos, 50 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos, 58 ° C para la IL-7, 60 ° C para DKK-1 y β-actina de 1 minuto
.
los análisis estadísticos
los análisis estadísticos se realizaron mediante el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSSX /pc) de software 15.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Las variables continuas se expresan como media y desviación estándar. Con el fin de comparar los pacientes con y sin metástasis en los huesos y los controles, se realizó un análisis de una forma de varianza (ANOVA). corrección de Bonferroni se llevó a cabo para comparaciones múltiples. Para explorar el efecto de las variables continuas analizadas en la formación de OC, hemos montado un modelo de regresión lineal por el procedimiento de manera paso. La expresión génica de DKK-1 y IL-7 se comparó entre tumor y el tejido sano por la prueba T de Student pareada. Los resultados fueron considerados estadísticamente significativos para
p Hotel & lt;.. 0.05
Reconocimientos
Agradecemos a Raffaele Troiano para la asistencia técnica