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PLOS ONE: MALDI Imaging espectrometría de masas para In Situ El análisis proteómico de preneoplásicas lesiones en el páncreas Cancer


Extracto

La identificación de nuevos biomarcadores de lesiones preneoplásicas pancreáticos (PanINs, IPMNs) y principios de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es crucial debido a la alta tasa de mortalidad de las enfermedades después de la detección tardía. Para hacer frente a esta tarea se utilizó la técnica novedosa de la matriz con ayuda de desorción /ionización por láser (MALDI) formar imágenes espectrometría de masas (IMS) en modelos de ratones genéticamente modificados (GEM) de cáncer de páncreas. Varios GEM se analizaron con MALDI IMS para investigar el patrón de péptido /proteína-expresión de lesiones precursoras en comparación con el páncreas normal y PDAC con la resolución celular. El análisis estadístico reveló varios tejidos normales y enfermos discriminativo
m /z
-especies el medio. neoplasia intraepitelial (PanIN) y neoplasia mucinosa papilar intraductal (TPMI) podían distinguirse de tejido pancreático normal y en un 26 PDAC significativa
m /z
-especies. Entre éstos
m /z
-especies, identificamos La albúmina y la timosina beta-4 por cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS /MS), que fueron validados por inmunohistoquímica, western blot, RT cuantitativa PCR y ELISA en ambos murino y el tejido humano. Se encontró timosina beta-4 aumentó significativamente en los sueros de ratones con lesiones PanIN. expresión PanIN upregulated de albúmina fue acompañado por aumento de la expresión de genes de hígado restringida que sugieren un programa de transdiferenciación hepática de las células preneoplásicas. En conclusión se muestra que GEM de endógeno PDAC son un sistema modelo adecuado para MALDI-IMS y posterior análisis de LC-MS /MS, lo que permite
in situ
análisis de lesiones precursoras pequeñas y la identificación de péptidos y proteínas expresadas diferencialmente.

Visto: Grüner BM, Hahne H, Mazur PK, Trajkovic-Arsic M, S Maier, Esposito I, et al. (2012) MALDI Imaging espectrometría de masas para
In Situ
Análisis proteómico de preneoplásicas lesiones en el cáncer pancreático. PLoS ONE 7 (6): e39424. doi: 10.1371 /journal.pone.0039424

Editor: Frank T. Kolligs, Universidad de Munich, Alemania |
Recibido: Enero 15, 2012; Aceptado: 20-may de 2012; Publicado: 26 Junio ​​2012

Derechos de Autor © 2012 Grüner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación alemana de Investigación (SFB824-C4), el Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (BMBF;#01GS08115) y la Asociación de Investigación del cáncer (AICR;#07-0543); todos a JTS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo occidental [1]. Debido a la etapa avanzada al momento del diagnóstico y la alta resistencia intrínseca a la terapia, la incidencia de PDAC se corresponde con su mortalidad, con una supervivencia media de menos de 6 meses y una tasa global de supervivencia a 5 años por debajo del 5% [2]. Identificación de proteínas expresadas en las lesiones preneoplásicas pueden ayudar a identificar la enfermedad en un estado pre-invasiva, un objetivo clínicamente muy relevante como la resección sigue siendo el único enfoque curativo a menudo frustrado por la metástasis no detectada temprano o enfermedad localmente avanzada [2].

Clínica y los estudios histopatológicos han identificado tres lesiones precursoras PDAC: neoplasia intraepitelial pancreáticos (PanIN), neoplasia intraductal papilar mucinoso (TPMI) y neoplasia quística mucinosa (MCN). Los precursores de lejos más común se PanIN lesiones, aunque debido a la mejora de las técnicas de imagen neoplasias quísticas tales como IPMNs y, en menor medida, MCN son diagnosticados cada vez [3], [4]. La identificación y clasificación de PanINs como precursores de [5] PDAC ha permitido el desarrollo de un modelo de progresión morfológica y genética (visión general en [3]). Estos avances han contribuido al desarrollo de sofisticados
Cre /lox
-basado ratones modificados genéticamente (GEM) para endógena PDAC [6]. Un modelo de ratón bien establecida recapitulando las etapas moleculares y morfológicas del desarrollo humano es el PDAC
Kras
G12D
modelo, en el que oncogénico
Kras
G12D
está activado en la endógeno
Kras
locus. Los ratones desarrollan localmente PDAC invasivo y metastásico a través de lesiones PanIN definidos progresando de PanIN1 a PanIN3 [7]. la activación adicional de la señalización del EGFR da lugar a un desarrollo acelerado de PDAC a través de lesiones PanIN y TPMI, se amplía el espectro de modelos de ratón PDAC clínicamente relevantes [8]. Debido a los antecedentes genéticos definida y la evolución en el tiempo de forma experimental direccionable del desarrollo de lesiones preneoplásicas y la progresión a PDAC, la hipótesis de estos modelos para ser herramientas valiosas de estudio para el establecimiento de un enfoque de identificación de biomarcadores detección temprana preclínica.

láser asistida por matriz desorción /ionización (MALDI) obtener imágenes espectrometría de masas (IMS) ha evolucionado como una técnica novedosa y prometedora herramienta para el descubrimiento de biomarcadores y oncología traslacional [9]. Los ejemplos incluyen Parkinson [10] y [11] de la enfermedad de Alzheimer, así como varios tipos de cáncer incluyendo gliomas [12], [13], [14], [15], de ovario [16], de próstata [17], de mama [18] y cáncer de colon [19]. Al proporcionar un molecular
ex vivo
vista del tejido resecado, el seguimiento etiqueta libre de compuestos endógenos con resolución espacial y la especificidad molecular está activado (visión general en [9], [20]).

en este estudio, hemos aplicado MALDI-IMS para examinar la viabilidad de esta técnica para la identificación de potenciales nuevos biomarcadores en las lesiones PanIN. Nos caracteriza picos de dos PanIN-específicos, los cuales fueron identificados como ALB1 y TMSB4X. Nos fundamentar aún más la expresión ALB1 como parte de un programa de transdiferenciación hepática de lesiones precursoras y aportar pruebas para el aumento de los niveles séricos de TMSB4X en ratones con lesiones PanIN.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

el estudio fue aprobado por el comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad técnica de Munich. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes antes de la inclusión en el estudio.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Leyes Federal Alemana de Protección de los Animales y aprobados por el Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Técnica de Munich .

Mouse cepas


Kras
+ /LSL-G12D, Ptf1a
+ /Cre, Ela-Tgfa
y
Trp53
+ /LSL-R172H
cepas se han descrito anteriormente [7], [8], [21], [22], [23]. Los ratones se cruzaron entre sí para obtener las líneas de ratón
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa; Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
y
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa; Trp53
+ /LSL- R172H Opiniones y se backcrossed a fondo C57BL /6J durante al menos cuatro generaciones. C57BL /6J sirvió como control.

muestras humanas

Las muestras de suero se obtuvieron de 57 sujetos con un diagnóstico histológico de adenocarcinoma demostrado ductal pancreático (21 mujeres, 26 hombres, edad media 67,1 años) . se recogió sangre entera antes de la cirugía. muestras de suero de control se tomaron a partir de 10 sujetos sanos (2 mujeres, 8 hombres, edad media 66,2 años) y de 12 pacientes con pancreatitis crónica (3 mujeres, 9 hombres, edad media 55,8 años).

MALDI-IMS en secciones de tejido de ratón páncreas

Para los páncreas MALDI-IMS fueron resecados y se congelaron en nitrógeno líquido sin ningún tratamiento previo. 10 micras criosecciones se cortaron y se transfirieron a portaobjetos de indio-estaño (ITO) de vidrio revestida tratadas previamente con poli-lisina 1:01 en agua con 0,1% de NP-40. Las secciones fueron fijadas en 70% de etanol y 100% de etanol durante un minuto. Matrix (10 g /l de ácido sinapínico en acetonitrilo al 60% y ácido trifluoroacético al 0,2%) se depositó uniformemente en la diapositiva utilizando el dispositivo ImagePrep (Bruker Daltonics). Los espectros de masas se midieron usando el MALDI TOF /TOF Analizador Ultraflex III (Bruker Daltonics) con una resolución espacial de 70 micras de modo lineal. Se detectaron iones en un rango de masas de
m /z
2.500 a 25.000 con una tasa de muestreo de 0,1 GS /s. Se empleó un patrón de proteína ya preparado (Bruker Daltonics) para la calibración de los espectros, que fue hecho externamente sobre el mismo objetivo antes de cada medición. Después de la medición de los portaobjetos se lavaron en 70% de etanol para eliminar la matriz y de contraste con hematoxilina /eosina (H & amp; E). Imágenes de alta resolución de las secciones teñidas se tomaron usando el sistema de Mirax Scan (Carl Zeiss) y co-registradas con los datos de MALDI-IMS para correlacionar los espectros de masas con las características histológicas de la misma sección.

Análisis estadístico de se obtuvieron datos de MALDI-IMS

los datos de MALDI-IMS y analizados mediante el FlexControl 3.0, 3.0 y FlexImaging el software 2.2 ClinProTools (Bruker). Con las regiones de software FlexImaging de interés (ROI) se define de acuerdo a la morfología (PanIN, TPMI, PDAC, WT) y 40 elegido al azar espectros única por ratón por retorno de la inversión del grupo fueron exportados a ClinProTools para su posterior análisis. lesiones respectivos fueron clasificados por un patólogo experto de páncreas (ES DECIR). Los espectros de masas extraídos fueron recalibrados en los picos comunes "de fondo" (alineación) y espectral normalizada en su recuento total de iones. En todos los análisis, los espectros de dos grupos de regiones de interés fueron comparados y
p valores
se calcularon con la prueba de Wilcoxon de suma de rangos combinado para dos no paramétrico, ordinal muestras independientes y Benjamini-Hochberg corregido.
P
valora ≤0.05 se consideraron significativos.

Para la validación de los picos discriminantes se realizó el análisis de Importancia prueba de microarrays (SAM) y cuenta con una tasa de falso descubrimiento de menos de 0.001 se consideraron significativos. El umbral de discriminación óptima se determinó mediante análisis de Receiver Operating Characteristics (ROC). La validación se realizó con un conjunto independiente de muestras (Fisher t-test exacto,
p Hotel & lt; 0,001).

Péptidos y la identificación de proteínas mediante Cromatografía Líquida y Espectrometría de masas en tándem (LC-MS /MS) guía
Los péptidos y proteínas se extrajeron directamente del ácido sinapínico preparó secciones de tejido. Para la extracción, se aplicó 1 l de 30% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% sobre la rebanada, retirados y ya sea mezclado con un volumen igual de solución de ácido α-ciano-4-hidroxi-cinámico (10 mg /ml en 30% de acetonitrilo , 0,1% de ácido trifluoroacético) en una diana de MALDI de acero inoxidable para la medición inicial MALDI MS o diluido en 10 l de ácido fórmico al 0,1% para las mediciones posteriores LC-MS /MS.

para obtener información precisa
m /z
valores para el
m /z
especies de interés, extractos de la matriz de secciones adyacentes de páncreas de ratón con una alta intensidad de la especie de m /z se analizaron mediante el modo de ion positivo reflector MALDI MS. Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas MALDI-TOF ultrafleXtreme /TOF equipado con un 1 kHz láser Smartbeam-II (Bruker Daltonics). Cada espectro se calibró externamente usando el péptido de calibración estándar II (Bruker Daltonics) y el "mejorado cúbico" función de calibración, típicamente produciendo exactitud de masa. & Lt; 20 ppm

se realizaron LC-MS /MS análisis de extractos de matriz en un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) acoplado a un nano-HPLC (nanoLC Ultra, Eksigent Technologies). Los péptidos se separaron en un auto lleno de 75 micras x 40 cm de columna de fase inversa (Reprosil, Dr. Maisch) con un gradiente lineal 25 min (2-35% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%, velocidad de flujo 300 nl /min). masas intacta de péptidos que eluyen se determinaron a 30.000 resolución y se seleccionaron los tres picos más intensos para una mayor fragmentación por disociación inducida por colisión (CID) y la adquisición de los espectros de fragmento con baja resolución (1000). iones con una sola carga, así como iones con estado de carga desconocida fueron rechazadas. dinámica de exclusión fue habilitado y la duración dinámica de exclusión se establece en 10 segundos. archivos de lista de picos se generaron utilizando la mascota Distiller versión 2.2.1.0 (Matrix Science) y búsquedas en las bases se realizaron utilizando el motor de búsqueda de la mascota de la versión 2.2.04 (Matrix Science) contra la base de datos del ratón IPI (versión 3.26). Buscar archivos de resultados se importaron en Andamios (Proteoma Software).

inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

La inmunofluorescencia o inmunohistoquímica se realizaron de acuerdo con protocolos estándar. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ALB1 (Santa Cruz Biotechnology, y Thermo Fisher Scientific), HepPar1 (DAKO), TMSB4X [24], [25] (Immundiagnostics, Bensheim) y CK19 (TROMA-III; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma)

RT-PCR cuantitativa

real-Time PCR se realizó como se describe previsouly [8]. La ciclofilina se utilizó para la normalización.

valores de p se calcularon con la prueba de Wilcoxon. Se utilizaron los siguientes cebadores:

Cyclophillin-F /-R ATGGTCAACCCCACCGTGT /TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC

Tmsb4x-F /-R CCTCTGCCTTCAAAAGAAACA /GGGCAGCACAGTCATTTAAAC

Alb1-F /-R TTGGTCTCATCTGTCCGTCA /GGCAGCACTCCTTGTTGACT

La transferrina-F /-R ATCAAGGCCATTTCTGCAAGT /GGTTCAGCTGGAAGTCTGTTCC

alfafetoproteína-F /-R GGAGGCTATGCATCACCAGT /CATGGTCTGTAGGGCTTTGC

La apolipoproteína A4-F /-R AGAGCCTGAGGGAGAAGGTC /AGGTGTCTGCTGCTGTGATG

ELISA -Enzyme ensayo de inmunoabsorción ligado

El kit ELISA para la determinación cuantitativa de las concentraciones en suero TMSB4X se obtuvo de Immundiagnostics (Bensheim). ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

Western Blot

análisis Western Blot se realizó de acuerdo con protocolos clásicos con los anticuerpos contra ALB1 (Santa Cruz Biotechnology) y HSP90 (Señalización Celular).

Resultados

MALDI-IMS en preneoplásicas lesiones y PDAC de modelos GEM

para identificar nuevos biomarcadores para las dos lesiones preneoplásicas pancreáticas más comunes, y PanIN TPMI hemos resecado páncreas de establecida GEM de PDAC: 13
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
, 8
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGF? Opiniones y 5
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-Tgfa; Trp53
+ /LSL-R172H
ratones personas de distintas edades (3 a 18 meses, dependiendo del genotipo). Estos ratones desarrollan lesiones PanIN y IPMN progresar a PDAC invasivo y metastásico con diferente inicio y la agresividad [7], [8], [23]. Cuatro ratones C57BL /6J sirvieron como control de tipo salvaje. Todos los páncreas se midieron en un Ultraflex III MALDI TOF /TOF Analizador con una resolución espacial de 70 m. El flujo de trabajo MALDI-IMS se representa en la Figura 1A. Para probar la precisión del método que primero re-visualizado el ion molecular ya conocido de la insulina [M + H
+] en 5808 en los páncreas de ratones de tipo salvaje. La señal de la insulina, que se da como un mapa de calor ilustración (donde el azul significa más bajo y el rojo más alta intensidad relativa), bien co-localizada con los islotes de Langerhans (Figura 1B), lo que demuestra la correlación correcta de medida
m /z
-especies a características morfológicas con MALDI-IMS.

(a) Descripción general del flujo de trabajo MALDI-IMS. (B) Re-visualización del ion molecular de la insulina [M + H
+] en 5808 (barra roja) en el espectro promedio de una sección de páncreas de un ratón C57BL /6 medido en MALDI-IMS. La intensidad de la señal medida es un código de colores, donde el color rojo significa mayor intensidad en la posición con respecto a la sección. El pico de insulina co-localiza con los islotes pancreáticos (amplificados en extracto). (C) Definición de regiones de interés en H & amp; E secciones después de la medición MALDI-IMS manchado. Panel superior: H & amp; E manchadas secciones de un
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D gratis (
CK
) y un
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Tgfa gratis (
CKT
) del ratón. líneas Círculo negro tejido exocrino, líneas verdes PanIN1, líneas amarillas PanIN2, líneas naranjas PanIN3, líneas azules TPMI y líneas rojas PDAC diagnostica regiones en la sección respectiva. La barra de escala representa 1 cm. Panel inferior: ejemplos de las diferentes regiones de interés morfológicas como se indica a continuación. Las barras de escala representan 50 micras.

Para comparar los espectros de diferentes áreas morfológicas, las regiones de interés (ROI) para PanIN, TPMI, PDAC, y el tejido exocrino normal fueron definidas por un experto en la patología pancreática en el páncreas usando el software FlexImaging y se utilizaron para la comparación de los espectros de las regiones respectivas de la misma sección, así como de otras secciones entre sí. Figura 1C da ejemplos de la definición de las regiones en las secciones medidas (panel superior Figura 1C) y las características morfológicas distintas (Figura 1C, panel inferior). La única espectros de estas regiones de interés fueron exportados a un software de análisis ClinProTools. Como primera experimento de control se compararon los espectros de tejido normal pancreático (acinos y conductos) de ratones de tipo salvaje (WT) con fenotípicamente normales que aparecen acinar y tejido ductal de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
ratones que albergaban el oncogénico
Kras
G12D
mutación. No hubo diferencias en los espectros entre estos dos grupos fueron detectables, por lo tanto, asegurar que no hay variaciones detectables en los espectros de WT y GEM (Tabla 1). Para un análisis más detallado, los ROI fenotípicamente normales de ambos genotipos fueron clasificados como "normal"

A continuación analizaron los espectros del tejido normal de C57BL /6J y
Ptf1a
+ /Cre;. Kras
+ /G12D
ratones (n = 11) en contra de los espectros de las lesiones preneoplásicas de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
y
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGF?
ratones (PanINs y IPMNs, n = 24). Estos dos grupos se distinguían por 76 picos estadísticamente significativas (prueba de Wilcoxon de suma de rangos,
p
valora Benjamini-Hochberg corregida) de los cuales 26 eran de la lesión específica (es decir, específico para IPMNs y PanINs) y 50 normal- específicas con
valores de p
entre 0.000001 y 0,05. Para PanINs encontramos 25 (
p = 0,000001
a
p = 0,05
) y para IPMNs 18 (
p = 0,03
a
p = 0,05
) específica
m /z
-especies, respectivamente, lo que podría discriminarlos del tejido normal. También, IPMNs y PanINs podrían ser discriminados unos de otros por 6 picos PanIN-específicos (
p
= 0,02 a
p
= 0,05, n = 19 vs. 13 ratones). Al comparar las lesiones preneoplásicas con PDAC (n = 24 frente a 10 ratones) se detectaron 57 lesiones específicas y las masas 11 PDAC-específicos (
p = 0.00169
a
p = 0,038
). La Tabla 1 proporciona una visión general de todos los grupos de comparación, el número de discriminar
m /z
-especies, los correspondientes
p
valores y el número de animales utilizados. Tabla S1 proporcionar información detallada de todos identificados significativamente
m /z
-especies de las comparaciones más importantes.


m /z
-especies 2790, 2812 y 2829 son específicamente encontrados en PanIN lesiones

Un examen más detallado de los picos PanIN específicos reveló que los PanINs
m /z
-especies 2790, 2812 y 2829 estaban discriminando a partir de tejido normal (Figura 2A). La superposición de los espectros promedio de PanINs y tejido pancreático normal de reveló que en el último los picos eran casi no detectable (Figura 2A). Un examen más detallado de estos picos estadística (prueba de Wilcoxon, la corrección de Bonferroni) reveló
P
valores por debajo de 0,00001. El Diagrama de caja de distribución y el Principio Análisis de componentes (PCA) de PanINs y el tejido exocrino representados clara discriminación entre los dos grupos (Figura 2 B + C).

(A) Superposición de un extracto de los espectros de media desde el retorno de la inversión -Grupo "PanIN" (azul) y el retorno de la inversión del grupo "WT" (rosa). La propagación de las intensidades de los espectros individuales se indica en los bares; a.u. (unidades arbitrarias). (B) Dot Trama de la intensidad de la distribución de la
m /z
-especies 2829 en PanINs (azul) y WT (rosa) de cada solo espectro. (C) PCA basado en la diferenciación de la exocrina (rosa) y el tejido (azul) PanIN. (D) Vuelva a la visualización de picos significativos. El
m /z 2829
-especies claramente re-visualiza en lesiones PanIN (panel superior, ampliada en el extracto), mientras que el pico a 6645 es específica para el compartimento exocrina del páncreas (panel inferior, ampliada a la derecha lado). A continuación se muestra el espectro medio de la sección de medida.

A continuación visualizamos
m /z
2829 en las secciones de tejido que demuestran la especificidad de este pico para las regiones PanIN en el mapa de calor ilustración ( la Figura 2D, panel superior), mientras que un pico a
m /z
6645, que era único para el tejido normal específicamente re-visualizado en regiones de tejido pancreático morfológicamente normal (Figura 2D, panel inferior).

Validación de los picos significativos discriminantes en una muestra independiente conjunto

Para validar el significado de
m /z
especies de 2790 y 2829 en un conjunto de muestras independientes, se realizó un receptor Características de funcionamiento (ROC ) análisis con estos picos para determinar los umbrales que discriminan óptimos. Con estos umbrales era posible distinguir el tejido del páncreas de ratón independiente 10 (4
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
y 6 hermanos de camada de tipo salvaje a una edad de 6 meses) con una precisión del 100% (prueba de Fisher,
p Hotel & lt; 0,001).

identificación de proteínas de las tres especies más significativo por LC-MS /MS

Para la identificación de proteínas de discriminar-PanIN determinado significativo
m /z
especies, los péptidos se extrajeron directamente de diapositivas MALDI-IMS y en un principio se analizaron por MALDI MS modo de reflector para obtener masas precisas (& lt; 20 ppm) para las especies MALDI IMS antes LC-MS análisis /MS. Secuencia de búsqueda de base de datos de los resultados de LC-MS /MS utilizando el motor de búsqueda de la mascota permitió la identificación de tres muy importantes
m /z
especies que apuntan a dos proteínas diferentes. El
m /z 2790
especie fue identificada como un péptido que representa el extremo amino-terminal de la forma madura de la albúmina sérica (ALB1), mientras tanto, el
m /z
2812 y el
m /z
2829 especies representadas dos péptidos diferentes que pertenecen a la carboxi-terminal de la timosina beta-4 (TMSB4X). La identificación de TMSB4X fue apoyado además por la identificación de un período adicional de cuatro diferentes péptidos de la región carboxi-terminal de la proteína. Las identificaciones de péptidos verificadas manualmente de ALB1 y TMSB4X y la correspondiente espectros MS /MS se enumeran en la Tabla 2 y disponible en el material complementario (Figura S1).

Más cerca de Investigación y Validación de los candidatos identificados

Para investigar si ALB1 y TMSB4X también están presentes en el nivel transcripcional en los páncreas tumorigénico, aislamos ARN total a partir de páncreas 8
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Opiniones y 6 camada de tipo salvaje en edades mixtas entre 4,5 y 9 meses y realizó el análisis de RT-PCR cuantitativa para estos dos candidatos. La expresión de ambas transcripciones se reguló de manera significativa en
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hoteles en comparación con ratones de tipo salvaje (
p
≤0.05, la figura 3B y . 4A)

(A) El análisis inmunohistoquímico de ALB1 muestra la tinción específica de las lesiones PanIN de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D gratis (
CK
) ratones pero no células ductales (n = 10 ratones). La tinción de inmunofluorescencia para ALB1 y el marcador ductal CK19 demuestra co-localización de las dos proteínas. Todas las barras de escala representan 50 micras. (B) ARNm de
Alb1
y de los genes hepáticos
alfa-fetoproteína (AFP)
,
La apolipoproteína A4 (ApoA4)
y
transferrina (TFN)
son todos upregulated significativamente en páncreas de
CK
ratones en comparación con el control de tipo salvaje (
p = 0,04
para
Alb1
,
p = 0,008

Afp
,
p = 0,04
para
ApoA4
,
p = 0,004
para
Tfn
, n = 7 vs. 5 ratones). Los niveles de expresión se normalizan para muestras de ratones de tipo salvaje. Todas las barras de error indican las desviaciones estándar normalizaron a la media de la de tipo salvaje. (C) de Western Blot para ALB1 en lisados ​​de páncreas enteros de tipo salvaje y
CK
ratones (n = 3). expresión en el tejido ALB1 preneoplásicas se incrementa fuertemente en comparación con el páncreas normal. (D) El análisis inmunohistoquímico del marcador hepática HepPar1 en una lesión PanIN3 humana

(A) TMSB4X mRNA se incrementó significativamente en
Ptf1a
+ /Cre;. Kras
+ /G12D (CK)
ratones en comparación con el control de tipo salvaje (
p = 0,01
, n = 8 contra 6 ratones). Los niveles de expresión se normalizaron con el tipo salvaje. Las barras de error indican las desviaciones estándar normalizaron a la media de la de tipo salvaje. (B) tinción para TMSB4X en muestras de tejido 10 a 30 semanas de edad
ratones CK
(n = 10) muestra la expresión en PanINs (punta de flecha) pero no células en acinar (asterisco) (i). Alto grado de mPanIN3 expresar TMSB4X (ii). Expresión en PanIN3 humana (iii) y PDAC humana (iv) también es detectable. Las barras de escala representan 50 micras. (C) ELISA para TMSB4X de muestras de suero de tipo salvaje y
ratones CK
(n = 7 vs. 14 ratones). La concentración sérica de TMSB4X es aumentada significativamente en
CK
ratones (
p = 0,043
, prueba de Wilcoxon). (D) ELISA para TMSB4X a partir de muestras de suero de pacientes con PC y PDAC, así como donadores sanos. Las medianas están marcadas por líneas rojas.

Para validar la correcta identificación se realizaron ALB1 tinción inmunohistoquímico y análisis de Western Blot para ALB1. expresión ALB1 en secciones de
Ptf1a
+ /Cre; Kras se observó
+ /G12D
ratones en las lesiones PanIN pero no en los conductos pancreáticos y células acinares (n = 10) normal. Además, el análisis de inmunofluorescencia para ALB1 y el marcador ductal CK19 en criosecciones de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
y
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-Tgfa
ratones demostró co-localización de las dos proteínas en las lesiones PanIN (Figura 3A). Es importante destacar que los
m /z 2790
especies no volver a visualizar en las pequeñas y grandes vasos de secciones en IMS MALDI medidos (Figura S2). El análisis de transferencia Western de lisados ​​también pancreáticas enteros reveló aumento de la expresión de proteínas en ALB1
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
y
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /ratones G12D
en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura 3C).

se informó previamente que las células pancreáticas exocrinas pueden transdiferenciarse a los hepatocitos y que los focos hepática se pueden encontrar en el páncreas adultos y en PDAC [26], [27], [28], [29]. Por lo tanto estábamos intrigados saber si la señal ALB1 altamente incrementado identificadas por MALDI-IMS podría ser debido a un proceso de transdiferenciación hepática de
Kras células pancreáticas
G12D
activados por. Para probar esta hipótesis se aisló el ARN de páncreas entero de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Opiniones y ratones de tipo salvaje entre 4,5 y 9 de mes y realizado RT-PCR cuantitativa para el hígado marcadores específicos
transferrina gratis (TFN),
Alfa-fetoproteína gratis (AFP) y
La apolipoproteína A4 gratis (ApoA4). El nivel de expresión de estos marcadores se incrementaron significativamente en
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
en comparación con ratones de tipo salvaje que indican un posible proceso de transdiferenciación se producen en PanINs (
p
≤0.05, Figura 3B). Adicionalmente se realizó un análisis de inmunohistoquímica para el marcador específico del hígado HepPar1 el 14 PanIN1, 4 PanIN2 y 4 lesiones PanIN3. Dos lesiones PanIN3 se tiñeron positivamente para HepPar1 (Figura 3D), lo que indica características de células hepáticas en PanINs de alto grado.

En cuanto a la segunda proteína identificada, se validó la expresión TMSB4X en murinos y humanos y las lesiones PanIN PDAC pero no en células acinares, ductales y los islotes (Fig. 4B). Para la cuantificación secciones teñidas de 10
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ G12D
ratones /con PanINs y encontramos todos ellos a ser positivo para TMSB4X. Es de destacar que la expresión era ya elevado en PanINs de bajo grado y se quedó en las lesiones malignas, apoyando los resultados de nuestro enfoque basado en Malid-IMS para la identificación de marcadores de lesión preneoplásicas que aún están presentes en PDAC. Desde TMSB4X es una molécula pequeña y se ha detectado en los fluidos corporales con anterioridad, el próximo investigó si puede ser detectable por ELISA en muestras de suero de ratones con lesiones PanIN. Curiosamente, nos encontramos sobreexpresados ​​significativamente los niveles sanguíneos de
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
en comparación con los ratones control WT, apoyando el valor principal de la estrategia de detección de marcadores presentada (Figura 4C. ). Sin embargo, cuando se realizó un análisis utilizando un conjunto de muestras humanas de donantes y pacientes con pancreatitis crónica y PDAC, no hubo diferencia significativa fue notable entre estos grupos (Fig. 4D).

Discusión

debido a la falta de cumplimiento continuo de los enfoques terapéuticos para mejorar la supervivencia en pacientes PDAC, la detección temprana es de vital importancia para un mejor resultado en esta enfermedad mortal de otro modo. En este estudio, hemos aplicado MALDI Imaging Espectrometría de Masas (MALDI-IMS) con una resolución espacial de
In situ
análisis proteómico de lesiones preneoplásicas del páncreas en el GEM con endógena PDAC. Hemos abordado específicamente la cuestión de si es posible identificar las proteínas o péptidos que pueden discriminar entre tejido pancreático, lesiones precursoras PanIN /TPMI morfológicamente normales y PDAC.

Mientras que la necesidad de una detección temprana de PDAC, idealmente en una preinvasora estado, es de importancia obvia, el análisis proteómico en los seres humanos se ven dificultadas por interindividual inherente y variaciones genéticas intratumoral, así como factores de confusión incluyendo las condiciones ambientales y nutricionales. Además, la obtención de tejido pancreático con lesiones PanIN o IPMN preneoplásicas no es factible por razones obvias. Por lo tanto, GEM recapitulación de la carcinogénesis pancreática humana proporcionan una excelente plataforma estudio y se han utilizado para la detección de biomarcadores de suero utilizando el análisis de SELDI-TOF [7]. En otro estudio,
Pdx1-Cre; Kras
+ /G12D; Ink4a /Arf
LOX /LOX
ratones fueron utilizados para el análisis proteómico de plasma y los candidatos fueron validados en la sangre de pacientes con PDAC [ ,,,0],30]. Un estudio reciente de Taguchi y colegas compararon los perfiles de proteínas plasmáticas de cuatro modelos de ratón de cáncer de pulmón con perfiles de modelos de páncreas, de ovario, de colon, de próstata, y cáncer de mama y dos modelos de inflamación. Ellos mostraron relevancia para el cáncer de pulmón humano de las firmas de proteínas identificadas sobre la base de modelos de ratón [31]. Por lo tanto, la hipótesis de estos GEM ser una plataforma adecuada para la identificación de biomarcadores mediante MALDI-IMS.

MALDI-IMS es un enfoque rápido desarrollo para el análisis del tejido molecular con alto potencial de preguntas clínicamente relevantes, incluyendo la identificación de biomarcadores, la clasificación de tumores , la respuesta al tratamiento y el seguimiento de imágenes de drogas [14], [16], [32], [33], [34], [35], [36].

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