Extracto
Para dilucidar la función de GPCR relacionados con el MAS, el miembro D (MRGD) en cánceres, se investigó el
in vitro
y
in vivo
función oncogénica de MRGD usando línea celular de fibroblastos murinos NIH3T3 en el que se expresa de forma estable MRGD. También se analizó el patrón de expresión de MRGD en muestras clínicas. Se encontró que la sobreexpresión de MRGD en la formación de focos inducidos NIH3T3 y la formación de esferoides multicelulares, y promovido tumores en ratones desnudos. En otras palabras, la sobreexpresión de MRGD en NIH3T3 induce la pérdida de inhibición por contacto, crecimiento independiente de anclaje y
in vivo
tumorigénesis. Además, se encontró que el ligando de MRGD, beta-alanina, la formación de esferoides mejorada en MRGD-expresión de células NIH3T3. A partir de la investigación de cáncer de los tejidos clínicos, encontramos una alta expresión de MRGD en varios tipos de cáncer de pulmón mediante inmunohistoquímica, así como PCR en tiempo real. Sobre la base de estos resultados, MRGD podría estar implicado en la tumorigénesis y también podría ser una nueva diana medicamento contra el cáncer
Visto:. Nishimura S, M Uno, Kaneta Y, K Fukuchi, Nishigohri H, Hasegawa J, et al. (2012) MRGD, un G-proteína relacionada con el receptor acoplado MAS, promueve Tumorigenisis y es altamente expresado en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (6): e38618. doi: 10.1371 /journal.pone.0038618
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 5 Septiembre, 2011; Aceptado: May 8, 2012; Publicado: June 8, 2012
Derechos de Autor © 2012 Nishimura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por Daiichi Sankyo Co. Ltd. los donantes tenían papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SN, MU, YK, KF, HN, JH, NK, FN, y TA son empleados por Daiichi Sankyo Co. Ltd. Este estudio también fue financiado por Daiichi Sankyo Co. Ltd. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
miembros de la familia
receptor acoplado a proteína G (GPCR) activan diversas señalizaciones fisiológica y desempeñan un papel importante en el desarrollo, así como la función de cada órgano [1]. Además, se han encontrado diversos GPCRs que se sobreexpresa en las células tumorales primarias y metastásicas de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, de mama, de próstata y tumores gástricos, melanoma y difusa linfoma de células B grandes [2]. Algunos GPCRs también se han reportado ser funcionalmente implicados en la progresión del cáncer [3], tales como receptor del péptido liberador de gastrina (GRPR) en el cáncer de próstata [4], CXCR4 en la metástasis [5] y así sucesivamente. MAS1, es la primera GPCR para ser informado que tienen alguna relación con el desarrollo del cáncer. Se informó de que las células NIH3T3 que expresan ectópica MAS1 promovió la formación de focos
in vitro y la tumorigénesis facilitado en ratones desnudos [6], sin embargo, ni expresión MAS1 significativa ni mutación MAS1 activo han sido reportados en los cánceres clínicos, por lo tanto, la papel de MAS1 en el cáncer todavía no está claro. Por otra parte, se observó una alta expresión de MAS1 en el sistema nervioso central, tales como el hipocampo y el cerebelo, y MAS1 aumentó la afluencia de calcio dependiente de ligando de receptor de Ang II (AT2R) donde MAS1 forma un complejo con AT2R. Estos sugieren que MAS1 juega un papel importante en el sistema nervioso central [7], [8].
Receptor acoplado a G-proteína relacionada con el MAS
, D (MRGD), también referido como hGPCR45 [9] o TGR7 [10], fue identificado como un nuevo GPCR en murino y genomas humanos [11]. Se encontró que MRGD sirve como el receptor de beta-alanina [12]. Se informó de varios miembros de la familia MRG que se expresa en subpoblaciones específicas de neuronas sensoriales, que detectan los estímulos de dolor [11]. En cuanto a MRGD, su expresión se encontró en ganglios de la raíz dorsal (DRG) y co-localizada con Vanilloide receptor-1 (VR-1), que es un receptor esencial para el calor y la sensación de dolor [12]. Por otra parte, la ablación genética de MRGD expresar neurona reduce la sensibilidad de comportamiento a los estímulos mecánicos nocivos, pero no al calor o estímulos de frío en ratones [13]. Por lo tanto, MRGD se considera que es uno de los jugadores en la sensación de dolor y /o la transducción. También se informó de que MRGD transduce la señalización intracelular de la angiotensina metabolito (Ang) II, Ang- (1-7) [14]. Como se describió anteriormente, la función de MRGD en el sistema nervioso central ha sido observado por varios grupos.
Hay varios miembros de la familia de GPCR que muestran la secuencia de aminoácidos similitud con MAS1 como mṛga, MRGB, MRGC, MRGD, MRGE , MRGF, MRGG, MRGH y MRGX [11]. En el árbol filogenético de la familia MRG, MAS1, MRGD, MRGE, MRGF y MRGH se clasifican como pertenecientes a la misma rama [11]. Esto planteó la hipótesis de que los genes en la rama filogenética incluyendo MAS1 podrían tener una similitud en la función o de transducción de señales. Nos dimos cuenta de la capacidad de MAS1 para promover la función tumorigénicos en NIH3T3, y en este estudio, intentamos dilucidar la función tumorigénico de MRGD, que se presentó a trabajar en el sistema nervioso central, tales como MAS1. También se investigó la expresión de MRGD en los tejidos de cáncer humano. Se encontró que MRGD promueve la pérdida de inhibición por contacto, crecimiento independiente de anclaje y
in vivo
tumorigénesis y está también altamente expresado en varios tipos de cáncer de pulmón humano, lo que sugiere que MRGD podría desempeñar un papel importante en el cáncer humano.
resultados
efecto de MRGD sobre la proliferación celular y la tumorigenicidad in vitro
Para aclarar el efecto de MRGD sobre el crecimiento celular, la línea celular NIH3T3-MRGD, que las células NIH3T3 fueron transfectadas establemente se estableció con MRGD vector de expresión retroviral y se analizaron sus perfiles relacionados con el crecimiento. La expresión génica de MRGD en la línea celular NIH3T3-MRGD fue confirmada por RT-PCR y secuenciación (Figura S1). El uso de las células NIH3T3-MRGD, el ensayo de formación de enfoque (ver Materiales y Métodos) se llevó a cabo, en donde la formación de focos significativa se observó en el cultivo de células NIH3T3-MRGD, mientras que no hay tales focos se observaron en NIH3T3-Mock (Figura 1A). Estos datos indican que la expresión de genes MRGD cancela la inhibición por contacto de las células NIH3T3, una de las características de los fibroblastos normales. Para determinar otras características relacionadas con el crecimiento de MRGD, el ensayo de crecimiento esferoide (ver Materiales y Métodos) se llevó a cabo, donde las células NIH3T3-MRGD y células NIH3T3-Mock se cultivaron en una placa de fondo en U de 96 pocillos no adherente, respectivamente. En primer lugar, nos dimos cuenta de que no se observaron esferoides más grandes para NIH3T3-MRGD que para NIH3T3-Mock a los 5 días después de la siembra. El esferoide de NIH3T3-Mock encogido durante el cultivo, mientras que la de NIH3T3-MRGD obviamente creció día por día, como se muestra en la Figura 1B. Se determinó este carácter relacionado con el crecimiento mediante la medición de cambio en el diámetro de los esferoides y también mediante la medición de diferencia en la actividad ATP de los esferoides (Figura 1C y D). Significativamente se observaron diámetros más grandes para esferoide NIH3T3-MRGD que los de NIH3T3-Mock de 2 a 8 días después de la siembra (Figura 1C, p & lt; 0,005, Mann-Whitney U, 2 colas). Además, mucho más contenido de ATP se observó para NIH3T3-MRGD comparación con la de NIH3T3-Mock a los 6 días después de la siembra (Figura 1D, p & lt; 0,005, Mann-Whitney U, 2 colas). Resultados similares fueron obtenidos por [
3H] timidina medición de ensayo de incorporación (Figura S2, S1 Archivo). Estos resultados indican que MRGD promueve significativamente el crecimiento independiente de anclaje de los fibroblastos normales, en otras palabras, MRGD poseen capacidad oncogénica.
A. imágenes representativas de la formación de focos en cultivos monocapa de células NIH3T3 que expresan de forma estable Mock (células NIH3T3-Mock, izquierda) o MRGD (células NIH3T3-MRGD, derecha). Las células se tiñeron con cristal violeta después de la fijación con 4% de paraformaldehído. B. imágenes representativas de NIH3T3-MRGD o esferoide NIH3T3-Mock en los días 1 y 7. Las curvas de crecimiento C. Esferoide. , Los tamaños de esferoides NIH3T3-MRGD (cerrado) o NIH3T3-Mock (abierto) en los días 2, 3, 5 y 7 se muestran con sus diámetros (media ± DE). * Indica p & lt; 0,005 (Mann-Whitney U test, 2 colas). La proliferación celular de las culturas D. esferoide de NIH3T3-MRGD o NIH3T3-Mock. La luminiscencia de los contenidos enteros de ATP celular (media ± SD) se midió a los 6 días después de la siembra. * Indica p. & Lt; 0,005 (Mann-Whitney U test, 2 colas) guía empresas
Efecto de MRGD sobre la proliferación celular y la tumorigenicidad in vivo
A continuación, para evaluar
in vivo
actividad tumorigénico, se inocularon por vía subcutánea NIH3T3-MRGD o NIH3T3-simulacro de atímicos ratones desnudos. Se observó el crecimiento notable de tejido injertado con los ratones por vía subcutánea implantados con células NIH3T3-MRGD pero no con células NIH3T3-Mock (Tabla 1). Los volúmenes medios de los tumores de los ratones injertados con células NIH3T3 MRGD superaron los 2.000 mm
3 en 21 días después de la inoculación. En contraste, no hay crecimiento notable se observó en ratones injertados con células Mock NIH3T3 hasta 21 días después de la inoculación. Un grupo de células se encontró en ratones de células Mock NIH3T3 injertado 24 días después de la inoculación, sin embargo, todavía era muy pequeño y su volumen promedio fue de menos de 400 mm
3. Como NIH3T3-MRGD formó el grupo grande
in vivo
, se realizó tinción HE para confirmar que el grupo NIH3T3-MRGD poseía características patológicas de tipo tumoral. HE tinción de las secciones de tejidos injertados de ratones injertados con células NIH3T3 MRGD mostró fibrosarcoma-como la morfología (Figura S3). En su conjunto, este resultado sugiere que la expresión MRGD provoca no sólo
in vitro, sino también
in vivo
tumorigenicidad.
La inducción del crecimiento celular por estimulación ligando
para evaluar el efecto de beta-alanina, uno de los ligandos MRGD [12], en el crecimiento de esferoides promovido por MRGD, se añadió beta-alanina en diversas concentraciones a la cultura esferoide de células NIH3T3-MRGD o NIH3T3-RASV12 Células. células NIH3T3-Mock no crecen bien en el cultivo de esferoides y se indujo ningún crecimiento estable incluso en la presencia de beta-alanina (datos no mostrados), y por lo tanto, el grupo de células NIH3T3-Mock no se fijó en este estudio. En este experimento, la promoción significativa del crecimiento celular por beta-alanina de una manera dependiente de la dosis se observó para NIH3T3-MRGD tal como se mide por la actividad de ATP (p & lt; 0,05, Mann-Whitney U, 2 colas), mientras que ningún efecto de beta-alanina se observó para el crecimiento esferoide NIH3T3-RASV12 incluso con 2.000 mg /ml de beta-alanina (Figura 2). Estos datos indican que el crecimiento independiente de anclaje de células que expresan MRGD se puede mejorar mediante su estimulación ligando.
células NIH3T3 transfectadas con MRGD o RASV12 se cultivaron en RPMI1640 que contiene 0.1% de BSA y diversas concentraciones de beta-alanina para 7 días. Los datos se obtuvieron a partir de tres cultivos de células independientes (media ± desviación estándar). * Indica p. & Lt; 0,05 (Mann-Whitney U test, 2 colas), en comparación con NIH3T3-MRGD sin beta-alanina, y con NIH3T3-RASV12
Expresión de MRGD en los cánceres humanos
Se determinó la expresión MRGD en varios cánceres clínicos. En primer lugar, para aclarar el nivel de expresión de la proteína MRGD en muestras de cáncer de pulmón, se realizó IHC usando un par de secciones de tumor y el tejido normal de 33 pares de muestras de cáncer de pulmón humano (véase Materiales y Métodos). Para IHC, el anticuerpo anti-conejo MRGD se elevó y se confirmó la especificidad de antígeno del anticuerpo, como se muestra en Materiales y Métodos; Se detectaron señales de tinción del anticuerpo anti-MRGD en la membrana externa en fijado en formol células HEK293 /αvβ3 transfectadas con MRGD, aunque no en HEK293 /αvβ3 células falsamente transfectadas (Figura 3A y B). Con este anticuerpo, 22 de los 33 casos de cáncer de pulmón clínicos mostraron MRGD señales positivas (22/33): adenocarcinomas (9/10), carcinomas pobremente diferenciados de células escamosas (7/10) y carcinomas de células escamosas bien diferenciadas (6 /10) (Tabla 2). Nos dimos cuenta especialmente fuertes señales en algunas muestras, incluyendo adenocarcinomas (8/9) (Figura 3C y S4), carcinomas pobremente diferenciados de células escamosas (3/7) y carcinomas de células escamosas bien diferenciadas (2/10). Por otra parte, no se detectó señal de tinción para el carcinoma de células pequeñas (fecha no se muestra).
muestras de bloque de células se utilizaron para confirmar la especificidad de anticuerpos en la inmunotinción. se muestran las células HEK293 /αvβ3 transfectadas con vector de expresión MRGD (A) o Mock vector (B). C. La tinción representativa de adenocarcinoma de pulmón que es positivo para MRGD.
También se analizó la expresión de genes en los cánceres clínicos MRGD por RT-PCR cuantitativa. Se han usado Ciento veinte y siete series de muestras de ARN con porciones tanto cancerosas y no cancerosas de pulmón, esófago, mama, riñón, estómago, útero y tejidos de cáncer de colon. En las muestras de útero o tejido de colon, la expresión MRGD en la porción cáncer nunca excedió 3 veces la cantidad en la porción normal. En cuanto a los cánceres de pulmón, el promedio de la expresión MRGD en la porción de cáncer excede la cantidad igual a 3 veces más que la de la parte normal de pulmón, y para 12 de las 33 muestras de pares de pulmón, la expresión MRGD en la porción de cáncer excede 3 veces la cantidad en la porción normal de emparejado (Figura 4). En todas las 7 especies de cáncer determinado aquí, las muestras de pares de pulmón mostraron la frecuencia más alta (36%) para una mayor expresión MRGD en la porción de cáncer en comparación con la de la porción normal con los criterios de más de 3 veces la cantidad (Figura 4). Algunas otras muestras de cáncer, como los senos (3 de 16), esófagos (2 de 12), los riñones (1 de cada 10) y estómagos (1 de 25), también mostraron 3 veces mayor expresión en la parte cáncer en comparación a la de la porción normal. No vimos una diferencia estadística en la comparación global de la señal de ARNm entre las porciones normales y cancerosas de cada tipo de cáncer por ANOVA de una vía. Más categorización precisa de los pacientes debe ser necesaria para obtener la significación estadística. Sin embargo, los datos indican claramente que más de 3 veces mayor señales de expresión se muestran en el tumor en lugar de la porción de lo normal en algunos pacientes con cáncer. De la expresión de la porción de cáncer en el cáncer de pulmón también fue muy consistente con los resultados de IHC. Estos sugieren que los datos son muy significativa para indicar la siguiente dirección de la investigación sobre la expresión MRGD en el cáncer.
Ciento veinte y siete conjuntos de muestras de ARN de cáncer y sin cáncer porciones de los mismos pacientes con cáncer de pulmón ( n = 33), el esófago (n = 12), de mama (n = 16), riñón (n = 10), estómago (n = 25), útero (n = 12) o del colon (n = 19) cáncer. Se representaron proporciones de la cantidad de ARNm MRGD en parte por el tumor que en la porción normal de cada caso. La barra indica la media de la proporción de cada tipo de cáncer.
Discusión
Hemos demostrado que la expresión MRGD induce la pérdida de inhibición por contacto, independiente del anclaje esferoidal crecimiento
In
vitro y también la tumorigénesis
in vivo
, que no se ven en las células de los padres normales de fibroblastos (Figura 1, Tabla 1). Estos fenotipos funcionales observados para MRGD son bastante similares a los reportados para un oncogén representante, RASV12 [15]. También confirmó que la expresión de RASV12 promueve la cancelación de la inhibición por contacto de células de fibroblastos normales y también induce el crecimiento de esferoides o el crecimiento celular independiente de anclaje (datos no mostrados). Por otra parte, hemos demostrado que las células NIH3T3-MRGD resultado significativo crecimiento de las células de fibrosarcoma-como
in vivo gratis (Figura S3), y sus fenotipos morfológicos fueron bastante similares a las células NIH3T3-RASV12 (datos no mostrados). Estos resultados apoyan firmemente que MRGD transduce la señalización tumorigénico y promueve el crecimiento celular independiente de anclaje visto con RASV12. Se informó de que las células iPS se hizo a partir de embriones de ratón fibroblastos (MEF) reprogramado mediante la introducción de varios genes, incluyendo los oncogenes [16]. En este estudio, nos centramos en la función tumorigénico de MRGD, sin embargo, podría ser también de interés para aclarar si o no MRGD es capaz de promover la troncalidad. La expresión de marcadores de stemness como Oct-3/4, Nanog y así sucesivamente [16] - [19] en NIH3T3-MRGD y otras células MRGD-positivos, así como la expresión de sí mismo MRGD en células madre y MEFs reprogramadas, son de interés para conocer la importancia de MRGD en este tema y debe ser dilucidado en el futuro.
varios informes indican que no sólo oncogén como RASV12 sino también los proto-oncogenes como erbB2 y Fyn hacerle similares fenotipo tumorigénico en células de fibroblastos [20], [21]. Además, la expresión de tales oncogenes y /o protooncogenes a menudo se aumenta en diversos cánceres humanos y que su crecimiento celular y señales anti-apoptóticas promueven no sólo el crecimiento del cáncer, sino también la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer [2], [22] - [25]. En este informe, se encontró que MRGD ARNm se expresa en muestras de cáncer de clínicas humanas frente a algunos pacientes con cáncer de pulmón, mama, esófago, riñón o cáncer de estómago. Además, se encontró que algunas de esas muestras de cáncer que expresan mRNA MRGD mostraron expresión de la proteína MRGD relativamente mayor en comparación con las porciones no cancerosas de los mismos pacientes, aunque sin significación estadística general se observó en cada tipo de tumor (Figura 4). Para cánceres de pulmón, nuestra RT-PCR análisis mostraron la expresión de alto y frecuente MRGD mRNA, y análisis de nuestro IHC reveló que el nivel más alto, que se detectó la expresión de proteínas MRGD, se observa con frecuencia en los cánceres de pulmón humanos (Tabla 2), especialmente en el pulmón adenocarcinomas (Figura 3). Aunque se necesitan más análisis de funciones MRGD en células de cáncer humano y tejidos, el perfil de expresión de MRGD en los cánceres clínicos revelado en este estudio sugiere fuertemente la posible contribución de la función oncogénica de sí mismo y /o una vía de señal relacionada MRGD en algunos tumores sólidos tales como los cánceres de pulmón. GPCRs podrían ser buenos objetivos de inhibidores de moléculas pequeñas, así como anticuerpos, y por lo tanto MRGD, un GPCR, podría servir como un nuevo objetivo para la terapia del cáncer. adenocarcinomas de pulmón podría ser un tipo de cáncer especialmente interesante para una posible terapia contra el cáncer de orientación MRGD
.
Los mecanismos por los cuales MRGD promueve siguen siendo desconocidos señales oncogénicas. Sin embargo, nuestros resultados indican que la expresión MRGD promueve fenotipos oncogénicos en las células normales tanto
in vitro
y
in vivo gratis (Figura 1, Tabla 1), y también que el ligando, beta-alanina, activa el crecimiento celular dependiente de MRGD
in vitro gratis (Figura 2). Se informó de que los niveles normales de beta-alanina fue de aproximadamente 3,8 mM en el plasma humano sano [26]. También se ha reportado, fue que las concentraciones de beta-alanina en el tejido relacionada con el nervio se demuestra que son alrededor de 50 micras de nervio ciático de rata y 60 micras en el cerebro de gato [27], [28]. Nuestros datos indican que el beta-alanina promueve el crecimiento de esferoides de 2 M a 2,000 M de una manera dependiente de la dosis, y se observó la promoción del crecimiento del 50% en 20 mM (Figura 2). Por lo tanto, beta-alanina en el plasma humano sano es lo suficientemente alta para promover el crecimiento de esferoides mediante MRGD. Un informe ha hasta la fecha, reveló que la alta concentración de beta-alanina está relacionado con el cáncer; en detalle, los tumores mamarios de rata o ratón contienen alto nivel de beta-alanina que nunca se han encontrado en el tejido mamario normal de rata o ratón [29]. Por lo tanto, la concentración de beta-alanina en el plasma o los tumores de pacientes con cáncer podría ser mayor que la de los sujetos normales. Podría ser posible que la beta-alanina activa el crecimiento del tumor y las señales de supervivencia en pacientes con cáncer a través de MRGD en cierta medida. Además, en tejidos de cáncer, la expresión de alto MRGD puede provocar la transducción de señales oncogénicas constitutiva, o puede causar mayor capacidad de respuesta de ligando que en los tejidos normales que conduce a la promoción del crecimiento del cáncer. Por otra parte, ningún informe ha revelado que el beta-alanina promueve el desarrollo del cáncer, y por lo tanto, es posible que pueda haber otro ligando MRGD contribuir al desarrollo del cáncer a través de MRGD. Estos deben ser dilucidados en el futuro
En este estudio, hemos demostrado.; 1) La actividad tumorigénico de MRGD
in vivo
y
in vitro
, 2) la expresión en tejidos de cáncer MRGD clínicos, 3) promoción del crecimiento de esferoides por beta-alanina, el ligando MRGD, y 4 ) fibrosarcoma-como la morfología de los tejidos injertados de los ratones por vía subcutánea implanta células que expresan MRGD. Estos sugieren que MRGD es un objetivo potente en el tratamiento del cáncer y que los antagonistas de molécula pequeña, anticuerpos o ARNi para MRGD proporcionaría terapia contra el cáncer prometedor.
Materiales y Métodos
escrito el consentimiento informado se recibió de todos participantes cuando hemos obtenido todos los tejidos clínicos, y todos los experimentos de los tejidos clínicos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por Daiichi Sankyo comité de ética de investigación. Todo el trabajo con animales se ha llevado a cabo de acuerdo con la directriz nacional pertinente en 2005, cuando se estudiaron las obras de origen animal.
Estos protocolos de experimentación con animales fueron aprobados por el comité de ética de investigación Sankyo animal, en Sankyo Co., Ltd., que era el antecedente de Daiichi Sankyo Co., Ltd.
Materiales y cultivo de células
FBS se adquirió de Hyclone (Sur Logan, UT). DMEM, RPMI1640, Opti-MEM, geneticina y Lipofectamine 2000 se adquirieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). línea celular de empaquetamiento de retrovirus, 293-10A1, se estableció en nuestro laboratorio a partir de 293 línea celular (ATCC, CRL-1573) mediante la transfección de PCL-10A1 (IMGENEX, Sorrento Valley, CA). La línea celular se mantuvo 293-10A1 con medio DMEM suplementado con 10% FBS, 3 mg /ml de blasticidina (Wako, Osaka, Japón) bajo condiciones de 5% de CO
2 a 37 ° C. línea celular NIH3T3 se obtuvo de ATCC (CRL-1658) y se ajustó para el medio RPMI1640 suplementado con 10% FBS. bromuro de hexadimetrina se adquirió de Sigma-Aldrich (Tokio, Japón). línea /célula αvβ3 HEK293 se estableció a partir de células 293 (ATCC, CRL-1573) por transfección estable con alpha v integrina y ß3 vectores de expresión, y se cultivó en medio DMEM suplementado 10% de FBS.
Generación de NIH3T3-MRGD células
ADNc que codifican humano de longitud completa MRGD, RASV12 o GFP se clonó en un vector pLNCX (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Para la infección, las células NIH3T3 se sembraron en una placa de 10 cm y se cultivaron durante 1-3 días. Las células 293-10A1 se sembraron en una placa de 10 cm recubierto con colágeno I (AGC Techno Glass, Chiba, Japón) y se cultivaron durante la noche. pLNCX-MRGD, pLNCX-RASV12 o pLNCX-Mock se transfectó en las células 293-10A1 por Lipofectamine 2000. El sobrenadante de las células transfectadas 293-10A1 se recogieron, a continuación, se añadió medio fresco para el siguiente ciclo. El sobrenadante recogido se filtró con una membrana de 0,45 micras de PVDF (Millipore, Billerica, MA) y el volumen igual de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 16 mg /ml de bromuro de hexadimetrina se han añadido. Esta solución viral se añadió a las células NIH3T3 de infección. La serie de estos procedimientos de infección se repitieron tres veces cada 12 horas. Después de 12 horas de la última infección, las células se cultivaron con 500 g /ml de geneticina durante una semana para acumular las células que expresan el gen diana.
formación Focus ensayo
Las células se colocaron en placas a 1 × 10
5 células /pocillo en una placa de 6 pocillos de cultivo celular (Corning Japan, Tokyo, Japón) y se cultivaron durante una semana. Las células cultivadas fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (Wako, Osaka, Japón) durante 30 minutos a 4 ° C y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta (Sigma-Aldrich Japan, Tokio, Japón).
crecimiento esferoide ensayo
células NIH3T3-MRGD se suspendieron en medio RPMI1640 suplementado con 10% de FBS o BSA al 0,1% y se sembraron en 5000 células /pocillo en 100 l en una placa de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite esferoide, Tokio, Japón) . En el caso en que se añadió beta-alanina, las células se sembraron en 5000 células /pocillo en 80 l y se añadieron a continuación 20 l de beta-alanina en el mismo día. crecimiento esferoide se midió con cualquiera de los métodos siguientes. 1) Medir el diámetro esferoidal: Diámetro del esferoide se midió mediante micrómetro ocular. Cada diámetro se calcula a partir de la ampliación de una lente de objetivo y un ocular. 2) ATP cantidad de medición de esferoide: se utilizó Titer Glo-Cell luminiscentes viabilidad celular de ensayo (Promega KK, Tokyo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entonces, esferoide con 100 l de reactivo fue bien pipeta y se transfiere a una placa de fondo plano de color blanco (Corning Japan, Tokyo, Japón). La luminiscencia 1 seg de la placa se midió por Mithras LB940 (Berthold Technologies, Wildbad, Alemania).
células NIH3T3 Análisis de tumorigenicidad in vivo de MRGD transfectadas con
ratones desnudos atímicos (BALB /ratones cAJcl-nu /nu, CLEA Japan, 5 semanas de edad, hembra) se inocularon por vía subcutánea con 3 células x 10
6 células NIH3T3-MRGD (n = 3) o NIH3T3-Mock (n = 3), como un negativo controlar. El volumen del tumor se midió 3 veces por semana. Los volúmenes tumorales se calcularon de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Según la norma nacional pertinente, todos los ratones fueron que ser sacrificados si el signo de la toxicidad tales como la actividad reducida, disminución del apetito, disminución de la bebida, lame, guarda las extremidades, aumento de la agresividad, la vocalización, aversión hacia con-específicos, deshidratación, anatomía faltante, postura anormal, apéndice fracturado y prolapso, diarrea, dermatitis progresiva, postura encorvada, letargo o decúbito persistente, tos, dificultad para respirar, secreción nasal, ictericia y /o anemia, signos neurológicos, sangrado de cualquier orificio, trauma autoinducido, dificultad para la deambulación, hipertermia o hipotermia excesiva o prolongada, o pérdida de peso, que superó el 10% del peso corporal total de los ratones de control negativo, fue visto. No hay signos de toxicidad se observó en los ratones durante este experimento.
Preparación del anticuerpo policlonal MRGD conejo anti-humano
La mezcla de 2 tipos de péptidos, GTVESALNYSRGSTVH (16 mer) y ELEGGETPTVGTNEMGA ( 17 mer), se utilizó como antígeno. Los sueros se obtuvieron a partir de conejos inmunizados con el antígeno preparado con adyuvante incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI) a excepción de la primera inmunización, que contenía adyuvante completo de Freund (Difco, Detroit, MI). Por último, los anticuerpos IgG policlonales se purificaron a partir de los sueros por una columna de afinidad con los péptidos de antígeno.
La inmunohistoquímica (IHC)
La especificidad de los anticuerpos anti-MRGD fueron validados por tinción de las células HEK293 /αvβ3 transfectadas con MRGD-expresión o vector vacío. Estos transfectantes se fijaron con solución tampón neutral 20% de formalina (Wako, Osaka, Japón) y embebidos en parafina para hacer bloques de células. Los bloques de celdas fueron cortados a láminas delgadas por microtomo y asentada sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de APS. Las secciones se secaron, se de-parafinized y pretratado por Biotina sistema de bloqueo (Dako Japón, Tokyo, Japón). Las secciones se bloquearon a continuación con el bloque de proteína sin suero (Dako Japón, Tokyo, Japón) y se trataron con un anticuerpo policlonal anti-humano MRGD (1/200) en diluyente de anticuerpo (Dako Japón, Tokyo, Japón). Las secciones tratadas con anticuerpo se trataron con IgG anti-conejo biotinilado, después se trató con ABC-AP de Vectastain ABC kit IgG de conejo con fosfatasa alcalina (CliniScience, Montrouge, Francia). AP rojo de Kit sustrato de fosfatasa alcalina que se utilizó como sustrato para colorear. secciones de tejido de cáncer se prepararon a partir de bloques incluidos en parafina y tinción inmunohistoquímica se realizó con el método ABC.
Medición de la expresión génica en el tejido MRGD clínica
ARN total de los tejidos tumorales clínicos o no tumorales de del mismo donante se adquirieron de BioChain (Hayward, CA). Estas muestras de pares de ARN fueron tratadas con DNasa ATP-dependiente (Toyobo, Osaka, Japón) con 10 unidades de inhibidor de RNasa (Toyobo, Osaka, Japón) durante 15 minutos en hielo. La DNasa fue eliminado por el sistema de ARN total miniprep (Viogene, el condado de Taipei, Taiwán). Para obtener cDNA, una mezcla de plantilla de ARN total (2 ng), cebadores aleatorios (9 mer, 50 pmol), ReverTra Ace (10 unidades, Toyobo, Osaka, Japón) y tampón de reacción (Tris-HCl 50 pH 7,5, 75 mM KCl, mM MgCl 6
2, 1 mM de DTT, 1 mM tampón dNTP) se incubó a 25 ° C durante 15 minutos, 42 ° C durante 30 minutos, y luego 95 ° C durante 3 minutos. reacción de PCR en tiempo real se realizó con TaqMaq One-Step RT-PCR Master Mix (Life Technologies Japón, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando los siguientes cebadores y la sonda.
MRGD
-2 (secuencia de la sonda TaqMan): TGTGTGCCACCATGCCTGGCTAATT
MRGD
-F2 (secuencia cebador directo): GCTCACTACAACCTCAATGTGCC
MRGD
-R2 (cebador inverso secuencia): GCCACATAGCAAGATCTCATCTCTAC
Los datos se normalizaron por TaqMan reactivo de control β-actina (Life Technologies Japón, Tokio, Japón). Estas expresiones de genes se midieron utilizando Sistema Mx3000P QPCR (Tecnología Agilent, Santa Clara, CA).
Análisis estadísticos
Todo el
in vitro
experimentos fueron analizados por U de Mann-Whitney -pruebas, excepto análisis de RT-PCR cuantitativa en muestras clínicas, los cuales fueron analizados por ANOVA de una vía. valores p reportados son de dos colas y se consideraron estadísticamente significativas a p & lt;. 0.05
Apoyo a la Información
Figura S1. electroforesis en gel de agarosa de
insertos de ADNc amplificados por PCR. Se verificaron las secuencias de ácidos nucleicos de los productos de PCR para insertos de vector. Carril 1 y 3: RT-PCR amplificado GFP a partir de ARN total de NIH3T3-GFP; carril 2: GFP amplificado a partir del plásmido GFP (control positivo); carril 4 y 6: RT-PCR-amplificación MRGD a partir de ARN total de NIH-3T3-MRGD; carril 5:. Amplified MRGD de MRGD plásmido (control positivo)
doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s001 gratis (TIF)
figura S2. La proliferación celular Red de NIN3T3-MRGD esferoide medido por [
3H] -timidina. [
3H] -timidina en los esferoides se midió a los 6 días después de la siembra. * Indica p & lt; 0,005 (prueba de Mann-Whitney, 2 colas)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
HE tinción de NIH3T3-MRGD injerta el tejido en el ratón desnudo. Los grumos NIH3T3-MRGD en 7 días después de la inoculación en ratones atímicos (A, x 40, B, × 800) mostraron un tipo de tejido tumoral de células fusiformes representante celular
doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s003
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figura S4.
HE y tinciones IHC de muestras de adenocarcinoma de pulmón con anticuerpo anti-MRGD. Tinción HE (A, C, E) y tinción IHC (B, D, F) se realizaron. Estos son los ejemplos de tres pacientes con adenocarcinoma de pulmón independientes. Paciente 1, A, B; Paciente 2, C, D; Paciente 3, E, F.
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archivo S1.
Material y Métodos de la figura S2.
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Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a los miembros de la I + amp; Sala D de Daiichi Sankyo; N. Maeda y N. Abe para la fabricación de bloques de celdas, M. Yamada para la tinción de muestras de él y de IHC, S. Endo para el análisis estadístico, y el Dr. M. Ono, el Dr. P. Rodley y el Dr. Y. Abe para la asesoría en la redacción de este informe.