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PLOS ONE: Mecanismo de acción de los dos isómeros flavona atacar a las células de cáncer con diferentes estado de diferenciación celular

2015/8/3


Extracto

La apoptosis puede ser activado de dos maneras diferentes, a través de la intrínseca o extrínseca de la vía. La vía intrínseca está mediada por la mitocondria a través de la liberación de citocromo C, mientras que la vía extrínseca está motivada por las señales de los receptores de muerte y no pasa por las mitocondrias. Estas dos vías están estrechamente relacionados con la proliferación celular y las cascadas de señalización de supervivencia, que constituyan por tanto posibles dianas para la terapia del cáncer. En estudios anteriores se introdujo dos flavonoides isoméricas derivados de plantas, flavona A y B de flavona que inducen apoptosis en células de cáncer altamente tumorigénicas de la mama, colon, páncreas, y la próstata. Flavona una actividad citotóxica potente representada contra carcinomas más diferenciada de los dos puntos (Caco-2) y el páncreas (Panc28), mientras que se observa flavona acción B citotóxico sobre carcinomas pobremente diferenciados del colon (HCT 116) y el páncreas (MIA PACA). La apoptosis es inducida por la flavona A en cáncer de colon mejor diferenciados Caco-2 y cáncer de páncreas Panc 28 células a través de la vía intrínseca por la inhibición de las formas activadas de quinasa extracelular regulada por señal (ERK) y PS6, y la posterior pérdida de la fosforilación de Bcl -2 promotor de muerte asociado (BAD) de proteínas, mientras que la apoptosis es desencadenada por flavona B en cáncer de colon HCT 116 y pobremente diferenciado MIA Paca células de cáncer pancreático a través de la vía extrínseca con la regulación al alza concomitante de las formas fosforiladas de ERK y c-jun en serina 73. Estos cambios en los niveles de proteína en última instancia conducir a la activación de la apoptosis, sin la participación de AKT

Visto:. LeJeune TM, Tsui HY, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch KE, et al. (2015) Mecanismo de acción de los dos isómeros flavona atacar a las células de cáncer con diferentes estado de diferenciación celular. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10.1371 /journal.pone.0142928

Editor: Jia Yu-Chang, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán

Recibido: Abril 29, 2015; Aceptado: 28 Octubre 2015; Publicado: 25 Noviembre 2015

Derechos de Autor © 2015 LeJeune y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Ciencias farmacéuticas de la Universidad de East Tennessee State Gatton Facultad de Farmacia (http://www.etsu.edu/pharmacy/), 82171 concesión del Programa de importantes donaciones Comité de Desarrollo de la Investigación de la Universidad Estatal de East Tennessee (http://www.etsu.edu/research/rdc/) y el Departamento de Química de la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (http: //www. udca.edu.co/)

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la prevalencia de cáncer ha aumentado de manera constante a lo largo del pasado. décadas [1]. Mientras que las terapias actuales son eficaces en varios niveles, muchos de estos tratamientos también son no específicos con respecto a su mecanismo de acción. Esto a su vez aumenta los resultados de reacciones adversas en los pacientes tratados; efectos secundarios severos y bajas tasas de eficacia son algunas de las muchas razones por las cuales se han buscado tratamientos más específicos en oncología. Entre estos esfuerzos, los productos naturales [2] se han estudiado ampliamente con la esperanza de identificar nuevas entidades moleculares con propiedades antineoplásicas. De estos productos naturales, flavonoides, una clase de compuestos polifenólicos encontrados en plantas, se han demostrado ejercer antineoplásicos [3-9] propiedades, así como antioxidante [10, 11], anti-inflamatoria [12], los antimicrobianos [13] y antivirales [14, 15] actividades.

en los últimos cinco años nuestra investigación se ha centrado en las plantas de las montañas de los Andes en gran medida conocida como
vira viras
. Estas plantas han sido utilizadas por los nativos de esta región con fines medicinales como en el tratamiento del cáncer, como se informó en varios estudios etnobotánicos [16, 17]. Pertenecen a la familia de
Asteraceae
, géneros
Gnaphalium
,
Achyrocline
, y
Gamochaeta
. Nuestro enfoque con respecto a las plantas vira vira se ha colocado en
Gnaphalium elegans
y
Achyrocline bogotensis
a partir del cual se aislaron dos compuestos activos, 5,7-dihidroxi 3,6,8-trimetoxi 2-fenil-4H-cromen-4-ona (5,7-dihidroxi-3,6,8-trimethoxyflavone o flavona A) [18], y 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxi-2- fenil-4H-cromen-4-ona (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimethoxyflavone o flavona B), respectivamente [19]. Se ha propuesto en nuestro trabajo previo que estos dos isómeros flavona pueden ser relevantes para las actividades antineoplásicos de estas plantas [20]. De hecho, flavonas A y B demostraron actividad citotóxica contra líneas celulares derivadas de cánceres de colon, de páncreas, de mama y de próstata que han sido clasificadas como altamente tumorigénico, con los resultados más prometedores en los cánceres de colon y páncreas. Los altos niveles de expresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH) es considerado como un marcador muy específico utilizado en la detección de células iniciadoras del cáncer como subpoblaciones en los tumores, y se ha demostrado específicamente en las líneas celulares estudiadas [21-23]. Entre estas líneas de células altamente oncogénicas, los dos isómeros flavona muestran actividad antineoplásica preferencial en células con estado de diferenciación distintos. Flavona A apoptosis inducida en las líneas celulares de mejor diferenciados, pero no en las líneas de células pobremente diferenciados, mientras que flavona B ha demostrado ser activo contra pobremente diferenciado, pero no contra las células mejor diferenciadas. Por otra parte, estos dos isómeros de flavona no inducen apoptosis en las células normales y muestran una actividad significativamente menor de apoptosis en líneas celulares de menos tumorigénicas [20].

Se sabe que la gestión mitocondrial de la apoptosis puede ser controlado a través de la actividad de supervivencia factores, tales como factores de crecimiento o citoquinas, a través de receptores extracelulares que activan cascadas de eventos de proteínas que eventualmente conducen a la caspasa-3 de escisión. Estas vías se sondaron mediante la investigación de los efectos de los dos isómeros de flavona de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), proteína quinasa B (AKT), proteína ribosomal S6 (S6), y Bcl-2 promotor muerte asociado (BAD). La inducción preferencial de la apoptosis en las células altamente oncogénicas con estado de diferenciación diferente por flavona A y B flavona, compuestos de dos estructuralmente similares, sugieren la activación de diferentes vías celulares por cada compuesto. Este estudio muestra que flavona A ejerce su efecto citotóxico sobre las células cancerosas mejor diferenciados a través de una vía apoptótica intrínseca mientras que flavona B pasa por la ruta mitocondrial para inducir la apoptosis a través de una vía extrínseca en células de cáncer pobremente diferenciados.

Materiales y Métodos

Extracción, purificación e identificación de las flavonas

Las flavonas se obtuvieron como se ha descrito antes [20]. En pocas palabras, flavona A se purificó a partir de 1,5 kg de
G
.
elegans
flores secas se extrajo con CHCl
3. El extracto se concentró por vacío en seco, se disolvió en metanol, y se filtró para eliminar las grasas y los hidrocarburos. A continuación, se concentró y se disolvió en C
6 H
6 seguido por cromatografía en gel de sílice usando C
6 H
6: Me
2CO (19: 1) como eluyente. De esto, se purificó 50 mg del flavonoide de las fracciones 12 a través de 18 por cristalizaciones en hexano. El compuesto se identificó por sus propiedades físicas y espectroscópicas como 5,7-dihidroxi 3,6,8 trimethoxyflavone, pf 170 171C, 1H RMN (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,20 (3H, s), 7,50 7,6 (3H, m), 8,08 8,16 (2H, m). Flavona B se purificó a partir de 200 g de hojas frescas de
Un
.
bogotensis
. Las hojas se sumergieron en CHCl
3 durante 20 minutos y después se filtró, se concentró y se disolvió en metanol caliente. Con el fin de eliminar las grasas y los hidrocarburos, el extracto frío se filtró y se concentró de nuevo. El sólido resultante se disolvió en hexano caliente y recristalizaciones sucesivas en hexano produjo 100 mg de flavonoide purificada. El compuesto se identificó por sus propiedades físicas y espectroscópicas como 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimethoxyflavone, pf 149 150 ° C, 1H RMN (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 3,99 ( 3H, s), 4,12 (3H, s), 7,30 7,45 (3H, m), 8,70 8,82 (3H, m), 11,46 (1H, s).

Líneas celulares y condiciones de cultivo.

Colon (Caco-2, HCT116) y de páncreas (MIA PaCa-2) las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron según las instrucciones de la ATCC. La línea celular Panc28 fue un regalo del Dr. Paul Chiao (Universidad de Texas M. D. Anderson Cancer Center de Houston, TX), y se hizo crecer de la misma manera como la línea de células de páncreas MIA Paca-2. Las células se cultivaron en medio suplementado con 10% de suero (Gibco, Grand Island, NY) y penicilina /estreptomicina (Hyclone, Logan, UT). Todas las células se sembraron y se dejaron llegar a 75% de confluencia antes del tratamiento con flavona A, B, o vehículo (dimetilsulfóxido) a una concentración final máxima de 0,27% en los pocillos tratados (Sigma Aldrich, St Louis, MO).

Detección de apoptosis por microscopía de fluorescencia

la apoptosis se detectó utilizando el Annexin V-FITC kit de Abcam (Cambridge, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 4-5x10
4 /pocillo en 12 mm cubreobjetos redondos (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), se dejó llegar a 75% de confluencia, y tratadas con vehículo, flavona A, o flavona B a una concentración de 40 mM. Seis horas después de la dosificación, las células se incubaron en tampón y conjugado con FITC Anexina V vinculante durante cinco minutos en la oscuridad. Después las células se fijaron con 2% de p-formaldehído y las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia EVOS (AMG, Bothell, WA).

ciclo celular y análisis de apoptosis por citometría de flujo

células cultivadas en placas de seis pocillos, se trataron con vehículo o bien disolución, flavona a, o flavona B. Después de nueve horas de incubación, las células fueron levantadas de la placa con tripsina, y se ensayaron para la cuantificación de la apoptosis y del ciclo celular distribuciones utilizando un V- Anexina kit FITC de Abcam (Cambridge, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se suspendieron en tampón de unión y Anexina V-FITC y yoduro de propidio se añadieron, seguido de una incubación de 5 minutos en la oscuridad. Se obtuvo el recuento de células usando flujo BD Accuri C6 citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA) y se analizaron con Cflow Plus (BD Biosciences).

Los anticuerpos y reactivos

El mecanismo de acción se evaluó utilizando anticuerpos contra ERK2 de Santa Cruz (Dallas TX), AKT de Millipore (Billerica, MA), c-jun y BAD Cell Signaling (Beverly, MA), c-Jun fosforilado (T91 /93) de Abcam (Cambridge, MA ), c-Jun fosforilado (S63 /73), las formas fosforiladas de ERK, la proteína ribosomal S6 (91B2), y malo, de Señalización celular, Akt fosforilada S473 de Millipore, BH3-interacción agonista de la muerte de dominio (Bid) de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN), formas inactivas y activas de la caspasa 3 de Santa Cruz y R & amp; D Systems, caspasa 8 y caspasa 10 de MBL (Woburn, MA), y la caspasa 9 de Señalización celular, y α-tubulina y β -actina de Sigma (St. Louis, MO). Todos los anticuerpos secundarios fueron purificados afinidad sin reactividad cruzada con otras especies. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se obtuvieron de Pierce (Rockford, IL), Promega (Madison, WI), y Jackson ImmunoResarch (West Grove, PA). Se utilizaron anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 y 594 conjugados (Molecular Probes, Eugene, OR) según lo especificado por el fabricante. El tamoxifeno utiliza para obtener una señal de control positivo para el análisis de la fosforilación de c-Jun fue de Sigma.

PAGE y de inmunotransferencia

Las células tratadas se lisaron con tampón de lisis que consistía en imidazol 20 mM, 100 KCl mM, 1 mM de MgCl
2, 10 mM de EGTA, 0,2% de Triton X-100, los inhibidores de fosfatasa y proteasa (Sigma Aldrich). La concentración de proteína de los lisados ​​celulares se midió espectrofotométricamente (Cary 50; Varian, Palo Alto, CA) utilizando un ensayo de proteína de citoesqueleto (Denver, CO, EE.UU.). Las muestras se corrieron en SDS-PAGE y luego se transfirieron a láminas de nitrocelulosa o PVDF. La señal de la monoclonal primario o anticuerpos policlonales se detectó utilizando secundario de cabra purificado por afinidad anti-ratón o las inmunoglobulinas anti-conejo acoplados a peroxidasa y un sistema quimioluminiscente (Pierce; Grand Island, NY) y se expuso en una película de rayos x (Kodak; Rochester, NY). La intensidad de las bandas se calcula mediante la digitalización de la imagen (Image J) a partir de una película de rayos x. Después de restar el fondo, todas las intensidades de las bandas se compararon con el control.

inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia se llevó a cabo como se describe antes [24]. Brevemente, las células se fijaron con 3% de p-formaldehído durante 20 min a temperatura ambiente. Después de aclarar, las células se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 durante 5 min o 0,1% de saponina durante todo el procedimiento. Permeabilización fue seguido por enfriamiento de los grupos aldehído en NH 50 mM
4Cl. Las células fueron incubadas con el anticuerpo primario diluido en 1% de BSA, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavados e incubación con el anticuerpo secundario, las células se montaron en 10% de alcohol de polivinilo, 30% de glicerol, 1% galato de n-propilo, y de fundido lento (Molecular Probes, Invitrogen) a una dilución de 5: 1. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron usando un microscopio de fluorescencia EVOS (AMG, Bothell, WA).

Resultados

flavona A y B flavona inducir la apoptosis celular y un ciclo de cambio

Nuestra anterior datos sugieren que flavonas a y B causa la fragmentación del ADN en las células mejores y pobremente diferenciados, respectivamente [20]. Se llevaron a cabo ensayos de Anexina V para confirmar la inducción de la apoptosis en el estado de células tumorigénicas después de la dosificación con las flavonas. La apoptosis se detectó 6 horas después de cáncer de páncreas Panc-28 (Fig 1A) y células de cáncer de colon Caco-2 (Fig 1B) se dosificaron con 40 M de flavona A. De la misma manera, la apoptosis se detectó después de 6 horas el cáncer de páncreas MIA Paca -2 (Fig 1C) y de cáncer de colon HCT116 células (Fig 1D) se dosificaron con 40 M de flavona B. Para cuantificar los cambios apoptóticos inducidos por las flavonas, las células dosificados con el vehículo o flavona, se analizaron 6, 9 y 12 horas después del tratamiento mediante citometría de flujo utilizando yoduro de Anexina V /propidio. A los 9 horas, Panc 28 células tratadas con flavona A tenían 2,9 veces de incremento en la apoptosis (Fig 2A y 2C). Del mismo modo, a las 9 horas, las células HCT 116 tratados con flavona B tuvieron un aumento de 2,3 veces en la apoptosis (Fig 2B y 2C).

efecto apoptótico de flavona A a una concentración de 40 mM, en el páncreas más diferenciado Panc28 y colon CaCo 2 células cancerosas (Fig 1A y 1B), tal como se determina por el ensayo de Anexina V (canal verde) seis horas después del tratamiento. DAPI (canal azul) se utiliza para localizar los núcleos de las células. Las células tratadas con vehículo solamente (DMSO a una concentración final de 0,27%) sirvieron como control. La activación de la apoptosis en el páncreas pobremente diferenciado MIA PaCa y células de cáncer de colon HCT116 (Figs 1C y 1D) por flavona B a una concentración de 40 mM, como se determina por el ensayo de Anexina V (canal verde) seis horas después del tratamiento. Las condiciones de control son los mismos que se ha descrito anteriormente y Dapi se utilizó para localizar los núcleos.

a. La apoptosis se detectó usando Anexina V-FITC y yoduro de propidio en Panc 28 células tratadas con 40 mM de flavona A, 9 horas después del tratamiento. B. Detección de la apoptosis en células HCT 116 trató con 40 mM flavona B, 9 horas después del tratamiento. C. Bar representación gráfica de la apoptosis en Panc 28 y HCT 116 células tratadas con flavona A y B respectivamente. DELAWARE. la determinación del ciclo celular utilizando yoduro de propidio en células Panc 28 tratados 40 M flavona A. F-G. determinación del ciclo celular en células HCT 116 se trató con 40 mM de flavona B.

Para probar si el tratamiento con flavona A o flavona B tuvo un efecto en las distribuciones del ciclo celular, citometría de flujo se realizaron ensayos utilizando yoduro de propidio. células pancreáticas mejor diferenciados Panc 28 células fueron tratadas con flavona A (figura 2D y 2E). Después de 9 horas, un cambio de la fase G0 /G1 a la S y G2 fases se ve claramente. Pobremente diferenciado de células de cáncer de colon HCT 116 fueron tratados con flavona B. Un cambio similar de la fase G0 /G1 a S y G2 fases es evidente 9 horas después del tratamiento (Figura 2F y 2G).

flavona A tiene un inhibidor ERK fosforilada efecto sobre y S6, pero no tiene efecto sobre AKT o c-Jun en Panc28 mejor diferenciados y Caco-2 células cancerosas

con el fin de determinar el mecanismo responsable del efecto citotóxico sobre las células cancerosas mejor diferenciadas observado después del tratamiento con flavona A, proliferativa, la supervivencia, y las vías de señalización de apoptosis fueron examinados. El cáncer de colon células de cáncer de páncreas Panc28 Caco-2 y se dosificaron con 40 M de flavona A y niveles de AKT se activa, se analizaron ERK, S6, y c-jun. Como se muestra en la figura 3A y 3C, la dosificación células Panc 28 con flavona A indujo una reducción media de la forma fosforilada de ERK a 64,27% (51,84% -74,83%; p = 0,0029) y de PS6 a 52,58% (37,90% -62,50 %; p = 0,012) en comparación con el control. En las células Caco-2, la reducción media de ERK fosforilado por flavona A era de 42,58% (25,38% -55,64%; p = 0,0031) y 57,99% (43,84% -77,36%; p = 0,0138) para PS6, en comparación con el control. No se observó cambio en los niveles de expresión de las proteínas unphosphosphorylated analizados (Fig 3A). Estos resultados fueron confirmados por inmunoblot de inmunofluorescencia. resultados ERK fosforiladas en células Caco-2 se muestran en la Fig 3E. Además, las formas activadas de AKT en la serina 473 y c-jun en la serina 73, también se estudiaron ya que estas proteínas regulan tanto la supervivencia celular y la apoptosis inducida por el estrés, respectivamente. Ninguno de estos cambios significativos demostrado en 2 Caco-líneas celulares (figura 3A y 3C) Panc-28 y

A y B:. La detección de las formas activadas y no fosforiladas de ERK, c-jun, S6, AKT por inmunotransferencia de extractos totales de SDS. Mejor diferenciadas células Panc28 y CaCo 2 fueron tratados con 40μM de flavona A (+ A), y pobremente diferenciado MIA PaCa y células HCT116 con flavona B (+ B), o DMSO (-) del vehículo de disolución. Después de la lisis y SDS-PAGE, las membranas se probaron con el anticuerpo indicado. Las membranas se volvieron a sondar para la actina como control de carga, y se proporciona una imagen representativa. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. C y D: Para la cuantificación (gráficos) las densidades de banda de las condiciones tratado /sin tratar identificados por (+) o (-), se normalizaron y calculados como porcentajes del valor de las células no tratadas (100%), y los promedios se muestran ± desviaciones estándar de tres experimentos independientes (* p & lt; 0,05). E y F:. La detección de ERK fosforilada después del tratamiento de CaCO 2 células con células de flavona A y HCT116 con flavona B por inmunofluorescencia

El aumento de expresión del fósforo-c-Jun (S73) y ERK eran observado después del tratamiento de células poco diferenciadas MIA Paca y cancerosas HCT116 con flavona B Opiniones
Un incremento de la media de 190,19% de ERK activada en cáncer de páncreas células MIA Paca (175.32% -204,08%; p = 0,0036; n = 3 ), y 160,23% en las células HCT116 de cáncer de colon (144,99% -174,22%; p = 0,012; n = 3) fueron observados después del tratamiento con flavona B (Fig 3B y 3D) en comparación con los controles. No se observó cambio en los niveles de expresión de las proteínas unphosphosphorylated analizados (Figura 3B). Estos resultados fueron confirmados por inmunoblot microscopía de fluorescencia y se muestran los resultados ERK fosforiladas para HCT-116 células (Fig 3F). También se observó el aumento de los niveles de la forma fosforilada de c-Jun (S73) en MIA Paca al 170,83% respecto a los niveles de control (162,27% -181,90%; p = 0,0008; n = 3), y en HCT116 en 271.34% (222.95 % -312,93%; p = 0,0028; n = 3) como se muestra en la figura 3B y 3D

flavona B tiene efectos diferentes sobre PS6 en MIA PaCa y células HCT116, pero no tiene efecto sobre la AKT fosforilada

Después del tratamiento de las células MIA PACA con flavona B, los niveles medios de PS6 se redujo a 51,68% (19,95% -77,77%; p = 0,0237; n = 3) versus control como se ve en la figura 3D. Por el contrario, después del tratamiento de las células HCT116, un aumento del 149,88% (136,54 a 170,22; p = 0,0116; n = 3) se observa, en comparación con los controles. Los niveles de expresión de fosfoserina 473 AKT, se mantuvieron sin cambios después del tratamiento de MIA PaCa y células HCT116 con flavona B como se muestra en la figura 3B y 3D.

flavona A modula la fosforilación de BAD en la serina 112 pero no flavona B

Para investigar más a fondo las diferencias de efecto celular de flavona a y B flavona, se estudió el estado de fosforilación de BAD en la serina 112. líneas de células Panc-28 y Caco-2 dosificados con flavona Un muestran una disminución de BAD fosforilada en la serina 112 (figura 4A). Esta reducción tuvo una media de 35,91% (34,21% -37,61%; p = 0,006; n = 3) en Panc-28, y 57,03% (42,12% -71,62%; p = 0,0068; n = 3) en Caco-2 células (Fig 4C). Estas observaciones fueron confirmadas a través de inmunofluorescencia para Panc-28 como se muestra en la figura 4E. Por el contrario, la dosificación MIA células oncogénicas Paca-2 y HCT116 con 40 M de flavona B producido ningún cambio significativo en la cantidad total de BAD fosforilada en la serina 112, como se muestra por Western blot (Figura 4B y 4D) e inmunofluorescencia para MIA Paca-2 ( Fig 4F). Si bien no hay un cambio significativo observado en los niveles de expresión de MAL no fosforilada en células diferenciadas mejor (figura 4A), un ligero aumento se observó en las células poco diferenciadas (Figura 4B)

A y B:. La detección de la pérdida de fosforilación de BAD por inmunotransferencia de extractos totales de SDS. Mejor diferenciadas Panc 28 y CaCo 2 células fueron tratadas con 40μM de flavona A (+ A), y pobremente diferenciado MIA PaCa y células HCT116 con flavona B (+ B), o DMSO (-) del vehículo de disolución. Después de la lisis y SDS-PAGE, las membranas se probaron con un anticuerpo específico para BAD fosforilado en la serina 112 o la proteína no fosforilada. Las membranas se volvieron a sondar para la actina como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. C y D: Para la cuantificación (gráficos) las densidades de banda de las condiciones tratado /sin tratar identificados por (+) o (-), se normalizaron y calculados como porcentajes del valor de las células no tratadas (100%), y los promedios se muestran ± desviaciones estándar de tres experimentos independientes (* p & lt; 0,05). E y F: Detección de BAD fosforilada en la serina 112 (canal rojo), después del tratamiento de células Panc 28 con flavona A y células MIA Paca con flavona B por inmunofluorescencia. Dapi (canal azul) se utiliza para localizar el núcleo.

flavona A puede inducir la apoptosis a través de la caspasa 9

Para determinar si la caspasa 9 participa en la cascada apoptótica iniciados por flavona A, células Caco-2 y Panc28 se dosificaron y se analizaron por SDS PAGE seguido de inmunotransferencia para la presencia de fragmentos escindidos de 37 y 17 kDa con un anticuerpo capaz de detectar la caspasa activado. Fig 5A muestra un inmunoblot representativo de Caco-2, y la figura 5B para las células Panc28 de lisados ​​tomadas en diferentes puntos de tiempo después de la dosificación con flavona A. Ambas líneas celulares muestran los fragmentos grandes, 37 y 35 kDa, detectados por el anticuerpo (Fig 5A y 5B). El fragmento de 37 kDa es evidente en el control (células dosificados con vehículo) lo que sugiere la desregulación de la proteína en estas líneas celulares. Sin embargo, una reducción progresiva en el nivel de expresión de la procaspasa 9 (47 kDa) es evidente a partir de 3 horas después de la dosificación.

La detección de caspasa 9 activada por inmunotransferencia de los extractos de A. SDS Caco 2 y B. Panc 28 células de 1,5, 3, 6, 9 y 12 horas (carriles 2-6) después del tratamiento con flavona a o vehículo (DMSO) para el control (C, carril 1) y SDS-PAGE. Las membranas se sondearon con un anticuerpo capaz de detectar tanto la procaspasa (47 kDa) y de los grandes fragmentos resultantes después de la activación (37 y 35 kDa). Las membranas se volvieron a sondar para la actina o tubulina como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Las membranas se volvieron a sondar para la actina o tubulina como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

flavona B ni fosforilar c-Jun en treoninas 91 y 93, ni activar las caspasas 8 y 10 en HCT 116 o células MIA Paca

para confirmar la activación de flavona B del programa de apoptosis a través de la vía extrínseca sin la participación de la vía intrínseca, se estudiaron las formas de fosforilación de c-jun relevantes para el acoplamiento de las mitocondrias a través de la escisión de la caspasa 8 [25, 26]. las células HCT 116 y MIA PACA dosificados con flavona B no muestran la activación de c-jun en treoninas 91 y 93 como se muestra en la figura 6A mediante inmunofluorescencia en células HCT 116. células de cáncer de mama SKBR3 dosificados con tamoxifeno, un control positivo para esta activación [27], se procesaron de la misma manera como se describió anteriormente (Fig 6B). Este resultado se confirmó mediante inmunotransferencia como se muestra en la figura 6C. El examen de el estado de activación de las caspasas 8 y 10 en estas células después del tratamiento con flavona B no mostró escisión de esta proteína ya sea en el HCT 116 o las células MIA PACA. Esto es evidente por la presencia de las caspasas no escindidas en diferentes puntos de tiempo que abarca desde 1,5-12 horas. inmunotransferencias representativas de experimentos de tiempo para las caspasas 8 y 10 en células HCT 116 se muestran en la figura 6D y 6E, respectivamente.

A y B. La inmunofluorescencia de las células tratadas muestran expresión de fosfo-c-Jun (T91 /T93 ) en células SKBR3 (canal verde), pero no en las células HCT116. Se utilizó DAPI (canal azul) para localizar los núcleos. C. inmunotransferencia de fosfo-c-Jun (T91 /T93) utilizando extractos de SDS de las células HCT116 pobremente diferenciado tratadas con 40μM de flavona B (A + B), o el vehículo de disolución de DMSO (-). SDS lisados ​​de células SKBR3 tratadas con 10μM tamoxifeno (+) se utilizaron como control positivo. Después de SDS-PAGE, las membranas de nitrocelulosa se sondaron con un anticuerpo específico para esta forma fosforilada. D. Detección de la caspasa 8 por inmunotransferencia de lisados ​​de SDS células HCT116 1,5, 3, 6, 9 y 12 horas (carriles 2-6) después del tratamiento con flavona B o vehículo (DMSO) para el control (C, carril 1) y SDS-PAGE. Las membranas se sondearon con un anticuerpo capaz de detectar tanto la procaspasa (54/55 kDa) y los fragmentos resultantes después de la activación (43 y 18 kDa). Las membranas se volvieron a sondar para la actina o tubulina como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

Discusión

Nos había demostrado el diferencial efectos antineoplásicos de flavonas A y B en las células de los cánceres de mama (MCF7, SKBR3) , colon (Caco-2, HCT116), páncreas (Panc 28, MIA PACA) y próstata (LNCaP PC3) con el estado de diferenciación distintos. Las flavonas se extrajeron de
G
.
elegans
y
Un
.
bogotensis
, plantas con propiedades medicinales como la que se utilizan indistintamente tanto, de acuerdo con estudios etnobotánicos. Sin embargo, las flavonas no son exclusivos de estas especies. Un flavona se ha encontrado en
ainsliaea henryi
[28] y en
decumbens Helichrysum [29], mientras que
flavona B ha sido aislado de
Helichrysum graveolens
[30], como se así como
Helichrysum odoratissimum
[31], y
Helichrysum compactum
[32]. Flavonas A y B demostraron un efecto citotóxico significativo contra las líneas celulares altamente oncogénicas, sin afectar a las células epiteliales normales. En concreto, flavona Un demostró alta citotoxicidad frente a la más diferenciada Panc28 y células Caco-2, mientras que flavona B mostró una preferencia por poco diferenciado MIA Paca, HCT 116, y las células SKBR3 [20]. Tiempo de duplicación celular, y la presencia de marcadores de diferenciación y de polaridad concreto se utilizan para determinar el estado de diferenciación celular. Entre las células analizadas, Panc28 se ha descrito previamente como pobremente diferenciado principalmente debido a la ausencia de marcadores de polaridad presentes en otras líneas de células pancreáticas, tales como Capan-1, a pesar del hecho de que tiene un tiempo de duplicación celular bastante largo. Sin embargo, es el consenso general de que Panc 28 células tienen un estado de diferenciación mayor que las células MIA PACA [33], y nuestros resultados sugieren que las flavonas pueden ser sensibles a esta diferencia. Para comprender mejor el mecanismo por el cual el programa de apoptosis se inicia por flavonas A y B en sus células diana, se evaluó el efecto de cada flavona en extrínseca llave y proteínas de la vía intrínseca de apoptosis, tales como ERK, PS6, AKT, BAD, y c -jun en sus formas activadas.

Nuestros resultados sugieren que la flavona a puede inducir la apoptosis en células de páncreas y cáncer de colon mejor diferenciadas, a través de la vía intrínseca mitocondrial. Esto es evidente por la disminución de la ERK fosforilada y S6 y la posterior pérdida de BAD activado. La fosforilación mantiene BAD en el citoplasma, y ​​sus resultados de pérdida en la unión y la inactivación de las proteínas de supervivencia Bcl-xL o Bcl-2, después de cruzar la membrana mitocondrial [34] lo que la activación de la apoptosis. Una disminución significativa de BAD fosforilado en la serina 112 se observa en el cáncer de páncreas Panc 28 y está mediada cáncer de colon Caco-2 células después del tratamiento con flavona A. La activación de BAD en la serina 112 por la vía MAPK, específicamente a través de la activación de Ras Raf-ERK [35]. Por lo tanto, la inhibición de fosforilados ERK y S6 observó después del tratamiento con flavona A, podría ser aguas arriba de la pérdida de BAD activado en la serina 112 y la subsiguiente iniciación de la apoptosis a través de la interrupción de la integridad de la membrana mitocondrial y la liberación de citocromo c y otra apoptótica factores. Estos eventos pueden conducir a la activación de la caspasa 9 y efectoras caspasas. Sin embargo, las caspasas son altamente desregulados en el cáncer a través de diversas mutaciones o pérdida de la expresión [36]. En el caso de la caspasa 9, éstos son poco comunes, y es la supresión de las actividades funcionales mitocondriales enviar que favorecen la progresión del tumor [37]. Este puede ser el caso en nuestros caspasa 9 resultados, donde la caspasa activado está presente en el control y las células tratadas, lo que puede sugerir pérdida de la función apoptótica. Es importante señalar que la alteración de la integridad mitocondrial puede desencadenar una caspasa predeterminado programa de 9-independiente de muerte celular [38]. Si la apoptosis se produce independientemente de la actividad de la caspasa 9 o por la creación de una relación favorable de activo vs caspasa inactiva, como se ha visto en nuestros resultados, se presentan pruebas que apoyan la activación de una vía intrínseca. Además, nuestros resultados también muestran que ni AKT ni c-Jun participan en el mecanismo de acción propuesto para la flavona A.

A la inversa, flavona B induce la apoptosis en células de cáncer pobremente diferenciados del páncreas y el colon a través de una vía extrínseca.

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