Extracto
Cáncer-testículos (CT) los genes se expresan en diversos tipos de cáncer, pero no en otros tejidos normales que en las células de la línea germinal. Aunque la desmetilación del ADN de las GPC próxima al promotor de los genes de TC está vinculada a su expresión en el cáncer, los mecanismos que conducen a la desmetilación son desconocidos. Para dilucidar estos mecanismos se optó por estudiar la línea celular de cáncer colorrectal Caco-2 durante el curso de su diferenciación espontánea
in vitro
, ya que nos encontramos genes de TC, en particular,
PAGE2, 2B
y
SPANX-B Opiniones, al ser de hasta reguladas durante este proceso. La diferenciación de estas células dio lugar a una transición de mesénquima a epitelio (MET) como lo demuestra el aumento de marcadores epiteliales CDX2, claudin-4 y E-cadherina, y una pérdida concomitante de marcadores mesenquimales vimentina, fibronectina-1 y transgelin. PAGE2 y SPAN-X sobre regulación fue acompañado por un aumento en-2 translocación expresión Diez-once (TET2) y citosina 5-hidroximetilación así como la disociación de la proteína heterocromatina 1 y el Polycomb represivas complejo de proteínas 2 EZH2 del promotor proximal regiones de estos genes. Reversión de la diferenciación dio lugar a baja regulación de
PAGE2, 2B
y
SPANX-B Opiniones, y la inducción de marcadores epiteliales-a-mesenquimal transición (EMT), lo que demuestra la naturaleza dinámica de la TC la regulación de genes en este modelo
Visto:. Yilmaz-Ozcan S, Sade a, B Kucukkaraduman, Kaygusuz Y, sentidos KM, Banerjee S, et al. (2014) Mecanismos epigenéticos subyacentes a la expresión dinámica de genes del cáncer de testículo,
PAGE2
,
2B
y Transición
SPANX-B Opiniones, durante mesenquimales-a-epitelial. PLoS ONE 9 (9): e107905. doi: 10.1371 /journal.pone.0107905
Editor: Keping Xie, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de mayo de 2014; Aceptado: August 22, 2014; Publicado: 17 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por nr subvención. 112S023 de El Tecnológico Research Council (TÜBITAK) para AOG, un Young Investigator Award de la Academia de Ciencias de Turquía a la SB, la Ciencia y becas y por TUBITAK-BIDEP a SYO y BK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer-testículos (CT) o genes de cáncer de la línea germinal se expresan en tumores procedentes de diversos tejidos, así como en las células de la línea germinal y trofoblásticas normales, pero son generalmente silencio en otros tejidos normales del adulto [1] - [3]. Más de 100 genes diferentes CT pueden ser agrupados de acuerdo a la homología en familias [2]. A pesar de la falta de similitud de secuencia entre los genes de CT de diferentes familias, re-expresión de todos los genes de CT en los tumores se ha asociado con la desmetilación de los residuos de CpG dentro de sus regiones promotoras-proximal [4]. Este mecanismo de regulación de la expresión compartida es muy probablemente la razón de su expresión coordinada en el cáncer [5] - [7]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la desmetilación del ADN se produce en regiones promotoras CT-proximal de genes en el cáncer es desconocido. genes CT muestran en su mayoría un patrón de expresión heterogénea en los tumores [8] - [10]; en contraste con su expresión en testículo, que está delimitada y ordenada [11]. Un estudio en el que se derivan similar y no como las células madre de cáncer de mama fueron asesinados selectivamente, reveló que la expresión del gen CT es generalmente una característica de las células más diferenciadas, no madre [12]. Del mismo modo, en el melanoma, un subgrupo de células con características más epiteliales expresan genes CT, cuando las células con características mesenquimales no [13] hacen. Curiosamente, las células del melanoma pueden cambiar entre estas dos clases de
in vivo
, lo que sugiere que la heterogeneidad del tumor, según la definición de la expresión génica de CT, podría representar una etapa de transición similar a la conmutación entre epiteliales y mesenquimales fenotipos. De hecho, la transición-mesenquimal a epitelial (MET) se asocia con la inducción de la expresión de genes CT [14]. Para definir los mecanismos implicados en la regulación de la expresión génica en el cáncer de CT y durante MET, optamos por estudiar el modelo de diferenciación espontánea Caco-2, que muestra características de MET y EMT durante la diferenciación y desdiferenciación, respectivamente. Nuestros datos revelan que la regulación dinámica de los dos genes CT,
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y
SPANX-B Opiniones en este sistema modelo, implica alteraciones del complejo Polycomb represivas 2 (PRC2) y la proteína heterocromatina 1 ( HP1) de ocupación dentro de sus regiones promotoras-proximal, con cambios concordantes en la TTE expresión y citosina hidroximetilación (niveles HMC).
Métodos
las líneas celulares, inducción de la diferenciación y desdiferenciación
la línea celular Caco-2 se obtuvo de la SAP Enstitüsü (Ankara, Turquía). HCT116 (colorrectal) y las líneas celulares de cáncer de Mahlavu (hepatocelular) se obtuvieron de las Normas LGC, Middlesex, Reino Unido. Una línea celular de cáncer de pulmón (SK-LC-17) fue desde el Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, EE.UU.. Caco-2 células fueron cultivadas en EMEM y otros en RPMI, suplementado con 20% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 1,5 g /L de bicarbonato de sodio y piruvato de sodio 1 mM. Todos los medios de cultivo de células y los suplementos fueron adquiridos de Biochrom AG, Berlín, Alemania. Se utilizaron las primeras células alcanzaron la confluencia día fue designado el día 0. Las células cultivadas en cultivos paralelos para determinar cambios fenotípicos en los días 0, 5, 10, 20 y 30, después de la confluencia. se ha informado de medidas adicionales de diferenciación para las células utilizadas en este estudio en otros lugares [15]. Para inducir la desdiferenciación, las células en el 20º día de diferenciación se separaron y se volvieron a sembrar en torno al 50% de confluencia y el ARN y las proteínas se cosecharon los 5 días siguientes replating.
in silico
análisis de la TC y la EMT
expresión
Los datos de expresión de genes contenidos en GSE1614 [16] fue GC-RMA normalizado usando GeneSpring v. 11.0. la expresión de genes se analizó CT basado en 31 probesets en que corresponden a 23 genes CT a partir de 7 familias (Figura S2). Una interpretación se generó con una lista entidad compuesta de genes relacionados con la EMT como se define por Loboda et al. [17], en tres momentos diferentes. Los genes fueron seleccionados para la validación de entre aquellos para los que las diferencias significativas de la expresión (p & lt; 0,05) fue observada por un modo de prueba ANOVA y corrección de Bonferroni FWER, cuando las células en proliferación se compararon con los de día 15.
cuantitativa RT- PCR
el ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Ambion, Foster City, CA, EE.UU.) y se trató con DNasa I (Ambion, Foster City, CA, EE.UU.). 200 ng de ARN transcrito fue inversa utilizando Revertir-Aid kit de síntesis de la primera cadena de ADNc (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, EE.UU.). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando un ABI 7500 termociclador (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). Todas las reacciones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. TaqMan Expresión Génica ensayos (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizaron para la siguiente: GAPDH (4352934E), SPANX-B (Hs02387419_gH), PAGE2 y 2B (Hs03805505_mH), GAGE (Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1), y MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Green maestro de la mezcla con el tinte de referencia ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para determinar
CDH1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1
y
TAGLN
expresión (Tabla S1) . Las condiciones de ciclación para estos ensayos fueron 50 ° C durante 2 min., 95 ° C durante 10 min., seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 15 seg., 60 a 65 ° C durante 1 min. expresión relativa se calculó por el método ΔΔCt [18]. Todas las muestras se analizaron por triplicado y todos los experimentos se repitieron al menos dos veces.
Análisis
Promotor metilación
ADN genómico se aisló mediante tratamiento de proteinasa K, siguiendo un protocolo de extracción con fenol-cloroformo. tratamiento de bisulfito de 200 ng de ADN genómico se realizó utilizando el kit Zymo metilación del ADN Oro (Zymo Research, Irvine, CA, EE.UU.). Bisulfito de ADN modificado se almacenó a -20 ° C y se utiliza para la PCR dentro de 2 meses. Dos rondas de amplificación de ADN se realizaron con una ADN polimerasa Taq Hot Start (New England Bioscience /ORC, Ipswich, MA, EE.UU.) utilizando un Perkin Elmer 9700 termociclador (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los cebadores usados se dan en la Tabla S1. Los productos de PCR fueron gel extraído utilizando el kit de extracción de gel QIAGEN (Qiagen, Hilden, Alemania) y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ADN del plásmido se purificó utilizando el QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de al menos diez clones, y la secuencia analizados por IONTEK (Estambul, Turquía).
5-hidroximetil citosina análisis
Caco-2 de ADN genómico (ADNg) fue esquilada de ultrasonidos de sonda (30 seg. a 30 seg. apagado, 5 ciclos) para obtener 200-600 pb. fragmentos evaluados por análisis electroforético en gel de agarosa 1%. La inmunoprecipitación se realizó utilizando el kit hMEDIP (Abcam, Cambridge, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. 5 pg de ADN de control, se añadieron en 500 ng de ADNg de usar como un control interno. Los controles positivos y negativos de la kit se incluyeron en todos los experimentos. 2 l del ADN eluido se utilizó como molde para la RT-PCR cuantitativa usando 2 X mezcla maestra SYBR verde con colorante de referencia ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) con los cebadores dados en las Tablas S1 y S2. se controlaron las eficiencias de imprimación. Las condiciones de ciclación fueron 50 ° C durante 2 min., 95 ° C durante 10 min. seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s., 60 ° C durante 1 min. ADN genómico compartida se incluyó en RT-PCR cuantitativa para calcular la entrada%.
inmunofluorescencia microscopía
Las células unidas a portaobjetos de vidrio por centrifugación utilizando el Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) se fijaron inmediatamente en formaldehído al 2% /PBS a temperatura ambiente durante 15 min. Las células fijadas se permeabilizaron en 0,2% de Triton X-PBS durante 10 min. seguido de bloqueo con 1% de BSA en 0,1% PBS-Tween durante 1 hora. Las incubaciones con el anticuerpo primario, diluido a 1:50, se llevaron a cabo durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo secundario se añadió a 1:200, después de un lavado en 0,1% PBS-Tween durante 5 min. por 3 veces, y se incubaron con las células durante 45 min. a temperatura ambiente (véase la Tabla S3 para la lista completa de anticuerpo). las muestras teñidas se montaron con medio de montaje (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) que contenía solución de DAPI. Las líneas celulares utilizadas como controles positivos fueron Mahlavu (PAGE-2, 2B y SPANXB), MDA-MB 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) y SW620 (CDX2, FN1). Los controles negativos eran combinaciones de anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios relacionados con la ONU. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un dispositivo de captura de imágenes AxioCam MRC5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
El análisis de Western
Los lisados celulares (extraído con tampón RIPA) separados en 4-12% Novex Bis geles de tris SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se transfirieron a membranas Immobilon-PSQ (Millipore Corp. Bedford, MA, EE.UU.) con un sistema de transferencia de western Invitrogen (Invitrogen. Carlsbad, CA, EE.UU.). Después del bloqueo con 5% de leche en polvo en 0,02% PBS-T, manchas de transferencia se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. diluciones de anticuerpos primarios fueron 1:1000 para CDX2, fibronectina, vimentina y transgelin, 1:2500 para β-actina y 1:100 para SPANX-B y PAG-2, anticuerpos 2b. HRP conjugado anticuerpo secundario (Abcam, Cambridge, Reino Unido) se utilizó a una dilución 1:5000 y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se detectaron señales utilizando el ensayo de luminiscencia ECL (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.).
Inmunoprecipitación de cromatina
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se llevó a cabo como se describe anteriormente [15]. Brevemente, constituyentes celulares reticulados formaldehído se precipitaron mediante Proten A perlas de sefarosa acoplados a anticuerpos contra EZH2, HP-1 o H3K27m3 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), así como el control específico de isotipo. El ADN precipitado se amplificó utilizando cebadores específicos para
PAGE2
,
-2
o
SPANX-B Opiniones secuencias promotoras (Tablas S1 y S2) debe realizarse después del entrecruzamiento.
resultados
expresión génica durante el CT Caco-2 diferenciación espontánea (Caco-2 SD)
La línea celular de cáncer colorrectal no diferenciadas Caco-2 se somete a la diferenciación enterocytic al llegar a la confluencia
in vitro [19], [20]. la diferenciación progresiva se ha observado hasta 30 días después de la confluencia como se evidencia por la sobre regulación de varios genes de diferenciación asociada incluyendo sacarasa-isomaltasa, fosfatasa alcalina y el antígeno carcinoembryogenic (CEA), (Figura S1) [15]. Un
in silico
el análisis de la expresión génica de CT como se define por 31 probesets en el conjunto de datos GSE1614, que contiene los datos de expresión génica para el modelo SD Caco-2 obtenido durante la diferenciación (en proliferación (2
º día), posterior a la proliferación de indiferenciado (8
º día), y post-proliferación diferenciadas (15
º día)) [16], revelaron modesta sobre regulación de casi todos los genes de TC durante la diferenciación (Figura S2). Elegimos para validar el cambio en la expresión de las familias de genes /genes de seis CT por RT-PCR cuantitativa en la diferenciación de células Caco-2
in vitro
.
GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1