Extracto
Objetivo
Para determinar los patrones de expresión de los reguladores de NF-kB y genes diana en el carcinoma de células renales de células claras (ccRCC), su correlación con la enfermedad de von Hippel Lindau (VHL) mutacional estado, y su asociación con los resultados de supervivencia.
Métodos
Los meta-análisis se llevaron a cabo en las publicaciones de expresión génica ccRCC conjuntos de datos por RankProd, un método estadístico no paramétrico. DEGs con una Tasa de Falso Descubrimiento de & lt; 0.05 por este método se consideraron significativos, y se cruzó con una lista curada de los reguladores y los objetivos de NF-kappa B para determinar la naturaleza y extensión de NF-kappa B desregulación en ccRCC.
Resultados
A altamente -disproportionate fracción (~ 40%;
p Hotel & lt; 0.001) fueron de los reguladores de NF-kB y genes diana a ser de hasta reguladas en ccRCC, indicativo de una elevada actividad de NF-kB en este tipo de cáncer. Un subconjunto de estos genes, que comprende un regulador clave de NF-kB (
IKBKB
) y mediadores establecidos de las células de supervivencia y pro-inflamatorias respuestas NF-kB (
MMP9
,
PSMB9
, y
SOD2
), relacionada con un mayor riesgo relativo, peor pronóstico y la supervivencia global del paciente reducida. Sorprendentemente, los niveles de varios factores de interferón de regulación (IRF) y genes diana interferón también fueron elevados en ccRCC, lo que indica que un "interferón firma 'puede representar una nueva característica de esta enfermedad. La pérdida de la expresión del gen VHL fuertemente correlacionada con la aparición de NF-κB- y firmas de genes de interferón en ambos casos familiares y esporádicos de ccRCC. Como NF-B controla la expresión de los principales nodos de señalización de interferón, nuestros resultados sugieren una relación causal entre la pérdida de la BVS, la elevada actividad de NF-kappa B, y la aparición de una firma interferón durante ccRCC tumorigénesis.
Conclusiones
Estos hallazgos identifican NF-kB y firmas de interferón como características clínicas de ccRCC, proporcionar un fuerte fundamento para la incorporación de los inhibidores de NF-kappa B y /o y la explotación de la señalización de interferón en el tratamiento de ccRCC, y suministran nuevos objetivos de NF-kB para una posible intervención terapéutica en esta patología actualmente incurable
Visto:. Peri S, K Devarajan, Yang DH, Knudson AG, Balachandran S (2013) Meta-análisis identifica NF-kB como diana terapéutica en el cáncer renal . PLoS ONE 8 (10): e76746. doi: 10.1371 /journal.pone.0076746
Editor: Edward W. Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 7 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Peri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Sociedad Americana de Investigación del cáncer Académico Grant (RSG-09-195-01-MPC) a la SB. Fondos adicionales fueron proporcionados por el Centro de Cáncer Fox Chase a través del apoyo institucional del Programa Keystone cáncer de riñón, y por el NIH otorga N01 CN-95037 y P30 CA 06927. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los carcinomas de células renales (CCR) representan alrededor del 3% de todos los cánceres en adultos, y causa 116.000 muertes en el mundo ~ anuales [1]. Se han descrito varios subtipos histológicos de RCC, incluyendo cromófobo, papilar y de células claras, de los cuales la variante de células claras (ccRCC) representa el ~ 85% de todos los casos de CCR [2,3]. ccRCC en etapa temprana es generalmente curable mediante cirugía, y los pacientes diagnosticados con masas renales localizadas de & lt; 4 cm. tienen un excelente pronóstico [4]. ccRCC es, sin embargo, una enfermedad en gran parte asintomáticos, y aproximadamente un tercio de todos los pacientes presentan cáncer localmente avanzado o metastásico, en el momento del diagnóstico. En contraste con ccRCC en etapa temprana localizada, ccRCC avanzada es una, resistente a la quimioterapia del cáncer letal [1,5].
Avanzado ccRCC se trata principalmente por los enfoques farmacológicos de pequeñas moléculas. opciones de primera línea incluyen la tirosina cinasa sunitinib inhibidores y sorafenib, y los inhibidores de mTOR temsirolimus y everolimus. Estos agentes, sin embargo, sólo proporcionan beneficios a corto plazo al retrasar la progresión de la enfermedad, y no son curativos [6-8]. Además, tales agentes requieren la administración continua, la exposición de los pacientes a efectos secundarios significativos [7,9]. Por lo tanto, el tratamiento del CCR metastásico sigue siendo un reto terapéutico en la necesidad de nuevas opciones.
Una característica genética de ccRCC es la inactivación de la enfermedad de von Hippel Lindau (VHL) gen supresor de tumores [10]. La
VHL
gen se inactiva ya sea por mutación o hipermetilación en hasta el 90% de los casos esporádicos ccRCC [10-12]. En su rol describe mejor, pVHL, el producto de la
BVS
gen, funciona como parte de un complejo ubiquitina ligasa E3 de degradación que controla estrechamente los niveles de proteína de factor inducible por hipoxia (HIF), un factor de transcripción y maestro regulador de la respuesta celular a la hipoxia [11,13]. Cuando pVHL está ausente, HIF se acumula incluso en condiciones de normoxia, e inapropiadamente transactivates expresión de sus genes diana. Tantos objetivos como FIS son potentemente tumorigénico, mala expresión de los genes diana HIF se consideran los orquestadores primarias de
BVS
progresión tumoral ccRCC-deficiente, y las vías de orientación aguas abajo de HIF (por ejemplo, la señalización de VEGF) representa un enfoque farmacológico primaria para el tratamiento de RCC [11].
Además de regular HIF, pVHL se ha demostrado en varios estudios de cultivo de células para controlar también la actividad del factor de transcripción NF-kB [14]. Cuando se pierde la expresión pVHL (o ablación de RNAi), la actividad de NF-kB es elevado; por el contrario, la reintroducción de pVHL en
BVS
células RCC-null disminuye la actividad de NF-kB [15-17]. Estas observaciones tienen importantes ramificaciones clínicas. En primer lugar, como NF-kappa B (como HIF) es un regulador central de las respuestas inflamatorias y células de supervivencia, es muy probable que la elevación de la señalización de NF-kappa B después de la pérdida pVHL contribuirá a pasos en la génesis, la progresión, la supervivencia y /o propagación de ccRCC. En segundo lugar, si NF-kappa B es, de hecho, elevados en los tumores ccRCC - y no sólo en líneas celulares de RCC - a continuación, la orientación NF-B proporciona una nueva e interesante opción terapéutica para ccRCC avanzada. A este respecto, los estudios iniciales han demostrado que la inhibición de molécula pequeña de NF-kappa B sensibiliza a las células ccRCC de otra manera resistentes a (1) la actividad tumoricida de los inhibidores de EGFR, (2) apoptosis por el TRAIL citoquina anti-tumor, y (3) oncolisis por virus de la encefalomiocarditis [14,18-21]. Por estas razones, la obtención de información sobre la naturaleza y el alcance de NF-B de la desregulación en los tumores ccRCC se convierte en un objetivo importante.
inició este estudio para determinar a través bioinformático a gran escala se aproxima a la prevalencia de NF-kB desregulación transcriptómica en muestras ccRCC derivados del paciente. A partir de estos análisis, se ha encontrado que NF-kappa B parece ser constitutivamente activa en un alto porcentaje de casos ccRCC, y que un número desproporcionado de los reguladores y los objetivos de NF-kappa B (el ccRCC 'firma NF-kappa B') pantalla constantemente elevados de expresión en ccRCC, en comparación con el tejido renal normal. La investigación adicional reveló también la presencia de un robusto 'interferón (IFN) firma' en ccRCC. Se demuestra que la aparición de las dos firmas NF-kappa B e IFN son bien correlacionada con el estado mutacional VHL, e identificar un subconjunto clave de los reguladores y objetivos cuya expresión elevada se correlaciona con un mayor riesgo relativo NF-kB, pronóstico más pobre, y reduce en general supervivencia en ccRCC. En conjunto, estos resultados indican que los niveles elevados de señalización NF-kB y el IFN puede representar características comunes de ccRCC pVHL-negativas, y proveer razón para la orientación NF-kB en esta enfermedad.
Materiales y Métodos
ética declaración
el uso de muestras de tejidos humanos de pacientes en el Centro de cáncer Fox Chase fue aprobado por el Fox Chase Junta de Revisión Institucional. consentimiento informado por escrito, aprobado por el comité de ética, se obtuvo para el uso de estas muestras.
La inmunohistoquímica
Un microarray de tejido del riñón (TMA), que contiene las rebanadas duplicadas de 20 tumores ccRCC y 8 normales los riñones, se construyó a partir de archivos de formalina fijo, las muestras de pacientes Fox Chase Cancer Center incluidos en parafina. secciones de tejido de TMA se cortaron con un espesor de 5 micras, por deparaffinized xileno y se rehidrataron en la disminución de la concentración de etanol. La recuperación del antígeno se consiguió mediante ebullición secciones en tampón de citrato 10 mM durante 20 minutos. Después del bloqueo de la peroxidasa endógena con 3% de peroxidasa de hidrógeno en metanol, las secciones se incubaron con el fondo de francotirador (Biocare médico) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las secciones se incubaron junto con anticuerpos primarios, NF-kB (Señalización Celular) en la dilución de 1: 500, y STAT1 (BD Biosciences) a una dilución de 1: 100, a 4 ° C durante la noche. Después de lavar en PBS, las secciones se incubaron con Etiquetada Polymer-HRP anti-conejo y anti-ratón (DAKO) anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h, se expusieron a diaminobencidina solución tetrahidrocloruro, y de contraste con hematoxilina. Después de la deshidratación en concentraciones crecientes de etanol y la limpieza en xileno, las secciones se montaron en Permount. Las imágenes fueron tomadas en un microscopio Nikon Eclipse E600 con el software de NIS Elementos D3.0.
El metanálisis
Para los metanálisis, se compiló una lista de los estudios publicados RCC de la expresión de genes de Omnibus ( GEO) o ArrayExpress (Tabla S1), cuyos datos fueron (i) se crean usando plataformas de Affymetrix U133A, U133B, y U133Plus2; (Ii) anotado con precisión cuando se deposita en bases de datos; y (iii) contenido controles de tejido normal. Para los estudios que emplean los chips U133A y U133B, sólo se consideran aquellas que perfila las muestras en ambos
& Chips; esto maximiza el número de genes disponibles para la posterior meta-análisis. Los datos en bruto se normalizaron mediante robusta gama Multi-media (RMA) [22]. En los casos en que se perfilan las muestras en dos plataformas diferentes (por ejemplo, Affymetrix U133A y U133B), sonda fija con una mayor expresión de los valores fueron seleccionados en caso de múltiples conjuntos de sonda asignan a un mismo gen significan. Los conjuntos de datos se basan en vez fusionada símbolo de genes utilizando el paquete MergeMaid (http://astor.som.jhmi.edu/MergeMaid) disponible a través de Bioconductor [23]. Los meta-análisis se llevaron a cabo utilizando el método RankProd [24], un método estadístico no paramétrico, que utlilzes filas de los genes expresados diferencialmente (DEGs) entre los diferentes estudios para generar una lista de DEGs entre dos condiciones (por ejemplo, ccRCC vs. normal). El significado de la expresión diferencial de genes se calcula entonces basándose en el porcentaje de falsos positivos predicciones (es decir, la tasa de falso descubrimiento, o FDR). Para este estudio, se seleccionaron las listas de DEGs en base a un FDR de 0,05 (5%), calculado sobre la base de 10000 permutaciones. Para definir las firmas NF-kB y IFN, curada NF-kappa B y los genes de IFN se cruza con DEGs hasta reguladas. Para examinar firmas NF-kB y IFN en las muestras con la inactivación mono- o bialélico de
VHL
, DEGs se calcularon utilizando LIMMA [25] y los datos de RMA-normalizados. Nuestra metodología se resume en el diagrama de flujo presentado en la Figura S1
El análisis de supervivencia
La expresión génica y de los datos de supervivencia disponible para 55 pacientes ccRCC en la base de datos TCGA (https:. //tcga-data.nci se utilizó para la supervivencia .nih.gov /TCGA /) analiza el uso de riesgos proporcionales de Cox univariante (PH) y modelos acelerado Tiempo de fallo (AFT) [26]. Se realizó una prueba de bondad de ajuste (GOF) del modelo PH Cox [27]. Mientras que el modelo PH Cox supone implícitamente que las curvas de supervivencia de peligro y que corresponden a dos valores diferentes de una covariable no se cruzan, el modelo AFT permite el cruce de las curvas [28,29] y es responsable de no proporcionalidad de los riesgos (o riesgo de muerte ) en los dos grupos. Todas las pruebas fueron de dos caras y utilizan un error de tipo I de 0,05 para determinar la significación estadística. Además de la
p
-valores para cada modelo de ajuste, respectivamente, se utilizaron las estimaciones del riesgo relativo (RR) de la PH Cox y coeficiente (β) de los modelos AFT para determinar la magnitud de la asociación entre la expresión génica y la supervivencia global. Una estimación del RR en exceso de 1 o una estimación negativa de β indica mal pronóstico con el aumento de la expresión. Para visualizar la asociación de los niveles de expresión de genes con la supervivencia global, los perfiles de expresión de genes individuales se dicotomizaron por medio de división en grupos de "alto" o "bajo" de expresión, y las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se trazan para cada grupo. Los cálculos se realizaron utilizando los paquetes
la supervivencia y
lss
en el lenguaje estadístico R y el medio ambiente (http://www.r-project.org).
Resultados
El metanálisis identifica NF-kB desregulación en ccRCC
Si bien el examen de un conjunto de datos de microarrays de ADN a disposición del público de ccRCC y muestras normales apareadas [30,31], nos dimos cuenta de que varios ARNm del gen diana NF-kB establecidos se sobre-expresan en muestras ccRCC, en comparación con sus controles normales. Teniendo en cuenta las consecuencias terapéuticas de estas observaciones, hemos tratado de determinar si NF-B es constitutivamente activa en ccRCC. tanto, nuestro estudio especímenes ccRCC derivados del paciente para la localización nuclear de la clásica NF-kB sub-unidad de RelA /p65. Nos centramos en de RelA /p65, ya que los estudios anteriores han demostrado que de RelA-que contienen complejos diméricos son la forma dominante de NF-kappa B en líneas celulares ccRCC, y que estos complejos re-localizar desde el citoplasma al núcleo cuando está activo [32-34 ]. De 20 muestras distintas ccRCC examinados, 16 (80%) muestra robusto tinción nuclear de RelA de en & gt; 50% de las células, indicativo de la actividad constitutiva de NF-kappa B en estas células. Otros dos casos mostraron débil tinción nuclear en & lt; 20% de las células, y otras dos personas manifiestan ninguna señal de RelA detectable en el núcleo. Por el contrario, ninguno (0/8) de las secciones renales normales examinados muestra detectable tinción de RelA nuclear. Un ejemplo típico de una intensa tinción de RelA nuclear en ccRCC - pero no en el tejido renal normal - se muestra en la Figura 1a; en cuenta que las células normales del epitelio tubular proximal, de la que se piensa ccRCC a surgir, mostrar evidencia de
citoplasmática
de RelA (Figura 1a, flechas). Estos resultados sugieren que constitutivamente activa nuclear NF-kappa B puede ser una característica común en ccRCC, quizás como consecuencia de la activación de NF-kB en el epitelio tubular durante RCC tumorigénesis.
(a) que muestra tinción inmunohistoquímica prominente señal de RelA nuclear en muestras ccRCC, pero no en tejido renal normal. La flecha indica la tinción citoplásmica de RelA en las células del epitelio tubular proximal. Barra de escala = 100 mM. (B) arriba de los genes regulados (eje X) de la meta-análisis de los cuatro conjuntos de datos ccRCC se representaron frente a la tasa de falsos descubrimiento (FDR, eje Y). Hasta reguladas genes con FDR & lt; 0.05, se muestra en rojo, se utilizaron para definir NF-kB y IFN firmas. (C) Heatmaps que muestra la expresión de genes de la firma NF-kB en cada uno de los cuatro estudios que se indican. N = normal, T = tumor. los niveles de calor bar = expresión (log
2 escala).
Para investigar el grado de NF-kB desregulación meta-gen en ccRCC, primero se definió una lista de genes cuya expresión se sabe que regular y /o ser regulados por NF-kB. Razonando que aberrante actividad de NF-kappa B se refleja en la expresión alterada de estos genes, se combina una lista a disposición del público de los anotados genes diana NF-kB [(HUhttp: //bioinfolifl.fr/NF-KBUH, basado en gran medida en [ ,,,0],35]] con nuestros propios conjuntos de datos [36,37] para comisariar un total de 137 genes (Tabla S2) que se sabe que regulan NF-kappa B, cuyos promotores contener sitios putativos /validado NF-kB de unión, y /o cuya expresión tiene Se ha demostrado que dependen de la actividad de NF-kB en diversos contextos.
a continuación examinó mediante meta-análisis de los perfiles de expresión de estos 137 NF-kB genes diana en transcriptomic datos de todo el genoma de 61 ccRCC y 34 muestras normales a través de cuatro estudios independientes que nos referimos aquí por los nombres de sus primeros autores:.. Cifola, Gumz, Lenburg y Yusenko [31,38-40] los criterios para la selección de estos estudios se resumen en la Figura S1 para este meta-análisis, utilizamos RankProd, un método estadístico no paramétrico capaz no sólo de integración de datos de una variedad de plataformas, sino también de manejo de la variabilidad experimental entre conjuntos de datos [24]. De ~ 18.000 genes examinados en total, 3.560 resultaron ser uniformemente hasta reguladas en ccRCC (Figura 1b), mientras que 2.797 genes fueron consistentemente el regulado, a una tasa de falsos descubrimiento (FDR), de ≤ 0,05. De éstos, 58 genes (~ 42% de todos los objetivos curada NF-kappa B) fueron reguladas en muestras ccRCC, en comparación con los controles normales. La relación de los genes NF-kappa B hasta reguladas en ccRCC (58/137) es altamente significativo, (
p-valor
& lt; 0,001 proporción, una cola
Z
-test), cuando se compara con el porcentaje de todos los genes hasta reguladas en ccRCC (3560/17997; ~ 20%). Por el contrario, tres veces menor número de genes diana NF-kB (18 genes, que representan el 13% de los objetivos NF-kB) se redujeron regulado en ccRCC; esto se considera no significativa (p-valor = 0,74). Los resultados de este análisis indican que las muestras ccRCC muestran selectiva elevado uniformemente-expresión de un subconjunto de NF-kB genes diana,. Designamos estos genes del ccRCC 'NF-kB del gen de la firma'. La figura 1c muestra los perfiles de expresión génica de la firma NF-kB en cada uno de los cuatro estudios
La firma genética ccRCC NF-kB fue clasificable en cuatro categorías distintas:. Pro-inflamatorias, células de supervivencia, NF reguladores kB, y, sorprendentemente, reguladores de interferón (Tabla S3). La mayoría de los objetivos NF-kB hasta reguladas eran pro-inflamatorias (43/58). De los genes restantes, siete estaban implicados en la supervivencia celular, y cinco fueron de alimentación hacia adelante o reguladores de retroalimentación de la propia respuesta NF-kB. Inesperadamente, tres objetivos NF-kB (
IRF1, IRF2
, y
IRF7
) constantemente hasta reguladas en todos los especímenes ccRCC factores reguladores de interferón codificado (IRF), una familia de factores de transcripción asociados típicamente con la respuesta innata inmune mediada por interferón a las infecciones microbianas [41]. los perfiles de expresión individuales de dos genes representativos de cada categoría se muestran en la Figura 2. Estos resultados identifican dentro de la firma ccRCC NF-kB varios mediadores bien establecidos de las respuestas pro-inflamatorias y células de supervivencia NF-kB, así como una inesperada subconjunto de los reguladores de IFN.
(a) los genes de la célula de supervivencia
BCL2
y
SOD2
, (b) los genes proinflamatorios
CCL5
y
ICAM1
, (c) reguladores de NF-kappa B
NFKB1
y
TNFAIP3 Opiniones y factores de regulación (d) de interferón
IRF1
y
IRF7
. Los datos se normalizaron utilizando RMA. Los factores de cambio de tumor (T) frente a la comparación normal (N) se obtuvieron por LIMMA. Eje Y muestra el nivel de expresión de RMA-normalizada (en registro
2 escala) de cada ARNm. cajas azules representan los niveles de expresión de genes en el tejido normal, y el rojo representa la expresión en ccRCC. La línea blanca dentro de cada cuadro es la mediana, y la distancia entre la caja y bigotes indican rangos intercuartil. Cada uno de los cuatro gráficos por gen representan los perfiles de expresión en las matrices generadas por (de izquierda a derecha) los estudios Cifola, Gumz, Lenburg, y Yusenko.
Una firma interferón en ccRCC
intrigado por la observación de que la FIC-codificación de los genes fueron reguladas en ccRCC, la hipótesis de que, además de la elevada actividad de NF-kappa B, células ccRCC pantalla probabilidades aumentaron tipo tónico I (α /β) de señalización IFN. Tres observaciones publicadas subyacen a esta hipótesis. En primer lugar, los genes que codifican los FIR 1,2, y 7, además de ser objetivos NF-kB, también son bien descritos genes estimulados con IFN (ISGs) [42,43]. En segundo lugar, la mayoría de las células mantienen bajos niveles de señalización de IFN I (/β α) autocrina tipo, aparentemente en preparación para las infecciones por virus aguda [44-46]. En tercer lugar, hemos informado anteriormente de que constitutiva de señalización NF-kB es necesaria para el mantenimiento de la señalización autocrina IFN [36,44]. En conjunto, estas observaciones nos permiten proponer un modelo en el que elevó la señalización NF-B 'rampas hasta "tipo I IFN tónica de señalización, que a su vez aumenta la expresión de ISGs (como
FRI
) en ccRCC.
para probar este modelo, se examinaron muestras de RCC para hiperactivo tipo tónico I IFN señalización. Como medida directa de tipo tónica I IFN niveles en el tejido no infectado es difícil y poco fiable [36], que en vez examinado consecuencia aguas abajo de IFN activo: localización nuclear del factor de transcripción sensible IFN-clave STAT1. Como el propio NF-kappa B, STAT1 es normalmente citoplasmática cuando está inactivo, pero rápidamente se transloca al núcleo para dirigir la expresión ISG en IFN estimulación [47]. Si la señalización de IFN se eleva constitutivamente en RCC, se espera que el STAT1 para localizar al núcleo en RCC - pero no es normal - tejido. Hemos encontrado que las muestras de RCC 16/20, pero ninguno de los especímenes normales del riñón (0/8) - Cuando aparece una fuerte tinción nuclear STAT1 (Figura 3a). Sorprendentemente, y de acuerdo con una relación de causalidad entre la elevación de señalización NF-kB y el aumento de la actividad tónica IFN, totalmente 100% de las muestras positivas ccRCC RelA nucleares también fueron positivos para STAT1 nuclear.
(a) inmunohistoquímicos tinción que muestra robusta señal STAT1 nuclear en muestras ccRCC, pero no en tejido renal normal. (B) Mapa de calor que muestra la expresión de los genes de la firma IFN después de la estimulación con IFN de fibroblastos embrionarios murinos. Calor bar = factor de cambio (log
2 escala). Los niveles de expresión de las células no tratadas se establecieron arbitrariamente a 1 (beige). (C) Heatmaps que muestra la expresión de genes de la firma de IFN en cada uno de los cuatro estudios que se indican. N = normal, T = tumor. los niveles de calor bar = expresión (log
2 escala).
Se identificaron a partir de nuestro trabajo previo [36] con un total de ~ 400 genes que son inducidos al menos dos veces por los IFN tipo I (Figura 3b), para el cual los datos de expresión también estuvieron presentes en los cuatro estudios ccRCC. Cuando se analizó la expresión de estos ISGs en conjuntos de datos ccRCC, se encontraron un total de 164 ISGs ser hasta reguladas en ccRCC (~ 40% de todos los ISGs probados, valor de p & lt; 0,001 por una cola Z-test proporción) , mientras que sólo 51 ISGs fueron regulados hacia abajo [~ 13%, valor p = 0,94]. Estos resultados indican que, al igual que con el tipo de NF-kB, constitutivamente elevados de IFN-I de señalización se produce en ccRCC. El 164-gen "firma genética de IFN 'aparece en la Tabla S4, y su perfil de expresión en cada uno de los cuatro estudios individuales se muestra en la Figura 3c.
A continuación utiliza el análisis Ingenuity Pathways para construir una red que lo haría identificar las relaciones inter-moleculares entre NF-kB y firmas de genes IFN. Este análisis reveló una conectividad robusta entre NF-kB y firmas de IFN-β a través de IFN (codificada por
IFNB1
) y los nodos de IRF (Figura 4). Se observaron Como era de esperar, pro-inflamatorias y células de supervivencia agrupaciones dentro del brazo de NF-B de la red, mientras que numerosos mediadores inmunes innata-bien establecidas estaban representados en el brazo de la firma IFN (Figura 4). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan una relación causal entre el NF-kB y IFN firmas mediadas por la señalización de IFN /IRF autocrina
La red fue construida por el software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, HUhttp: //www.. ingenuity.comUH) utilizando todos los genes en las firmas NF-kB y IFN. grupos clave de NF-kB (marrón) e IFN (azul) se identifican los brazos, y las moléculas de reguladores que controlan los nodos de la red de genes se muestran como círculos grandes.
BVS estado mutacional se correlaciona con la expresión de NF firmas kappa B e IFN
los resultados de los estudios de cultivos celulares sugieren una relación causal entre la ausencia de la proteína pVHL funcional y la elevada actividad de NF-kB en ccRCC [15-17]. Teniendo en cuenta estas observaciones, nos preguntamos si el estado mutacional de
BVS
correlacionada con la aparición de NF-kB y IFN firmas en ccRCC. Para este análisis, se compararon con sus respectivos controles normales (1) cultivos de células epiteliales de las lesiones renales pre-neoplásicas de seis casos familiares de pacientes con VHL que albergan una copia funcional de
BVS
[48], (2) ccRCC tejido de 32 casos familiares de biallelically inactivado
BVS
[49], y (3) el tejido ccRCC de 20 casos esporádicos de biallelically inactivado
BVS
[49]. Encontramos que ni firmas NF-kB ni IFN estaban presentes en los pacientes con una copia funcional de
BVS
. Por el contrario, las muestras ccRCC albergar la pérdida bialélicas BVS (ya sea familiar o esporádico de origen) que se muestra sólida expresión de ambas firmas NF-kB y IFN (Figura 5). Estos datos proporcionan un fuerte apoyo a la idea de que la inactivación de la BVS está probablemente ligado causalmente a la aparición de una elevada actividad de NF-kB y el IFN en ccRCC.
Heatmaps que muestra los factores de cambio en los niveles de expresión de los genes de la firma NF-kB ( a) o IFN firma genes (B) entre la BVS +/- muestras de casos de la enfermedad de VHL familiar en comparación con
VHL
+ /+ epitelio renal normal (columna 1); VHL - /- casos de ccRCC familiar comparación con el tejido renal normal (columna 2); o VHL - /- casos de ccRCC esporádica comparación con el tejido renal normal (columna 3). barra de calor = factor de cambio (log
2 escala).
La expresión elevada del subconjunto de los objetivos de NF-kappa B se correlacionan con un peor pronóstico en pacientes ccRCC
Para determinar si el aumento la actividad de NF-kappa B se asoció con resultados de supervivencia pobres en ccRCC, se analizó la correlación entre la expresión de los genes en nuestra firma NF-kappa B y la supervivencia global de los pacientes 55 ccRCC cuya expresión génica y la supervivencia de datos estaban disponibles en el Genoma del cáncer Atlas (TCGA) . A partir de este análisis, se encontró que la expresión elevada de los cuatro reguladores de NF-kB y genes diana (
IKBKB
,
MMP9, PSMB9
, y
SOD2
) se asoció significativamente con de mayor riesgo relativo (RR), peor pronóstico y la supervivencia global del paciente reducida por el modelo PH Cox (
p-valor
& lt; 0,05, RR & gt; 1) o por el modelo AFT (
p
-valor & lt; 0,05 o coeficiente β & lt; 0; ver Métodos). Estos cuatro genes comprenden un regulador clave de la señalización NF-kB en sí (
IKBKB
) y mediadores establecidos de las NF-B-célula de supervivencia y pro-inflamatorias respuestas (
MMP9, PSMB9
, y
SOD2
), elevando la excitante posibilidad de que los miembros de orientación selectiva de este subgrupo tendrán el beneficio clínico en ccRCC. La Figura 6 presenta las curvas de Kaplan-Meier para estos genes y el cuadro S5 se resumen los resultados de estos análisis.
Kaplan-Meier de supervivencia para los genes en la firma NF-B, cuyo aumento de los niveles de expresión se correlacionan significativamente con una peor supervivencia global se muestra el resultado. los perfiles de expresión de genes individuales se dicotomizaron por medio de división en "alto" (rojo) o (azul) grupos "bajos" de expresión. Gene nombres se indican encima de cada gráfico. Por favor, véase el cuadro S5 para
p-valores
.
Es de destacar que el aumento de expresión de un quinto gen (
NFKB1
, que codifica la subunidad NF-kB p105 /p50) también se asoció significativamente con una peor supervivencia global por el modelo AFT (
p-valor = 0,041
). Sin embargo, un coeficiente de valor positivo β (33.6) y la falta de significación por el modelo de Cox PH (p-valor = 0,41; RR = 0,5) nos impide a aclarar su asociación con la progresión ccRCC, por lo que nos centramos en
IKBKB
,
MMP9, PSMB9
, y
SOD2
.
Discusión
En este estudio, hemos determinado que NF-kB es constitutivamente activo en la mayoría de las muestras ensayadas ccRCC, y han demostrado por meta-análisis que clave reguladores y objetivos de NF-KB son uniformemente hasta regulado a través de cuatro estudios independientes. Nos informan también el descubrimiento de una firma de IFN en ccRCC, y proporcionan evidencia convincente de que la pérdida de la función de VHL es necesario que ambas firmas NF-kB y IFN. Por último, se identifica un subconjunto de potencialmente druggable los reguladores y los objetivos de NF-kappa B cuya expresión elevada se correlaciona con mal pronóstico y la supervivencia. Es de destacar que la falta de disponibilidad de los datos del paciente nos no puede examinar si el NF-kappa B y /o firmas de IFN correlacionados con ccRCC etapa /grado.
Aunque la supervivencia mediada por NF-kB señalización probablemente evolucionó para proteger las células de flujo mitocondrial inherente a las respuestas fisiológicas normales (por ejemplo, durante las respuestas anti-microbianas de citoquinas impulsada), varias observaciones hacen que sea posible que la respuesta de la supervivencia celular NF-B ha sido usurpada por las células tumorales para promover su propia viabilidad. Por ejemplo, el miembro fundador de la familia NF-kappa B - el gen retroviral aviar
v-Rel - es un
de buena fe
oncogenes y genes que codifican subunidades de NF-kB de señalización y visualización la activación de mutaciones en varios tumores [revisado en [50 a 52]]. NF-kB objetivos-supervivencia celular codifican enzimas antioxidantes que protegen las mitocondrias durante los momentos de mayor demanda bioenergética, así como otras proteínas (tales como los miembros Bcl-2 de la familia Bcl-X
L y Bfl-1) que impiden activamente mitocondrias de inducir la muerte celular durante genotóxico y metabólica esfuerzos inherentes al proceso de la tumorigénesis [51,52].
Pérdida de pVHL se ha demostrado que el resultado en un aumento de la actividad de NF-kappa B, lo que indica que la activación de NF-kB puede representar una consecuencia común aguas abajo de
BVS
-deficiency [15-17,33]. Los laboratorios Kaelin y Rettig han proporcionado una visión mecanicista en la deficiencia de cómo pVHL en aumento de la actividad de NF-kB mediante la aclaración de dos vías distintas de la regulación de NF-kB pVHL-dependiente. Kaelin y sus colegas identificaron el activador de NF-kB CARD9 como una proteína que interactúa con pVHL, y demostraron que pVHL promueve la fosforilación inhibitoria de CARD9 por la quinasa CK2. La ablación de la expresión pVHL aumentó la actividad de NF-kB impulsado por CARD9, mientras que la supresión de la expresión normalizada CARD9 la actividad de NF-kB en la configuración de RCC pVHL deficientes [17]. En paralelo, An y Rettig determinó que la pérdida de pVHL, a través de un bucle autocrino HIF → EGFR, los resultados en el aumento de la actividad de NF-kB en ccRCC [16]. Ambos mecanismos se conectan deficiencia pVHL a elevada actividad NF-kappa B y proporcionan explicaciones bioquímicas para nuestra observación de que intensifica NF-kB se correlaciona bien con el estado mutacional VHL.
Un resultado inesperado de este estudio fue el descubrimiento que caracteriza a una firma IFN ccRCC. La explicación más simple para esta firma es que es la consecuencia directa de la elevada actividad NF-kB. Estamos a favor de esta explicación de las razones por las que (1) los genes que codifican los nodos clave del sistema, incluyendo el IFN-β IFN y la FIC-7, contener sitios de NF-kB funcionales en sus promotores [53,54], y la activación de NF-sencillo kappa B puede conducir estos promotores [43,54]; (2) una 1: No se encontró correlación entre las muestras 1 ccRCC que contenían nuclear NF-kappa B y los que muestran STAT1 activado, y (3) la firma IFN colapsa en las células que carecen de la subunidad de RelA NF-kappa B (Figura 7a).