Extracto
la metástasis del cáncer es un proceso complejo que implica interacciones célula-célula mediadas por moléculas adhesivas celular. En este estudio se determina la fuerza de adhesión entre una endoteliales células monocapa celular y tumorales de diferentes potenciales metastásicos utilizando microscopía de fuerza atómica. Se demuestra que las fuerzas de ruptura de enlaces ligando-receptor aumentan con la velocidad de retracción y el rango entre 20 y 70 pN. Se muestra que las líneas celulares más invasoras (T24, J82) forman los lazos más fuertes con las células endoteliales. El uso de sustratos de ICAM-1 con recubrimiento y un anticuerpo monoclonal específico para la ICAM-1, se demuestra que la ICAM-1 sirve como un receptor clave en las células endoteliales y que sus interacciones con ligandos expresados por las células tumorales se correlacionan con las fuerzas de rotura obtenidos con los más las células cancerosas invasoras (T24, J82). Para las células de cáncer menos invasivas (RT112), endoteliales ICAM-1 no parece desempeñar ningún papel en el proceso de adhesión. Por otra parte, un análisis detallado de la distribución de las fuerzas de ruptura sugiere que ICAM-1 interactúa preferentemente con un ligando en las células cancerosas T24 y con dos ligandos en células de cáncer de J82. receptores de contador posibles para estas interacciones son CD43 y MUC1, dos ligandos conocidos para ICAM-1 que se expresan por estas células de cáncer
Visto:. Laurent VM, Duperray A, Sundar Rajan V, Verdier C (2014) Atómica Microscopía de fuerza revela un papel para células endoteliales ICAM-1 de expresión en el cáncer de vejiga adherencia de las células. PLoS ONE 9 (5): e98034. doi: 10.1371 /journal.pone.0098034
Editor: Andrew Pelling, Universidad de Ottawa, Canada |
Recibido: 21 Enero, 2014; Aceptado: 28 de abril de 2014; Publicado: 23 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Laurent et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Las fuentes de los fondos que han apoyado el trabajo son Nanociencias Fundación, ANR Transmig, la Ligue contre le cancer, LABEX Tec21. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
interacciones adhesivas de las células cancerosas con el endotelio son acontecimientos clave en el proceso de metástasis (es decir, la dispersión de las células cancerosas de un órgano a otras partes del cuerpo) [1], [2]. Durante la formación y el crecimiento de los tumores, las células cancerosas logran escapar de tumores primarios y penetrar en el flujo sanguíneo, por lo tanto puede viajar a través de largas distancias. En sitios distantes en el cuerpo humano, las células cancerosas interactúan con el endotelio, se adhieren y, finalmente, extravasate, es decir, migrar a través de la barrera endotelial. Los leucocitos y las células cancerosas utilizan mecanismos similares para interactuar con las células endoteliales (EC), pero mientras que los fenómenos de adhesión y migración de leucocitos a través del endotelio ha sido particularmente estudiada durante la inflamación, pocos resultados están disponibles con respecto al papel de las moléculas clave implicadas en el la adhesión y la transmigración de las células del cáncer [1], [3], [4], [5].
al igual que en el reclutamiento de leucocitos, la inmovilización y el balanceo de las células tumorales (CT) en el endotelio se han demostrado para algunos las células de cáncer y están mediados por las selectinas. Después de esta interacción inicial, la adhesión firme tiene lugar, mediada por varias moléculas de adhesión celular que pertenecen a la familia de las integrinas [6], así como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) de la familia de las inmunoglobulinas, lo que lleva a la invasión del tumor [7], [8]. VCAM-1 se expresa por el endotelio después de la estimulación, e interactúa con la integrina α4β1, mientras que la ICAM-1 se expresa por ECs, leucocitos y algunas operaciones de cooperación técnica, y se puede upregulated por citoquinas inflamatorias. ICAM-1 está implicada en la adhesión de leucocitos al endotelio a través de sus interacciones con Mac-1 integrinas de leucocitos (β2 integrina LFA-1) y. Comunidades terapéuticas carecen de integrinas beta 2, pero los neutrófilos puede actuar como un puente entre las comunidades terapéuticas y los EC, con LFA-1 en los leucocitos se unen a ICAM-1 expresado en tanto endotelial y TCS [5]. Además, ICAM-1 es un receptor para otras moléculas, tales como CD43 [9] y MUC1 [10], que se expresan por algunos TCs.
progresión del cáncer se asocia con alteraciones en la expresión de un poco de pegamento moléculas. Algunas obras investigaron la relación entre la expresión N-cadherina y la progresión de la malignidad del tumor [11], [12]. Un aumento de la invasividad de células de cáncer se combina con conmutación de E-cadherina por N-cadherina y un aumento en la expresión de algunos subunidades de integrina [13]. Desde un punto de vista cuantitativo, la comparación de las propiedades adhesivas en células de la vejiga epiteliales no malignas y malignas han demostrado que un nivel de N-cadherina mejorada en las células malignas T24 fue acompañada por cambios en las propiedades no vinculante de moléculas de N-cadherina individuales [14] . Además, la expresión de ICAM-1 se ha asociado con un fenotipo más agresivo tumor [15], [16]. Sin embargo, los ligandos que intervienen en la adhesión firme de TC no se han definido aún la forma más clara para los leucocitos, y la cuantificación de tales interacciones adhesivas entre las EC y las células cancerosas no se ha investigado hasta ahora.
La información cuantitativa sobre la fuerzas de adhesión celular pueden obtenerse utilizando diferentes técnicas de espectroscopia de fuerza: la sonda de fuerza bio-membrana [17], pinzas ópticas [18] y el microscopio de fuerza atómica (AFM) [19]. Todas estas técnicas que operan bajo un microscopio óptico permiten visualizar las células y al mismo tiempo medir las fuerzas de adhesión de unos pocos pN a unos cientos de pN o más. En este trabajo, hemos optado por utilizar el modo de espectroscopia de fuerza de una sola célula de la AFM para estudiar las interacciones célula-célula que participan en la adhesión de las comunidades terapéuticas sobre las CE. En contraste con otros métodos de fuerza de adhesión, esta técnica permite realizar mediciones en una configuración cerca del
in vivo
situación. Una célula cancerosa está unida a un voladizo suave y se pone en contacto con un EC-monocapa y la señal de fuerza se controla gracias a la deflexión AFM voladizo [19], [20]. La señal también permite la detección de eventos como posibles rupturas de enlaces ligando-receptor, así como la fuerza de adhesión mundial a nivel celular.
Determinación de las interacciones célula-célula se llevó a cabo para diferentes velocidades de retracción en voladizo para estudiar cómo fuerza de ruptura (que participan en uniones adhesivas entre células) se modifica. Se investigó la relación entre los enlaces de receptor-ligando medido y el correspondiente potencial metastásico de las células cancerosas de vejiga humana, con el fin de determinar la firma adhesivo de tales células cancerosas. Finalmente, se muestra que el receptor de ICAM-1 sobre el ECS actúa como un mediador clave de la interacción adhesiva con las células de cáncer más invasivos. Nuestros resultados indican que las células de cáncer de vejiga más invasivos interactúan gracias a uno o dos tipos de ligandos ICAM-1: CD43 y MUC1 son buenos candidatos, como se demuestra por citometría de flujo experimentos. Este conocimiento acerca de tales interacciones es esencial para la comprensión de la adhesión de células de cáncer al endotelio, un mecanismo que conduce a la invasión y metástasis.
Materiales y Métodos
Células y cultivo celular
tres líneas celulares de vejiga se utilizaron en este estudio: RT112, T24 y J82 (ATCC, Rockville, MD). Estas líneas celulares representan la progresión de pozo a fenotipos poco diferenciado y surgen de superficial a cáncer de vejiga humana epitelial invasivo. células de cáncer de RT112 son moderadamente diferenciada y se caracterizan por un grado citológico 2 (o diferenciación) [21]. células de cáncer de T24 y J82 son pobremente diferenciado y caracterizado por un grado citológico 3. Para distinguir las células de cáncer de HUVECs, las células cancerosas fueron transfectadas con un plásmido que expresa GFP (Green Fluorescent Protein - pEGFP). Las células Vascular Umbilical endoteliales humanas (HUVEC) fueron adquiridos de Promocell (Heidelberg, Alemania). Las células cancerosas se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera, en medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (medio completo RPMI). ECs se mantuvieron en medio de cultivo Promocell. La EC se sembraron en medio de cultivo completo en cubreobjetos de vidrio recubiertos con colágeno I (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y se dejó 3 días a extenderse con el fin de alcanzar la confluencia. Para los experimentos de AFM, el medio de cultivo se suplementó con HEPES (20 mM, pH 7,4).
Microscopía de Fuerza Atómica
Se utilizó un AFM II Nanowizard (JPK Instruments, Berlín, Alemania) montado en un microscopio Zeiss (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Esta configuración permite llevar a cabo mediciones de AFM y al mismo tiempo observar las células utilizando modos de contraste de fase o de fluorescencia. Este AFM también está equipado con el módulo 'CellHesion' (JPK Instrumentos, Berlín, Alemania). Este módulo permite un desplazamiento vertical a gran distancia de la etapa hasta 100 micras, que realiza mediciones de espectroscopia de fuerza posible, incluyendo las interacciones célula-célula. En paralelo, un piezotranslator vertical (PIFOC, Physik Instrumente, Karlsruhe, Alemania) se monta en el objetivo del microscopio para mover el objetivo simultáneamente con la platina del microscopio y se centran en las células mientras que la realización de medidas de AFM. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 37 ° C utilizando el Calentador del plato de Petri (JPK Instrumentos, Berlín, Alemania).
recubrimiento voladizo
voladizos eran suaves en forma de V queridos sin la punta (MLCT- O, Bruker, Francia). Ellos fueron calibrados usando el método de análisis de las fluctuaciones térmicas [22] y exhiben una constante de resorte de cierre a 0,01 N /m. Para permitir la adhesión de las células cancerosas a la consola, este último fue funcionalizado con biotina-conA (Interchim, Montluçon, Francia) [23]. Después de enjuagar con PBS, voladizos se incubaron durante la noche a 37 ° C en biotina-BSA (Interchim, Montluçon, Francia) (0,5 mg /ml), se enjuagaron de nuevo en PBS y después se incubaron en estreptavidina (Interchim, Montluçon, Francia) (0,5 mg /ml) durante 10 minutos. Por último, los voladizos se enjuagaron con PBS y se fijaron en una caída de la biotina con ConA durante 10 minutos y luego se enjuagaron con PBS. Esta molécula permite la unión de las células cancerosas a los voladizos con una fuerza mayor que la fuerza de separación de célula-célula en nuestro estudio: biotina-conA se adhiere a la membrana de células de cáncer con una fuerza de separación de 2 nN [20], mientras que la fuerza de separación relevante en la interacción entre las células cancerosas y CE es del orden de 1 nN.
captura de células del cáncer de
las células cancerosas se cultivaron en frascos de cultivo, a continuación, se separaron justo antes de los experimentos de AFM, utilizando una solución de tripsina /EDTA (0,05% de tripsina y EDTA 0,53 mM). medio RPMI con suero se añadió a las células para bloquear el efecto de la tripsina. Finalmente, las células se centrifugaron y se resuspendieron en medio sin suero. Se depositaron las células cancerosas en una placa de Petri en la que una monocapa CE había crecido, y se establecieron durante unos segundos. la captura de células consistía en el posicionamiento de la punta en voladizo por encima de una célula de cáncer (ya que las células cancerosas eran fluorescente, que podían distinguirse de ECs, véase la Figura 1), para entrar en contacto con la célula durante diez segundos con una fuerza de 1 nN. A continuación, el voladizo con la célula capturado se retrae lentamente a una velocidad constante y la célula se mantuvo en medio de cultivo para descansar durante 15 minutos. A continuación, se añadió 1 ml de RPMI 1640 con suero. La célula se une firmemente a la voladizo y posteriormente utilizada para explorar la adhesión a las CE.
A) Fotografía del voladizo con adjunta de células de cáncer de fluorescencia por encima de la monocapa HUVEC. barra blanca escala corresponde a 20 micras. B) Esquema del método de enfoque de la retracción y la curva típica fuerza de retracción en términos del desplazamiento piezoeléctrico. La célula de cáncer se aproxima a la monocapa CE a velocidad constante. A continuación, la célula entra en contacto con la CE durante 10 segundos para crear varios complejos de bonos sobre la zona de adhesión (bajo una fuerza de 1 nN Biosystems). El voladizo se retrae a una velocidad constante con el fin de separar las uniones adhesivas. La curva muestra la retracción saltos fuerza correspondiente a la fuerza de ruptura (f) de los bonos. La energía adhesivo (área sombreada) representa el trabajo realizado por el desprendimiento de voladizo para separar completamente la célula del sustrato. La fuerza de desprendimiento es la fuerza necesaria para estirar la célula cancerosa y la CE hasta bonos comienzan a separar. Tenga en cuenta que algunos saltos de fuerza pueden seguir una meseta correspondiente a la formación de sujeción
espectroscopia de fuerza:. El análisis de la interacción célula-CE cáncer
En primer lugar, la célula cancerosa se estableció por encima de una EC. El voladizo se bajó a baja velocidad constante (1 m /s) para poner la célula de cáncer en contacto con el CE (por encima del núcleo). Una fuerza de compresión de 1 nN se aplicó a la CE durante 10 segundos (Figura 1A) con el fin de crear lazos y de reproducir la adhesión firme. Por último, la célula de cáncer se retrae con una velocidad que oscila entre 0,5 m /s a 20 m /s. La medición de la deflexión en voladizo durante el movimiento vertical se registró durante las diferentes etapas (Figura 1B). Típicamente, para un par cáncer de células-CE, se obtuvo una secuencia de cinco curvas de fuerza en cinco velocidades de retracción diferentes (con un tiempo de descanso de alrededor de 1 minuto entre cada curva). A continuación, la célula de cáncer se dejó en reposo durante diez minutos y se movió por encima de otro EC para medir una secuencia de cinco curvas de fuerza de nuevo. Por último, cada una de las células cancerosas se utilizó tres o cuatro veces, por lo tanto, quince o veinte dichas curvas de fuerza (N = 15 o N = 20) fueron obtenidos. Las mediciones se recogen entonces para varias líneas celulares de cáncer, durante los experimentos similares. Un bosquejo de la fuerza de retracción típica en términos del desplazamiento piezoeléctrico se presenta en la Figura 1C. El punto mínimo de la curva es la fuerza de separación, es decir, la fuerza necesaria para separar la célula de cáncer de la CE. La fuerza de separación se apoya en la deformabilidad celular, sino también por el número y la fuerza de las uniones adhesivas que se forman entre las células. Los diferentes saltos en vigor corresponden a las rupturas sucesivas de bonos que participan en la interacción célula-célula [24], [25] y por lo tanto representan fuerzas de ruptura (es decir, bonos receptor-ligando). Tenga en cuenta que un salto fuerza puede seguir una meseta en la fuerza, que corresponde a la formación de cuerda, cuya extensión es la longitud de meseta. La curva de retracción también proporciona información sobre la energía de adhesión que es el trabajo necesario para separar las células cancerosas (área sombreada en la figura 1C). Esto incluye el trabajo realizado para estirar las células, así como el trabajo realizado para romper los enlaces moleculares [25]. Todos estos parámetros (fuerza de separación, la fuerza de ruptura, energía de adhesión) se obtienen a partir de la curva de fuerza usando el software de procesamiento de imágenes (instrumento JPK, Berlín, Alemania). Para cada conjunto de condiciones, los experimentos de AFM se llevaron a cabo alrededor de 9 veces en 3 días diferentes. A menos que se indique lo contrario, se reportan los datos como media ± error estándar de la media. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software R (2.14 liberación). Dado que se correlacionan los datos, se utilizó un modelo mixto lineal generalizado (GLMM). Las diferencias entre los parámetros calculados en las células tratadas con anti-ICAM-1 no tratada y se probaron por la función de mezclado del paquete AFEX en software R.
Inhibición de ICAM-1 ligandos en el ECs
anticuerpo monoclonal humano a la ICAM-1 [27] se utilizó a una concentración de 30 mg /ml. Antes de los experimentos de AFM, ECs se incubaron durante 15 minutos en presencia del anticuerpo a 37 ° C. A continuación, se lavaron dos veces las células en PBS y se incubaron en 2 ml de medio de cultivo.
Inmovilización de ICAM-1 y BSA
Una parte alícuota de 20 l de recombinante ICAM-1 (RD Systems, Lille, Francia) (25 mg /ml) en 0,1 M NaHCO
3 (pH 8,6) se adsorbió durante la noche a 4 ° C en el centro del cubreobjetos. Las proteínas no unidas se eliminaron por lavado con PBS y 2 ml de medio completo RPMI 1640 a continuación, se añadieron a la placa de ICAM-1 recubiertos antes de los experimentos de AFM
.
Para el protocolo BSA-recubrimiento, una alícuota l de BSA a 100 g /ml en PBS se adsorbió 30 minutos a 37 ° C en el centro de la placa de Petri. Las proteínas no unidas se eliminaron por lavado con PBS y después se añadieron 2 ml del medio RPMI completo a la placa de BSA recubierto antes de los experimentos de AFM.
citometría de flujo análisis de ICAM-1, MUC1 y CD43 expresión y la tinción de inmunofluorescencia
los niveles de expresión de ICAM-1 en la superficie (CE), MUC1 y CD43 (en la superficie de las células cancerosas) se analizaron mediante citometría de flujo (flujo Accuri C6 citómetro, BD Bio-Sciences). La cuantificación se hizo por medición de la fluorescencia media geométrica. Para la tinción de inmunofluorescencia, cubreobjetos de vidrio se recubrieron con 25 mg /ml de fibronectina humana. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2%, y se procesaron para microscopía de inmunofluorescencia indirecta.
Para la medición de los niveles de expresión de células de ICAM-1 y MUC1, ECs o cáncer se incubaron con el anticuerpo primario y luego con FITC-conjugado (cabra anti-IgG de ratón) anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.). Los anticuerpos primarios son un anticuerpo monoclonal humano a la ICAM-1 [26] o un anticuerpo anti-MUC1 monoclonal C595 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.). El anticuerpo anti-MUC1 reconoce un motivo tetrapéptido dentro del núcleo de la proteína de la molécula MUC1.
En nivel de expresión CD43, las células cancerosas se incubaron con un anticuerpo monoclonal CD43-clon L10 marcado con FITC (Invitrogen, EE.UU.), que reacciona con el dominio extracelular.
Resultados
la adhesión de las diferentes líneas celulares de cáncer
para evaluar si la invasión de células de cáncer está relacionado con sus propiedades adhesivas, que llevan a cabo la espectroscopia de fuerza medidas dirigidas a la interacción entre las células cancerosas (de diferente capacidad invasora) y EC. surgen las células cancerosas de las siguientes líneas celulares: RT112, T24 y J82. células RT112 son las células menos invasivos, mientras que las células T24 y J82 son los más invasivos [21]. curvas de fuerza se realizaron entre una célula de cáncer unido a la punta en voladizo y una monocapa de ECs chapada en un cubreobjetos de vidrio. La figura 2 muestra curvas de fuerza típicos obtenidos durante las interacciones de los tres tipos de células de cáncer (T24, J82 y RT112) con la ECs. Cada curva de retracción (velocidad de retracción V = 5 m /s) muestra varios eventos de ruptura asociados a la ruptura sucesiva de bonos que participan en la interacción célula-célula. Curiosamente, las células menos invasivos (RT112) presentan pasos más pequeños de la fuerza de rotura en comparación con células más invasivos (T24, J82). Por otra parte, la fuerza de desprendimiento que es el punto mínimo (Figuras 2A-B-C) de la curva es menor para las células RT112. Las Figuras 2A-B-C también muestran la distribución de las fuerzas de ruptura detectado para las interacciones celulares de cáncer con ECs en V = 5 m /s. Estas magnitudes [10-70] pN están en el rango de los valores de la fuerza típicos obtenidos para los bonos de receptor-ligando [23], [27], [28], [29]. Es de destacar que los tres tipos de células presentan diferentes valores de fuerza: mediciones revelan una fuerza de ruptura media de 29,6 ± 0,8 pN para RT112, 34,0 ± 0,9 pN para T24 y 44,2 ± 1,1 pN para J82 (V = 5 m /s). Tenga en cuenta que las fuerzas de ruptura media son más pequeños para las células RT112 que son el tipo menos invasivo.
típicas curvas de fuerza después de 10 s-contacto entre una TC y una EC en una monocapa HUVEC. histogramas probabilidad con la recogida fuerzas de ruptura f para J82 (A), T24 (B) y RT112 células (C) a V = 5 m /s. Las flechas verticales indican ejemplos de fuerza de saltos que corresponde a la ruptura de los enlaces ligando-receptor.
energía de adhesión y la fuerza de desprendimiento (nivel celular)
Un aspecto importante para caracterizar la interacción de las células cancerosas a los EC es la energía de adhesión, que involucra a toda el área de contacto de la célula. La energía de adhesión se deriva a través de la integración de la zona debajo de la curva F (z), donde F es la fuerza y z es el desplazamiento piezoeléctrico. La línea de base se elige como el valor límite final, después de todos los bonos se separan. El software permite JPK para elegir este valor y luego se realiza la integración. Por lo tanto se determinó la energía de adhesión, así como la fuerza de desprendimiento (valor absoluto de la fuerza mínima en retraer curva de fuerza, véase la Figura 1B) frente a la velocidad de retracción (V). Como se muestra en la Figura 3, estos dos parámetros aumentan con la velocidad de la retracción. En cuanto a la energía de adhesión, las células J82 más invasivos presentan valores más grandes en comparación con las células T24 o RT112. Además, esta diferencia es confirmado por los valores de la fuerza de desprendimiento que son más altos para las células J82 en comparación con las células T24 y RT112. En cualquier caso, las fuerzas de desprendimiento o energías de adhesión son siempre más pequeño con la célula RT112 menos invasiva.
Trama de la energía de adhesión (A) y la fuerza de desprendimiento (B) frente a la velocidad de retracción después de 10 s-contacto entre un TC y un EC en una monocapa HUVEC. Tres líneas celulares de cáncer: T24 (círculo abierto), J82 (cuadrado lleno) y RT112 (triángulo lleno). Los datos se representan como media ± error estándar de la media. La línea es sólo una guía para el ojo.
Efecto de la velocidad de retracción de la fuerza de rotura
La fuerza de ruptura se ha demostrado teóricamente que depender del logaritmo de la tasa de carga de la voladizo [30]. Para el estudio de la firma de cada línea celular de cáncer, hay que analizar los espectros de fuerza de los tres tipos de células de cáncer durante su interacción con EC (Figura 4). Estos presentan valores de fuerza de los espectros dependiendo de la velocidad de retracción o de manera equivalente la tasa de carga r
f (N /s), igual al producto de la velocidad de retracción V (m /s) veces la constante de muelle k (N /m) del voladizo, es decir, r
f = kV. valores de fuerza aumentan gradualmente con la velocidad de retracción y varían entre 20,8 ± 0,7 Pn y 47,4 ± 1,9 PN para las células RT112, entre 27,1 ± 1,1 Pn y 52,4 ± 2,0 PN para las células T24, y entre 31,6 ± 1,0 Pn y 65,8 ± 1,6 PN para J82 Células. Para las tres líneas celulares de cáncer, la fuerza de ruptura media en función del logaritmo de la velocidad aumenta la retracción, pero no es lineal.
La relación entre la fuerza de ruptura y la velocidad de retracción después de 10 s-contacto entre una TC y una EC en una monocapa HUVEC. Tres líneas celulares de cáncer: T24 (círculo completo), J82 (cuadrado lleno) y RT112 (triángulo lleno) que interactúa con el endotelio. Los datos se representan como media ± error estándar de la media. La línea es sólo una guía para el ojo.
Medición de fuerzas de adhesión específicas y no específicas de las células cancerosas
En un estudio anterior, se demostró que la ICAM-1 estuvo involucrado en TC extravasación [4]. Para probar la adhesión específica entre las células cancerosas y la ICAM-1 moléculas, llevamos a cabo experimentos de espectroscopia de fuerza entre una célula de cáncer unido a la punta de un voladizo AFM y inmovilizadas moléculas de ICAM-1 en un plato de cristal. Como se muestra en la Figura 5, estas mediciones revelan que las fuerzas de ruptura están muy cerca de los ya obtenidos para la interacción cáncer de células-CE [28]. Los valores están en el rango de [20-70pN] para una velocidad de retracción entre 0,5 m /s y 20 m /s. Para comparar estos valores para las fuerzas de adhesión no específicos, también medimos las fuerzas de ruptura entre CT y una superficie recubierta con BSA. El nivel de fuerza involucrada en la adhesión no específica se encuentra en el rango de [10-45pN], que es mucho menos importante, alrededor del 40% al 70% de la fuerza de unión específica.
fuerza de ruptura frente a la velocidad de retracción de células T24 que interactúan ya sea con un sustrato recubierto o con ECs (círculo). El sustrato se recubre con BSA 100 g /ml (cuadrado) o ICAM-1 recombinante de 25 mg /ml (diamante). Los datos se representan como media ± error estándar de la media. La línea es sólo una guía para el ojo.
Papel de la ICAM-1 receptor
Tal como se muestra mediante imágenes de microscopía confocal (Figura 6A), la expresión de ICAM-1 en sin estimular EC es moderado. análisis FACS (Figura 6B) confirma el nivel de expresión de ICAM-1, al comparar los niveles de fluorescencia de las células tratadas con un anticuerpo irrelevante y con el anticuerpo anti-ICAM-1. Para determinar la contribución relativa del receptor de ICAM-1 sobre la adhesión célula-célula, se examinó la alteración de las fuerzas de adhesión cuando el bloqueo de este receptor con un anticuerpo monoclonal específico. La Figura 7 muestra el efecto del anticuerpo contra ICAM-1 durante la adhesión de los tres tipos de células de cáncer con el ECs. Curiosamente, la inhibición de la CE ICAM-1 resultó en una disminución significativa de las fuerzas de ruptura de sólo las células más invasivos. Para las células T24, los promedios de fuerza variaron entre 27,1 y 52,4 pN pN (a diferentes velocidades) sin bloquear el receptor de ICAM-1, pero entre 14,4 y 35,7 pN pN, cuando el bloqueo de ICAM-1 (Figura 7A). Este efecto también es claramente visible en la caja-bigote-trama obtenida a una velocidad de retracción de 5 micras /s (Figura 7 B). El anti-ICAM-1 anticuerpo induce una disminución significativa de la fuerza de ruptura para T24 (de 34pN a 21,8 pN, véase la Figura 7B) y el valor de 21,8 pN (+/- 0,7) obtenido después de usar del anticuerpo es comparable a la valor de fuerza de ruptura de 23.3pN (+/- 1,6) obtenido para la adhesión T24-BSA (véase la figura 7G). Por lo tanto, después de la inhibición de ICAM-1, el nivel de fuerza de ruptura es típico de una adhesión no específica. Esta inhibición parece ser prácticamente completa para las células T24. Para J82 células, los promedios de fuerza varían entre 31,6 y 65,8 pN pN sin bloquear ICAM-1 y entre 17,7 y 58,1 pN pN cuando el bloqueo de ICAM-1. Este efecto de anti-ICAM-1 es claramente visible en el gráfico de caja-bigote de la figura 7D: el valor medio disminuye de 44,2 a 30,4 PN PN a una velocidad de retracción de 5 micras /s. Finalmente, la adhesión de células RT112 a ECs no se disminuye en presencia del anticuerpo anti-ICAM-1: los valores medios varían entre 20,8 y 47,4 pN pN mientras que son entre 21,1 y 58,6 pN pN cuando el bloqueo de ICAM-1. Este efecto no significativo del anticuerpo anti-ICAM-1 se confirma por los diagramas de caja de bigotes (Figura 7F): el anticuerpo no induce ninguna disminución en la fuerza de ruptura. Por lo tanto, una importante reducción de las fuerzas de unión para las células invasoras (por ejemplo, 35% para las células J82 y T24) se ha cuantificado aquí cualquiera que sea la velocidad, mientras que no hay ningún cambio en el caso de la célula RT112 menos invasiva. Esto demuestra claramente que la ICAM-1 expresada por ECs juega un papel crucial en la firme adhesión de las células más invasivos (J82 y T24).
A) Imagen de microscopía confocal de una monocapa de EC manchado para ICAM-1 ( verde). HUVECs se fijaron con PFA. Los núcleos se tiñen de azul usando DAPI. B) La cuantificación de los niveles de ICAM-1 por análisis FACS (línea discontinua) en comparación con un anticuerpo irrelevante (línea continua).
fuerza de ruptura frente a la velocidad de retracción después de la interacción entre las células cancerosas y un EC, tratados con un anticuerpo anti-ICAM 1 anticuerpo o no. Correspondientes diagramas de caja de bigotes muestran las fuerzas de rotura a una velocidad de retracción de 5 micras /s. (A, B) T24-CE, (C, D) J82-CE y (E, F) RT112-CE. Como comparación, el cuadro de trama fuerza de ruptura también se muestra para la interacción T24-BSA (panel G). Para los grupos A, C y E, la línea es sólo una guía para el ojo. Los datos se representan como media ± error estándar de la media. Estrellas representan el valor p de las pruebas estadísticas GLMM entre los parámetros calculados en las células tratadas con anti-ICAM-1 no tratados y (* p≤0.05).
El análisis detallado de las fuerzas de ruptura
ya que utilizamos valores medios de las fuerzas de ruptura que puede ocultar la complejidad de las uniones adhesivas, una inspección más detallada de los saltos de fuerza (como se muestra mediante los histogramas) se llevó a cabo a fin de obtener más información. Este análisis se presenta en la Figura 8 donde el TC-ECs o el TC-sustrato (ICAM-1 o BSA) saltos de fuerza se registran y se presentan utilizando histogramas, a una velocidad dada de 5 micras /s. Inspección del histograma de las fuerzas de ruptura T24-ECs en la figura 8A (sin el efecto de anti-ICAM-1) revela una distribución gaussiana centrada en 32,9 pN (+/- 5,8). Curiosamente, esta distribución de fuerzas para la interacción encontró T24-CE es muy similar a la obtenida durante la interacción entre T24 y el 1 ICAM-revestido-sustrato (es decir, valor medio = 28,8 pN +/- 5,1) (véase histograma en la Figura 8D ). Por otra parte, cuando el ECs han sido tratados con el anticuerpo anti-ICAM-1, el pico en la figura 8A casi desaparece (el área bajo la curva se divide por un factor de diez). Aparece una nueva pico centrado en 19 pN, similar al valor de 21,5 pN encontraron resultados para T24 interactuar con la superficie recubierta con BSA (Figura 8E) que puede atribuirse a las interacciones no específicas.
Efecto de un anticuerpo anti -ICAM-1 anticuerpo en las interacciones con el cáncer de la CE. distribuciones de fuerza de ruptura son gaussiana con uno o dos picos revelando la presencia de los receptores de ligando /bonos o interacciones no específicas. histogramas de probabilidad de fuerza de ruptura (V = 5 m /s) para (A) T24-HUVEC, (B) J82-HUVEC, (C) RT112-HUVEC. histogramas negros representan las células del cáncer de la interacción y la CE sin anticuerpo mientras que los rojos muestran la distribución de la fuerza después de usar el anticuerpo. Paneles D (T24-ICAM-1) y E (T24-BSA) muestran las probabilidades de fuerza de ruptura para las células T24 en contacto con sustratos recubiertos. El número N de los acontecimientos se indica en los histogramas
El histograma de las fuerzas de ruptura J82-CE revela una distribución de una distribución de Gauss doble:. Hay dos picos inicialmente (42 Pn y Pn) 70 como puede ser visto por el amplio espectro de valores de fuerza. Después de la incubación con el anticuerpo, el último pico (70 pN) desaparece por completo mientras que el primero (42 pN) se reduce por un factor de 3 (Figura 8B). Podemos concluir se espera que ICAM-1 para interactuar con dos ligandos en la superficie celular J82, y que el anticuerpo inhibe tanto las interacciones, pero preferentemente uno. Estos bonos pueden ser interacciones específicas con dos ligandos diferentes, por ejemplo. Además (Figura 8B), un nuevo pico más bajo aparece cuando se utiliza el anticuerpo (≈28pN), cuyo valor es muy cercano a la encontrada para los bonos no específicos.
El caso de células RT112 es diferente, como se puede ver en la figura 8C. Sólo hay un pico con y sin el anticuerpo se encuentra en niveles similares (28 pN y 33 pN, no hay diferencia significativa). La adición de anti-ICAM-1 anticuerpo no cambia la curva en general, por lo tanto, no se detecta ningún efecto claro para las células RT112, lo que indica que ICAM-1 es, probablemente, que no participan en este proceso de adhesión.
Análisis de ICAM-
1 ligandos (CD43 y MUC1) expresión de las células invasoras T24 y J82
células de cáncer de vejiga no expresan los ligandos comunes ICAM-1, tales como LFA-1 o Mac-1 [5]. Por otro lado, la expresión de MUC1 (mucina 1) y CD43 (leucosialina) se describió recientemente como ICAM-1 ligandos [31], [10], [9], [32]. Por lo tanto, se cuantificó su expresión por citometría de flujo. Los resultados de la Figura 9 muestran que las células T24 sólo expresan el ligando CD43 mientras que las células J82 expresan tanto de CD 43 y ligandos MUC1. En cuanto a las células RT112, expresan sólo el ligando CD43.