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PLOS ONE: Molecular y caracterización in vivo de las células del cáncer de multiplicación derivados de MYCN-dependiente Medulloblastoma

2016/10/8


Extracto

El meduloblastoma (MB) es el tumor cerebral maligno más frecuente pediátrica. Mientras que las vías que están desregulados en MB aún no se han caracterizado completamente, amplificación y /o sobreexpresión de la
MYCN
gen, que sea tiene un papel crítico en el desarrollo del cerebelo como regulador del destino de las células progenitoras neurales, ha sido identificado en varios subgrupos MB. Fenotípicamente, la expresión aberrante de MYCN está asociado con el /la variante MB anaplásico de células grandes, que representa el 5-15% de los casos y se asocia con enfermedad agresiva y un peor pronóstico clínico. Para entender mejor el papel de MYCN en MB
in vitro
y
in vivo
y para ayudar al desarrollo de la terapéutica MYCN objetivo que establecimos líneas celulares derivadas de tumores neurosphere del GTML (
GLT1-tTA /
TRE-MYCN-Luc) modelo de ratón genéticamente modificado. Una fracción de neuroesferas GTML se encontró que el factor de crecimiento independiente, expresa CD133 (un marcador de células madre neurales), no pudo diferenciar a la retirada MYCN y fueron altamente tumorigénicas cuando se implantan de forma ortotópica en el cerebelo. análisis de componentes principales a partir de datos de ensayo de ARN de una sola célula sugirió que el candidato clínico aurora-A inhibidor de la quinasa MLN8237 convierte neuroesferas GTML que se asemejan a expressors no MYCN. La correlación con esto, MLN8237 extendió significativamente la supervivencia de ratones portadores de aloinjertos GTML MB. En resumen, nuestros resultados demuestran que MYCN juega un papel fundamental en la expansión y la supervivencia de las células agresivas MB de propagación, y establecen neuroesferas GTML como un recurso importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas

Visto:. Ahmad Z, Jasnos L, Gil V, Howell L, Hallsworth A, Petrie K, et al. (2015) Molecular y
En Vivo
Caracterización de las células del cáncer de multiplicación derivados de meduloblastoma MYCN-dependiente. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10.1371 /journal.pone.0119834

Editor Académico: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA

Recibido: 11 Julio, 2014; Aceptado 16 de enero de 2015; Publicado: 18 Marzo 2015

Derechos de Autor © 2015 Ahmad et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto de Investigación del cáncer, Instituto americano para la Investigación del cáncer (11 a 0301), Cancer Research Reino Unido (C34648 /A12054 ), y el tumor cerebral Caridad (SDBTT 6/88). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

en los niños, el meduloblastoma (MB) es la más frecuente de tumor neuroectodérmico primitivo (PNET) originarios en el cerebro y se ha clasificado en cuatro subtipos principales basados ​​en el número de copias variación y perfiles de transcripción: MB
WNT , Mo
SHH (sonic hedgehog), Mo
Grupo 3 y MB
Grupo 4 [1,2]. A pesar de los avances logrados en la clasificación molecular MB, en la mayoría de MB pediátrica (con la excepción de SHH aberrante y vías de Wnt) vías de señalización oncogénicas que son terapéuticamente objeto de orientación están aún por identificar. La investigación reciente ha, sin embargo, demostró que MB albergar la amplificación MYCN y /o sobreexpresión también puede ser dirigido [3]. La amplificación de los
MYCN
gen se asocia con un mal pronóstico [4,5], se observa en MB
SHH, Mo
Grupo 3 y MB
subtipos GRUPO4 [6-10] y se expresa de forma aberrante en la mayoría de MB humanos [11]. A pesar de la creciente importancia de MYCN como diana terapéutica en MB, sin embargo, aún tenemos una mala comprensión de la forma aberrante
MYCN
expresión transforma las células madre /progenitoras neurales a los tumores. Hemos informado anteriormente de un modelo de ratón genéticamente modificado (GEMM) de MYCN impulsada por MB (GTML:
G

LT1-TTA /

T

RE

M

YCN-

L

uc
) en el que la expresión de MYCN es controlada por doxiciclina (DOX) (Tet-off). El uso de este sistema se demostró que la expresión dirigida de MYCN induce tanto anaplásico de células clásico y grande (LCA) patología independiente de SHH [11]. clasificación de subgrupos basados ​​en los perfiles de expresión de genes derivados de muestras de meduloblastoma humanos en comparación con ratones transgénicos sugiere que GTML y GTML /Trp53
ratones KI /KI muestran perfiles de expresión característico de MB humano
Group3 [3]. Neurosphere líneas establecidas a partir de ratones GTML proliferan robusta, expresan marcadores neuronales, y forman tumores cuando se implantan de forma ortotópica en el cerebro de ratones [12]. Estos resultados sugieren que las culturas GTML neuroesferas contienen células tumorales se propagan, haciendo de este un sistema potencialmente útil con la que el papel transformador de MYCN en MB génesis podría ser dilucidado.

En este contexto, se realizó una serie de molecular y Los estudios citológicos para caracterizar los cultivos de neuroesferas establecidas a partir de ratones GTML. análisis de células individuales reveló la expansión de una población de células homogénea depende de la expresión MYCN para la supervivencia. Estos esferoides son resistentes a la diferenciación, y tienen características de células madre y progenitoras neuronales cometidos parcialmente con la expresión MYCN, incluyendo la regulación positiva de nestina, CD133, Otx2, y Musashi, la expresión de que están asociados con el mantenimiento de un estado indiferenciado, y típico de Mo-madre /progenitoras. la implantación del cerebelo de GTML neuroesferas subpoblaciones mostraron que el tumor se propaga de potencial residido en CD133 +, pero no las células CD15- CD15 + o. Además, el tratamiento de los tumores con MLN8237, una aurora-A inhibidor de quinasa que induce la degradación de MYCN oncoproteína [13], se extendió de manera efectiva la tasa de supervivencia de los ratones con GTML MB agresivos. Estos resultados aclaran el papel de MYCN en la transformación celular y la progresión de MB, el fortalecimiento de la hipótesis de que MYCN impulsa la expansión y enriquecimiento de las células tumorales se propagan CD133 + capaz de generar MB agresivo.

Materiales y Métodos

ratón cría

El modelo de ratón GTML se ha descrito anteriormente [11]. Todos los procedimientos de ratón fueron aprobados por el Instituto de Investigación del Cáncer Comité Ético siguiendo las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido (Proyecto Número de licencia: 70/7945). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia isoflurothane, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

aislamiento y la cultura Neurosphere

El tejido fue aislado de tumores GTML o P5, P8 posnatal, el cerebelo y el mesencéfalo y P21 transferido en HBSS frío (Invitrogen). Los tejidos se cortan en 2-3 mm
2 piezas y enzimáticamente disociadas a 37 ° C usando Liberase Blendzyme 1 (0,62 unidades Wunsch /ml, Roche) en PBS durante 15 a 45 min. La reacción enzimática se detuvo mediante volumen 10% de suero de ternera fetal (FCS, PAA) antes de que las células se trituraron en medio DMEM /F12 que contiene B27 y se filtraron a través de una malla 70μm. Posteriormente las células se cultivaron en medio DMEM /F12 (Invitrogen) suplementado con 2% de suplemento B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Sigma), /ml de factor de crecimiento de fibroblastos 20 ng (bFGF-básico, Invitrogen) y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina.

Para examinar las tasas de división celular, neuroesferas se disociaron con la pipeta, y las células teñidas con azul de tripano se contaron usando un hemocitómetro. Alternativamente, las células se contaron usando el instrumento Guava PCA-96 después de la tinción con reactivo Guava ViaCount Flex (1:50, Millipore), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

Para la evaluación de potenciales de diferenciación, las células se sembraron en cubreobjetos recubierto por poli-D-lisina (0,1 M, Sigma), 0,1% de gelatina o laminina (0.5μg-2.0μg /ml, Invitrogen) y se cultivaron bajo condiciones de diferenciación durante un máximo de 14 días. Medio de diferenciación se compone de medio DMEM /F12 suplementado con 10% de FCS, B27 con o sin 1 mg /ml de ácido retinoico (Sigma Aldrich). También hacemos enchapado en células GTML recién ordenados en la presencia de 0.5-1.0mg /ml de colágeno (Invitrogen; A1048301). neurobasal en los medios de comunicación a favor de la diferenciación con suero

implantación ortotópico

Para examinar el potencial tumorigénico, las células directamente obtuvieron a partir de tumores primarios, esferas GTML, o sus derivados se resuspendieron en medios de neuroesferas y se inyecta en el cerebelo de FVB /N ratones hembra: siguiente número de células se implantaron: tumores primarios (25 o 100 células /sitio ), las células M10519 (pasajes 10-27, 25 a 10.000 células /sitio) o células recién ordenados (10 células /sitio).

Los ratones de 6-8 semanas se anestesiaron mediante la inhalación de isoflurothane anestésico. Una incisión (1 cm
2) se realizó en la línea media del cuero cabelludo sobre el cerebelo, y un pequeño agujero con un diámetro de 1 mm se hizo en el cráneo usando un taladro dental en una posición 1 mm lateral desde la línea media y entre 1 y 2 mm posterior a la sutura lambdoidea evitando cualquier vasos sanguíneos obvias. Las células se inyectaron a una profundidad de 2 mm utilizando una jeringa Hamilton de 10 l en un marco estereotáxico. La aguja se deja en su lugar durante 2 minutos para evitar el reflujo. La aguja se retira con cuidado para evitar que se desprenda células tumorales. A continuación, el cráneo fue sellada usando pegamento quirúrgico. Después de la progresión del tumor implantación se controló semanalmente utilizando el sistema Image IVIS estar (Caliper Life Sciences) según las instrucciones del fabricante. formación de imágenes de luciferasa se realizó como se describe anteriormente [11], salvo que la sal de potasio de D-luciferina (Parkin Elmer) en PBS se utilizó a 15 mg /kg.

doxiciclina tratamiento se llevó a cabo como se describe en nuestro documento anterior [11] . Brevemente, los ratones con tumores progresados ​​midieron con una señal de 1x10
9 fotones /s se alimentaron con pienso (TestDiet) que contiene doxiciclina a 200 mg /kg para proporcionar una dosis diaria de aproximadamente 32 mg /kg. La carga tumoral se determinó mediante bioluminiscencia.

La inmunohistoquímica e inmunocitoquímica

Para neuroesferas inmunocitoquímica fueron embebidos en OCT montaje de los medios de comunicación (BDH) y se congelaron lentamente utilizando isopropanol enfriado en nitrógeno líquido. Entonces cryosections 4 micras de espesor fueron montadas en portaobjetos recubiertos de poli-lisina (VWR) y se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA, Sigma) en PBS durante 10 minutos. Después de lavados posteriores con TBS, las secciones se bloquearon entonces con albúmina de suero bovino 10% (BSA, Sigma), glicina 15 mM (Sigma) y 0,02% de Triton X100 (Sigma) en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Para las secciones de anticuerpos de ratón se bloquearon utilizando el kit de bloqueo de MOM (Vector Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche en solución (0,1% BSA-PBS) a temperatura ambiente y después de los lavados posteriores con diapositivas TBS se marcaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes) de bloqueo. Las diapositivas se counterstained con DAPI (Sigma) y luego se montaron con Fluoromount G (Biotech Sur).

Para la inmunohistoquímica, las muestras de tumor se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 horas a 7 días. Las muestras fueron descalcificadas con EDTA 0,3 M y luego se procesan mediante el procesador de tejidos Leica ASP300 S para crear un bloque de cera de parafina. Las secciones se redujeron a 4 micras de hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica se llevó a cabo como se describe anteriormente [14]

Los anticuerpos utilizados para inmunohistoquímica e inmunocitoquímica fueron:. MYCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556003, BD Pharmingen ), GFAP (Z0334, Dako), CD15 (332778, BD Bioscience), Tuj1 (BAM1195, R & amp;. D), exfoliados caspasa 3 (9664, Cell Signaling)

El análisis por inmunotransferencia

las neuroesferas se cultivaron bajo condiciones normales y diferenciación en la presencia o ausencia de 1μg /ml de doxiciclina. Se recogieron las esferas, y luego se suspendieron en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) según el protocolo del fabricante. El análisis por inmunotransferencia se realizó tal como se describe [14]. Se utilizaron anticuerpos siguientes: MYCN (OP-13, Calbiochem), c-myc (SC-40, Santa Cruz), nestina (ab5968, Abcam), beta-actina (4967, Cell Signaling Technology) y GAPDH (2118, Cell Signaling tecnología).

citometría de flujo y fluorescencia de células activadas por la clasificación

Para los análisis del ciclo celular, esferas GTML fueron tratados con doxiciclina 1μg /ml y se tomaron muestras a 0, 2, 4, 6, 8, 24 y 48 horas. Las muestras se fijaron con etanol al 70% enfriado con hielo y, a continuación, se almacenaron a 4 ° C durante al menos 30 min. Luego, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (40μg /ml, Invitrogen) a 37 ° C durante 30 min, y luego se almacenaron a 4 ° C durante 24 horas. perfiles del ciclo celular se analizaron mediante un analizador de células activadas por fluorescencia Becton Dickinson LSR II.

Para aislar el CD15 + y CD15- o poblaciones CD133 + y CD133-, neuroesferas M10519 GTML se disociaron en células individuales, y luego se tiñeron con anti-CD15 conjugado con FITC (1: 100, Millipore) o anti-CD133 conjugado con PE (1: 100, Miltenyi Biotec) para al 30 min en hielo, se lavaron con PBS que contenía 0,3% albúmina de suero bovino con antibióticos. Las células fueron entonces counterstained con 0.5μg /ml de DAPI en PBS y se clasifican a través de un Becton Dickinson FACS Aria. Las células se clasifican en medio DMEM /F12 que contiene factores de crecimiento y B27. La pureza de cada población se evaluó al final de cada clase usando el mismo analizador.
Purificación de CD133 células
+/- usando perlas magnéticas

neuroesferas M10519 GTML se disociaron en células individuales utilizando el Neurosphere kit disociación P (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la disociación, las células se centrifugaron a 500 x g durante 10 min y luego sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS suplementado con 2% de FBS y EDTA 1 mM (tampón de clasificación). Aislamiento de CD133 + y poblaciones CD133- se realizó inicialmente a través de la separación magnética (EasySep, StemCell Technologies), seguido de una etapa de purificación final usando el FACS ARIA (BD Biosciences). La suspensión celular (0,5 ml, 2x10
7 células) se incubó con 50 l de anticuerpos anti-CD133 (Prominin-1) anticuerpo conjugado con PE (Miltenyi Biotec) o anti-IgG
1 conjugado con PE (Miltenyi Biotec) para 10 min a 4 ° C. Las células fueron lavadas con tampón de clasificación y se incubaron con 100 pl de cóctel de selección de PE (kit selección EasySep PE, StemCell Technologies) por 1 ml de clasificación de tampón durante 15 minutos a temperatura ambiente después de la adición de las nanopartículas EasySep 50 l por 1 ml de suspensión de células antes de la magnética separación. Para mejorar la pureza, el proceso de separación magnética se repitió total de tres veces. La pureza de las fracciones del grano de ruedas o -unbound se evaluó mediante el analizador LSRII FACS (BD Biosciences). Ambas fracciones CD133 + y CD133- se purificaron adicionalmente a partir de fracciones del grano unido y no unido, respectivamente, usando el FACS ARIA (BD Biosciences). 7AAD (Beckman Coulter) se utilizó para excluir las células muertas en los análisis FACS. Las células vivas se contaron con tinción con azul tripán antes de la implantación ortotópico (10 células por sitio).

análisis de dilución limitada

Las células M10519 (100, 10 y 1 célula (s) por 100 l de los medios de comunicación neurobasal en presencia de factores de crecimiento) se sembraron en una placa de 96 pocillos para el cultivo prolongado. Las células fueron monitoreados cada dos semanas para evaluar la formación esfera, y luego la estimación final se hizo aproximadamente 4 semanas después de la siembra.

Los cebadores para ensayos de células individuales

En este estudio, se diseñó inicialmente 48 cebadores para (i) factores que se expresan en tres subtipos distintos MB [5,15-17], (ii) los marcadores de células madre neuronales conocidas, (iii) marcadores de cáncer conocido y (iv) Objetivos MYCN. Examinamos estos juntos con 93 cebadores que utilizamos para las células madre embrionarias de ratón en nuestros estudios anteriores [18,19] para la validación de imprimación usando ADNc a partir de GTML y las células madre embrionarias de ratón. De 141 cebadores, se seleccionaron 96 cebadores que han superado la validación de imprimación, el proceso de la que se ha descrito anteriormente [18].

clasificación de células para ensayos de células individuales

La precisión del proceso de clasificación se determinó como sigue. En primer lugar, 2x10
5 células fueron teñidas utilizando 0.4μl carboxifluoresceína diacetato de N-succinimidil éster (CFSE) colorante fluorescente (Sigma Aldrich), y las células individuales se clasificaron usando un clasificador de células Becton Dickinson en diapositivas AG480F (Beckman Coulter). A continuación, la presencia de células marcadas se inspeccionó en un microscopio fluorescente CKX41 (Olympus) para confirmar que sólo una célula fue manchado en un sitio de reacción de la diapositiva. Si se encontraron dos células en un solo sitio de reacción, la calibración de la máquina de clasificación se reinicia desde el principio. Una vez que se confirmó la precisión de clasificación, las células de la muestra se marcaron con yoduro de propidio, ordenados en tubos de PCR, y después se congelaron. Las células se descongelaron en hielo para romper las membranas celulares.

Invertir amplificación de la transcripción y específica de la diana

El detalle experimental se describe en nuestro trabajo previo [18]. En resumen, la transcripción inversa y la amplificación de ADNc se llevaron a cabo como sigue. La reacción se incubó a 50 ° C durante 15 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, seguido de 18 ciclos de 95 ° C para 15 segundos y 60 ° C durante 4 minutos. cebadores no incorporados se eliminan posteriormente mediante tratamiento con exonucleasa I (Exo I, NEB). Una mezcla de reacción contiene 10 l de cDNA amplificado, 0.4μl de tampón 10 x Exo I, Exo I 0.8μl de enzima (20U /l), y 2.8μl de agua de calidad de RT-PCR. De reacción se mantuvo a 37 ° C durante 30 minutos, a continuación a 80 ° C durante 15 minutos para inactivar de Exo I. Por último, se añadió suspensión de ADN Buffer (36μl) de cada muestra (50 l en total).

Los análisis utilizando el sistema de BioMark

los detalles experimentales se describen en nuestros trabajos anteriores [19] [18], salvo que se utilizó 96x96 placas de matriz CFI expresión génica (Fluidigm Corporation) en este estudio. De la muestra y mezclas de cebadores se cargaron por separado a las entradas situadas en ambos lados de la matriz. Una mezcla de reacción BioMark qPCR se compone de 2.5μl de 2xTaqMan Expresión Génica Master Mix (Applied Biosystems), 0.25μl de 20x ADN de fijación de colorante de carga de muestras de reactivo (Fluidigm Corporation), 0.25μl de 20x tinte de ADN EvaGreen unión (Biotium) y 2μl de Exo I-tratado muestra de ADNc. Una mezcla de reacción de imprimación se compone de 2.5μl de 2xAssay Cargando Reactivo, 1.25μl de suspensión de ADN de tope, y 1.25μl de un par de cebadores 20μM. carga de la muestra se llevó a cabo de acuerdo con el manual de instrucciones del sistema BioMark.

La validación de datos

Para evaluar la formación de productos de amplificación no específicos debido a la formación de dímeros o no específicas de recocido, Se realizó análisis de curva de fusión de cada cebador como se describe anteriormente [18].

el análisis estadístico

Cq valores mayores que el umbral para valores fiables Cq (CQ
umbral, el cuadro S1) eran omitido de los análisis estadísticos tal como se describe [18]. Análisis de componentes principales y análisis de agrupamiento jerárquico (método de Ward) se realizaron utilizando R. Debe tenerse en cuenta que para los análisis de agrupamiento y el análisis de componentes principales, Cq valores superiores a Cq
umbral fueron tratados como valores poco fiables, y por lo tanto fueron todos reemplazado con Cq
umbral + 1d. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar las diferencias de las distribuciones de los coeficientes de correlación de conjuntos de datos derivados de dos conjuntos de muestras, debido a la presencia de asimetría de la distribución y desigual número de observaciones entre los grupos de comparación, los cuales no eran adecuados para llevar a cabo pruebas más fuertes. Se utilizó el test de Log-rank para evaluar la diferencia de las distribuciones de supervivencia de los dos grupos de la muestra.

Resultados

Establecimiento de líneas neurosphere GTML

En este estudio tuvo como objetivo identificar las células tumorales se propagan en MB, y establecer un sistema de estudio preclínico eficiente para examinar el potencial de moléculas pequeñas para prevenir el desarrollo de tumores. Hemos utilizado el
GLT1-TTA /TRE-MYCN luciferasa gratis (GTML) modelo de ratón transgénico, en el que la supresión de MYCN humana y luciferasa se puede lograr de una manera dependiente de dox en el tejido cerebral [11,12] ( S1 Fig.). En este sistema, el desarrollo de tumores se puede prevenir por dox, y la progresión tumoral es visible utilizando
in vivo
bioluminiscente de imágenes (S1 Fig.); tanto la carga tumoral y
in vitro
crecimiento celular es linealmente correlacionada con la intensidad de la señal de luciferasa (S1 Fig.) [11].

tejidos primarios fueron quirúrgicamente aislados de tumores de crecimiento monitoreados por formación de imágenes de la luciferasa semanal ( La Fig. 1A y S1 Fig.). Los tumores extirpados se disociaron y se cultivaron en medios Neurobasal sin suero que contenía EGF y bFGF [20], y neuroesferas establecidas dentro de 3-7 días (Fig. 1A), en contraste con explantes de cerebro medio o cerebelo de ratones de tipo salvaje (que tenía un período de vida limitado de 7-10 pasajes). Las células establecidas a partir de al menos 6 tumores primarios diferentes en diferentes edades eran inmortales y exhibieron un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 horas. (Tabla S2 y S1 Fig.). Tomados en conjunto estos datos sugieren la existencia de una célula altamente proliferativa, transformado más probable es impulsada por la expresión MYCN transgén.

(A) Establecimiento de esferas GTML en cultivo. Se aislaron células primarias de tumores GTML, que fueron identificados a través de las señales de bioluminiscencia (superior izquierda) y morfología, y luego se disociaron en células individuales. M10519 GTML neuroesferas cultivadas después de 10 días también se muestran. Barra de escala: 100μm. (B) Efectos de la retirada de MYCN en el crecimiento celular. esferas M10519 GTML se sembraron a una densidad de 1x10
se midieron 5 células /ml en la presencia de ausencia de 1μg /ml de dox, y la proliferación de esferas mediante el ensayo metabólico WST-1. Las barras de error, ± SD. (C) Efectos de la retirada de MYCN en el ciclo celular. M10519 GTML neurosphere fueron tratados con DOX antes del ciclo celular mediante análisis FACS. análisis (D) occidental. esferas M10519 GTML se cultivaron con 1μg /ml de dox.

Para examinar el papel de MYCN en el crecimiento de las células GTML, se trataron neuroesferas M10519 GTML (así como líneas celulares adicionales, consulte la figura S2 .) con dox, y se encontró una clara evidencia de que el crecimiento depende de MYCN (fig. 1B). ciclo celular análisis utilizando citometría de flujo mostró la acumulación clara de las células de crecimiento restringido en fase G1, dentro de 4 a 6 horas de tratamiento (Fig. 1C), restricción del crecimiento era coincidente con la supresión completa de MYCN, pero no la proteína c-Myc (S1 Fig . y S3 Fig.), la reducción de los niveles de Ki67, un marcador de proliferación, y nestina, una madre neurales y /o marcador progenitor, a las 48 horas después de la retirada de MYCN (Fig. 1D y S1 Fig.). Curiosamente, a diferencia de nuestras líneas GTML previamente establecidos con el tipo salvaje
Trp53
[12], las células GTML detenidos se expandió rápidamente después de la eliminación de dox (S1 Fig.), Lo que sugiere que la retirada de MYCN es citostático en una fracción de estas células y que la detención del crecimiento es reversible. La inconsistencia entre las células GTML utilizados en los dos estudios puede ser debido, al menos en parte, al hecho de que todas las células GTML establecidos en el presente estudio albergan mutaciones espontáneas en la región de la
Trp53
gen que codifica el dominio de unión al ADN de p53 [3]. Se realizó un análisis para determinar si la regulación al alza compensatoria de la proteína c-Myc ratón está involucrado en la liberación de la detención del ciclo celular y encontró que los niveles de c-Myc fueron constantes (S1 Fig. Y. S3 figura), lo que sugiere que al menos en nuestros cultivos de neuroesferas , c-Myc no compensa la reducción de MYCN (como se informó anteriormente que se producen en progenitores neurales [21]). potenciales clonogénico de células M10519, una de las líneas GTML, fueron examinados a través de ensayos esfera secundaria, mostrando que el 42% de las células individuales M10519 eran capaces de formar esferas en cultivo (Figura S4).

MYCN expresión impulsa la expansión de las células que expresan marcadores típicos de células madre neurales y /o células progenitoras y MB

Para caracterizar neuroesferas GTML, se analizó la expresión de marcadores de células madre /progenitoras neurales por inmunocitoquímica. Se encontró que nestina, un marcador de células madre /progenitoras neurales, y el marcador de proliferación Ki67 se expresaron en neuroesferas GTML de una manera MYCN-dependiente (Fig. 2A). La expresión de un marcador progenitor neuronal específica Tuj1 [22] no fue sin embargo visiblemente alterada por retirada MYCN (Fig. 2A), lo que implica que el agotamiento de MYCN no afecta dramáticamente el grado de diferenciación en cultivo. En contraste con nuestra observación anterior en los tejidos GTML [11], sin disminución importante de exfoliados caspasa 3, un marcador de la apoptosis, no se observó después de la retirada MYCN (Fig. 2A y S3 Fig.). Para obtener una imagen más detallada de la expresión génica a nivel de células individuales, se analizaron una línea M10519 (encontramos líneas GTML que nos planteamos en este estudio fueron notablemente similares) utilizando una sola célula plexed-96 QRT-PCR (S5 Fig. Y S6 figura .). Este análisis indicó que los marcadores comunes para MB y células madre neurales incluyendo NeuroD1 [23], CD133 (Prominin 1) [24-27], Otx2 [11,28], y Musashi [29] se downregulated por la retirada MYCN (Fig. 2B y S5 Fig.). La frecuencia de células que expresan marcadores incluyendo CD133 y Musashi también se redujo en dox, mientras que otros marcadores de células madre, incluyendo Sox2 no se vieron afectados por la retirada MYCN (Fig. 2C y S5 Fig.). La expresión de marcadores de astrocitos y células ependimarias (GFAP) [30], los astrocitos (S100B) [31], progenitores neuronales de gránulos y glioma (OLIG2) [32-34] eran apenas detectables (S5 fig.) O rara vez se observó (Figura S5 .) en una sola célula de análisis. Correlacionar con el rápido crecimiento en el cultivo, la expresión MYCN hasta reguladas reguladores maestros de la progresión del ciclo celular, E2F1 y E2F2, ambos de los cuales son objetivos MYCN [35] (Figura S5.). CD133, un marcador de S, G2 y M fases de las células madre neuronales [36] (Fig. 2B y 2C). MYCN, como se esperaba, era apenas detectable en las células tratadas con M10519 dox (Fig. 2B y 2C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión MYCN resultados en la expansión de las células con marcadores típicos de células madre neurales y /o progenitores asociados con MB tumorigénesis.

(A) esferas M10519 GTML se trataron con o sin dox para 17 días. El análisis de inmunofluorescencia se realizó en esferas cryosectioned con anti-Ki67, anti-nestina, o anti-Tuj1, anti-GFAP, y anti-c-caspasa 3 junto con anti-MYCN. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Bar, 50 micras. (B) Un mapa de calor para los niveles de expresión promediados (valores Cq, n = 96) de 13 genes de células madre neuronales se muestran. se muestran (C) Los porcentajes de células que expresan CD133, Musashi, Sox2, MYCN y CD15. Se examinaron las células WT1 y ET2 (véase el texto), no tratados esferas M10519 (M10519), esferas M10519 tratados con DOX durante 24 horas (DOX), o esferas M10519 tratados con MLN8237 durante 24 horas (MLN8237).

96-gen (ver Tabla S3 y Janos
et al
[19]) los perfiles de expresión de 96 células individuales M10519 muestran un grado de heterogeneidad (S6 Fig.). BioMark celda de datos individuales de expresión HD se muestran en la Tabla S3. Para evaluar la diferencia de distribuciones coeficiente de correlación de conjuntos de datos derivados de dos poblaciones, mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov se calcularon los coeficientes de correlación por pares de los niveles de expresión de 96 genes en una población celular dada. El coeficiente de correlación media (
R
) para neuroesferas M10519 fue de 0,77, y la diferencia entre las células M10519 y WT1 (
R
= 0,71, N
M10519 = 1081, N
WT1 = 990, D = 0,2662,
P = 2.2x10

-16) o ET2 (
R
= 0,60, N
M10519 = 1081, N
ET2 = 990 D = 0,57,
P = 2.2x10

-16) células fue estadísticamente significativa. Estos datos indican que mientras que los perfiles de expresión de células individuales en la población neurosphere M10519 no son totalmente homogéneos en la naturaleza, los perfiles de transcripción entre las células en WT1 y cultivos de neuroesferas ET2 derivados de cerebelo normal, son significativamente más heterogénea. Por otra parte, la retirada de MYCN resultó en una reducción significativa del índice de heterogeneidad (
R
= 0,69, N
M10519 = 1081, N
M10519 + Dox = 990, D = 0,27,
P
= 2.2x10
-16). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión MYCN eleva el nivel de homogeneidad celular y expande las células con marcadores madre y progenitoras neuronales.

unidades MYCN expansión de las células resistentes a los estímulos de diferenciación en cultivo

Curiosamente, a pesar de la célula madre y /o el perfil de la transcripción progenitora similar de las células expandidas en cultivos de neuroesferas, las células que expresan GTML MYCN muestran sólo potencial de diferenciación limitada
in vitro
. Después de 8 días de crecimiento en medios pro-diferenciación que contiene suero, se encontró que tres líneas GTML conservan características morfológicas típicas de las células no diferenciadas (S2 Fig.), Aunque se encontró que el tallo neural /marcador progenitor nestina se downregulated después de 2 días de retirada MYCN (Fig. 1D). Por el contrario, las mismas condiciones indujeron la diferenciación de las neuroesferas establecidas a partir de cerebelo de tipo salvaje (S2 Fig.). La aparente pérdida de potencial de diferenciación en células GTML sugieren que el cambio genético o epigenético puede ocurrir después de la activación prolongada de MYCN. También se encontró que las células GTML fallaron para diferenciar completamente bajo una variedad de condiciones (por ejemplo, tratamiento con ácido retinoico, un potente inductor de la diferenciación (S2 Fig.), o el cultivo en medios que contienen 0,5 mg-1 mg /ml de colágeno (datos no mostrados )). Cuando las células fueron cultivadas en medios M10519 pro-diferenciación que contienen suero y ácidos retinoicos, mientras que se observó la regulación a la baja de MYCN, que es controlada por el
GLT1
promotor que se activa en células progenitoras, y nestina en 48-96 horas , se observa ningún cambio considerable en los niveles de marcadores neuronales sinaptofisina y Tuj1 y GFAP marcador glial (S3 Fig.). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión resultados MYCN en el enriquecimiento de las células con marcadores típicos de células progenitoras tallo y /o, la expansión de las células altamente proliferativas resistentes a estímulos de diferenciación de conducción. La aparente pérdida de potencial de diferenciación en esferas GTML está en contraste con los derivados de neuroesferas MB humana (para que
MYCN
estado no fue examinada) [27] o el
Ptc CD - /- modelo de ratón [37], lo que sugiere que la expresión persistente de MYCN impulsa compromiso irreversible a la expansión de las células con marcadores madre y progenitoras neuronales.

neuroesferas GTML MYCN impulsado conservan las propiedades de los tumores primarios
in vivo


recientemente, hemos mostrado que neuroesferas derivadas de ratones GTML son capaces de tumores que se forman en una manera dependiente de MYCN cuando se implanta de forma ortotópica en el cerebelo de camadas no transgénicas [12]. Como era de esperar, la adición de dox a la dieta reduce rápidamente la bioluminiscencia (Fig. 3A) y la carga tumoral (Fig. 3B) en ratones implantados con células M10519. Para evaluar el impacto de la retirada de MYCN
in vivo
, se analizó la expresión de biomarcadores en los tumores ortotópico. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina.

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