Extracto
La ataxia-telangiectasia mutada (ATM) es una Ser /Thr proteína quinasa que desempeña un papel crítico en la señalización de ADN y la iniciación de la señalización de punto de control del ciclo celular inducida por daño en respuesta a agentes que dañan el ADN, como la radiación ionizante. Hemos informado anteriormente la pérdida de proteína ATM mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) en el 16% de los tejidos humanos de cáncer gástrico (CG). La hipótesis de que
ATM
mutaciones de genes intrón dirigidos por la inestabilidad de microsatélites (MSI) causan la pérdida de proteína ATM en un subconjunto de GC. Se estudiaron las mutaciones de mononucleótidos en el intrón de
ATM
gen, ATM IHC y MSI en GC. Se estudiaron diez líneas celulares de cáncer gástrico humano para la
ATM
mutación genética en los intrones, RT-PCR, secuenciación directa, e inmunohistoquímica. GC tejidos de 839 pacientes fueron analizados para MSI y ATM IHC. Entre ellos, se analizaron 604 casos para el
ATM
mutaciones en los intrones precedentes exón 6, el exón 10 y el exón 20. Dos líneas celulares GC humana (SNU-1 y -638) mostraron
ATM
mutaciones intrón, eliminación de RT-PCR y secuenciación directa, y la pérdida de proteína ATM por IHC. Las frecuencias de
ATM
mutación, la pérdida de proteínas MSI, y ATM fueron 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) y 15,2% (134/839), respectivamente. El análisis de las asociaciones entre MSI, ATM mutación genética, y la pérdida de proteína ATM reveló altamente co-existentes
ATM
alteraciones genéticas y MSI.
ATM
se detectaron mutaciones intrón y la pérdida de proteínas cajero automático en el 69,3% (52/75) y el 53,3% (40/75) de GC MSI positiva. MSI positividad y la pérdida de proteína ATM estaban presentes en el 68,4% (52/76) y 48,7% (37/76) de GC con cajero automático mutación intrón.
ATM
mutación y la pérdida de proteína ATM tenía características de la vejez, la ubicación distal del tumor, el tamaño del tumor grande, y el tipo histológico intestinal. Nuestro estudio podría interpretarse como que
ATM
mutación genética en el intrón podría ser objetivo de MSI y conducen a la pérdida de proteína ATM en un grupo seleccionado de GC.
Visto: Kim SA, Choi Si, Min NS, Kim MA, Kim WH (2013) Mutación en Intronic repeticiones del gen de la ataxia-telangiectasia mutada (ATM) y ATM pérdida de proteínas en el cáncer gástrico primario con la inestabilidad de microsatélites . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10.1371 /journal.pone.0082769
Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 21 de julio de 2013; Aceptado 27 de octubre de 2013; Publicado: 6 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Programa básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, ICT & amp; Planificación futura (NRF-2012R1A1A2004648). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Ataxia-telangiectasia mutada del gen (ATM) es un componente de la respuesta de daños en el ADN (DDR) y se activa por el ADN doble filamento se rompe (DSBs), y señala el punto de control del ciclo celular para retardar el paso de las células a través del ciclo para facilitar la reparación del ADN. El gen se localiza en el cromosoma 11q22-23. El gen
ATM
es muy grande, que abarca una región genómica de 150 kb, que comprende de 66 exones con una secuencia de codificación de 91668 pb.
ATM está implicada en las respuestas a las DSB que se producen fisiológicamente en tipos de células especializadas tales como células germinales y linfocitos. La proteína ATM ayuda a las células en el reconocimiento de las cadenas de ADN dañadas o rotas. La proteína ATM coordina la reparación del ADN mediante la activación de enzimas que fijan los hilos rotos. reparación eficiente de las cadenas de ADN dañadas ayuda a mantener la estabilidad de la información genética de la célula [1]. No se observó pérdida
ATM en el 16% del tejido GC humana en un gran estudio de cohorte [2]. La inactivación del gen
ATM
puede ser un evento frecuente en el desarrollo de cáncer gástrico humano (GC); Sin embargo, los eventos relacionados con la pérdida de
ATM
expresión en GC no podían ser explicadas por la baja prevalencia de
ATM
mutación. La mayor parte de los
ATM
mutaciones identificadas en líneas celulares y tejidos primarios GC GC eran mutaciones puntuales [3].
El desajuste de reparación del ADN (MMR) sistema corrige los errores que pudieran ocurrir durante la replicación del ADN, mientras que la recombinación homóloga y de extremos no homólogos de unión están implicados en la reparación de DSB de ADN. Las mutaciones en los genes de reparación del ADN OSD como
ATM, MRE11, RAD50, NBS1
y
ATR
, se postulan para jugar un papel en el desarrollo de neoplasias gastrointestinales con una función triple vírica alterada. En los tumores colorrectales con una alteración en el sistema MMR, las mutaciones de repeticiones de mononucleótidos intrónicas en
ATM
y
MRE11
son las que aportan en el empalme aberrante, seguido de reducción de la expresión de la proteína de tipo salvaje [4 ].
Aproximadamente el 10% de GC se asocia con la inestabilidad de microsatélites (MSI). MSI se refiere a alteraciones en el número de repeticiones de nucleótidos en las regiones de microsatélites localizados dentro de las regiones codificantes de genes, y los resultados en mutaciones frameshift. MSI ha sido identificado en la proteína regiones de genes diana conocidos que incluyen la codificación
TGF-βRII, IGFIIR, BAX
[5-7], y
hRAD50
genes [8]. El
hRAD50, BLM
, y
BRACA1
genes tienen poli (A) mononucleótido se repite dentro de las regiones de codificación, el
hMSH6
tiene (C) 8 vías, la em
NBS1
tiene el tracto (A) 7, y el
ATM
tiene el tracto (T) 7. mutaciones de cambio de estos genes con incidencias variables se informó anteriormente [9-11].
Además de la multitud de mutaciones acumuladas en las secuencias microsatélites neutros, el MSI también genera mutaciones en los genes del cáncer, es decir, en aquellos genes que juegan un papel activo en el proceso de múltiples etapas de la carcinogénesis. Aunque las secuencias repetidas en la región de codificación de genes son más cortas que los loci de microsatélites típico utilizado para el mapeo de genes, su propensión a sufrir errores de deslizamiento espontáneas durante la replicación es aún mayor que la de las secuencias no repetitivas. Las mutaciones se informó de una repetición intrónica para inducir la expresión del deterioro de
MRE11
gen [12,13]. polypyrimidine mutaciones en el gen de repetición
ATM
pueden perturbar el correcto empalme de ARNm [14]. Sin embargo, no hay pruebas de que la inserción /deleción ocurre en estas secuencias de mononucleótidos no codificantes afectar normal de función de la proteína ATM en GC relacionados con MSI. En el tejido humano con GC MSI, la frecuencia de
ATM
mutación y la asociación con la pérdida de función de la proteína no se conoce con claridad. Hemos planteado la hipótesis de que las alteraciones del tracto mononucleótido en el intrón de
ATM
gen se asocia con la pérdida de la función de la proteína ATM en GC con MSI.
Se investigaron las mutaciones en el intrónica (T) 15 dentro de la
gen ATM
secuencia interpuesta (IVS) anterior exón 6, que conducen a su eliminación 22 pb del exón 6 en líneas celulares de cáncer gástrico humano . En el presente estudio, las mutaciones de la
ATM
gen junto con la presencia de MSI se examinaron en líneas de células y tejidos humanos GC GC primarios. Nuestros resultados mostraron que
ATM
mutación del gen intrón era frecuente en GC con MSI y se asoció significativamente con la pérdida de la función de la proteína ATM.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio retrospectivo se realizó con las muestras en los estantes después del diagnóstico patológico, y todas las muestras se convierte en anónima antes del estudio. Este estudio retrospectivo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Nacional de Seúl (H-1010-065-336) con la renuncia del consentimiento informado bajo la condición de la transformación en forma anónima.
Líneas celulares y muestras de tejidos
Ten humana celular de cáncer gástrico líneas- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 y SNU-719 se obtuvieron de la célula de Corea Line Bank (Seúl, Corea). Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, EE.UU.) y antibióticos (100 U /ml de penicilina G y 100 ug /ml de estreptomicina) a 37 ° C en un 5% humidificado CO
2 incubadora. Se obtuvo una línea celular matriz de tejido de cremallera realizado en líneas celulares humanas GC cosechadas y fijos para inmunohistoquímica (Superbiochips, Corea).
, muestras de tejido fijadas con formalina embebidos en parafina GC de 839 pacientes que fueron sometidos a una gastrectomía curativa para el tratamiento del cáncer gástrico primario entre 1
de enero de 2004 y 31
se recogieron de diciembre de 2005 en el hospital de la Universidad Nacional de Seúl. Los pacientes incluidos 577 hombres y 262 mujeres con una edad media de 57,6 años (rango: 4 a 87 años). La información sobre la ubicación del tumor se obtuvo de 835 casos: 109 en tercio superior, tercio medio en el año 323, en el tercio inferior 383, y todo el estómago en 20 casos. Sobre la base de la clasificación de Lauren, los cánceres eran histológicamente clasificado como tipo intestinal en 381, tipo difuso en 327, de tipo mixto en 123, e indeterminado en 8 casos. De los 839 casos, 165 eran GC temprano y 674 eran avanzados GC. Metástasis ganglionar estuvo presente en 531 casos y ausente en 308 casos. Doscientos cuarenta y cinco pacientes fueron diagnosticados en estadio I, 254 como fase II, 291 como estadio III y 85 como en la etapa IV. La quimioterapia adyuvante después de la cirugía se realizó en 533 pacientes, que incluye 32 pacientes en estadio I, 153 en la Fase II, 260 en la Etapa III, y 82 en estadio IV. El período de seguimiento medio fue de 49,3 meses (rango: 0-85 meses). La recidiva local se observó en 185 (21,0%), metástasis a distancia en 85 (9,6%), y la muerte por cualquier causa en 289 de 882 pacientes (32,8%). los datos de supervivencia de los pacientes, incluyendo las fechas y causas de muerte, se obtuvieron del Registro Central de Corea del Cáncer, Ministerio de Salud y Bienestar, Corea. examen histopatológico estándar incluyó la evaluación del tipo de cáncer y el estadio tumoral patológico, de acuerdo con los criterios establecidos por la 7ª edición de la AJCC Staging Manual [15].
Extracción de ADN y determinación MSI
El tejido tumoral muestras en los portaobjetos de vidrio se examinan bajo un microscopio de luz. Un área del tumor en la que el porcentaje de células tumorales supera un mínimo de 50% de todas las células en esa zona y una zona de emparejado de tejido de la mucosa normal, que no contiene células tumorales se marcaron y raspa con una hoja de cuchillo. El tejido raspado se recogió en 1,5 microtubos ml que contenían 50 l de tampón de lisis de tejido (0,5% de Tween 20 [Sigma, St Louis, MO], Tris HCl mM de tampón 100 [pH 7,6], EDTA 1 mM, y 20 mg de proteinasa K [ ,,,0],Sigma]). Los tubos se incubaron durante 24 a 48 horas a 55 ° C hasta que el tampón de lisis que contiene el tejido se volvió clara. Proteinasa K se inactiva por incubación a 95 ° C durante 10 minutos, y el ADN extraído se almacenó a -20 ° C hasta su uso. MSI se evaluó en los loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250 y. Los tumores fueron clasificados como MSI + cuando al menos 2 (40%) de los 5 marcadores de microsatélites se asociaron con alelos de tamaño alterado en el ADN del tumor en comparación con el ADN de tejido no tumoral.
La detección de mutaciones de
ATM Restaurant at intrón mononucleótido repite
La amplificación por PCR se realizó en un volumen de 10 l que contiene 1 l de ADN genómico, 5 pmol de cada uno de los cebadores directo e inverso, y 5 l Premix. Treinta y tres ciclos de PCR se realizaron con parámetro de ciclo de 95 ° C durante 30 seg, 30 seg a una temperatura de hibridación adecuada para cada par de cebadores y 65 ° C durante 1 min, seguido por 10 min de extensión a 72 ° C.
Variación de repetición de mononucleótido en el
ATM
se detectó mediante un ensayo basado en la PCR. El ADN genómico se amplificó con primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG para exon6 (T) 15 (155 pb), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA para exon10 (T) 15 (165 pb), y F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA para exon20 (T) 15 (178 pb).
Detección de corte y empalme aberrante en
ATM
El ARN total (2,5 g) a partir de líneas celulares de cáncer gástrico humano elaborados por se utilizó el reactivo Trizol (Gibco-BRL) para la síntesis de ADNc de primera cadena con transcriptasa inversa Superscript II (Gibco-BRL) y oligo-d (T)
12-18. Una parte alícuota de la mezcla de reacción se amplificó por PCR para sintetizar diversos segmentos de ATM cDNA.
amplificación por PCR se realizó en el volumen de 20 l que contiene 1 cDNA a transcripción inversa-l, 5 pmol de cada uno de los cebadores directo e inverso, y 10 l Premix. Treinta y cinco ciclos de PCR se realizaron con parámetro de ciclo de 95 ° C durante 30 seg, 30 seg a una temperatura de hibridación adecuada para cada par de cebadores y 72 ° C durante 1 min, seguido por 10 min de extensión a 72 ° C. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. β-actina se utilizó como estándar interno.
tres pares de cebadores de RT-PCR derivados de
ATM
secuencias (GenBank NM_000051) utilizados fueron F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG y R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA para detectar transcripciones de exón 5-7 (tamaño del producto: 347 pb), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA y R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA para el exón (tamaño del producto: 504 pb) 9-11, y F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC y R-GATTGACTCTGCAGCCAACA para el exón 19-22 (tamaño del producto: 415 pb ).
Análisis de secuenciación
secuenciación se llevó a cabo por el método didesoxi de terminación de cadena utilizando el kit de secuenciación de ADN (Applied Biosystems) y el analizador genético ABI PRISM 310. Los productos de PCR amplificados se purificaron usando un kit enzimático presequencing (Amersham Life Science, Cleveland, OH, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego secuenciados directamente utilizando el método de terminador BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las reacciones de secuenciación se realizaron en un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y los datos obtenidos fueron analizados mediante análisis de secuenciación de ADN de software 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Los nuevos datos han sido depositados en GenBank (número de acceso: KF704396)
La inmunohistoquímica
secciones de tumor de bloques representativos y secciones de matriz de línea celular de espesor de 4 micras se deparaffinized y rehidratada en una puntuación. alcohol. La recuperación del antígeno se consiguió mediante -Cocina las muestras en tampón de citrato /L 0,01 mol de 5 min de presión. El anticuerpo monoclonal de conejo (Y170 clon obtenido de Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU.) se utilizó para inmunohistoquímica. ATM se tiñó en el núcleo de mucosa normal gástrico, células del estroma, y linfocitos. La intensidad se calificó como 0 (completamente negativa), ± (la aparición de manchas, señal observada solamente en la microscopía de alta potencia con 40 × ocular), + /3 (débilmente positivo), ++ /3 (moderadamente positivo) y +++ /3 (fuertemente positiva, casi igual a los linfocitos y neutrófilos). Los criterios para los casos negativos se establecieron como menos de 10% de células teñidas como positiva débil (+ /3) o mayor intensidad, es decir, más de 90% de células que muestran totalmente negativo (0) o la aparición de manchas (±) [2 ].
El análisis estadístico
El paquete SPSS 15.0 fue utilizado para los análisis estadísticos. Se utilizaron la prueba de Chi-cuadrado y de riesgos proporcionales de Cox modelo. Todos los valores de p son dos valores & lt lados y P;. 0,05 se consideraron como significativos para los métodos estadísticos en este estudio
Resultados
mutación en repeticiones de mononucleótidos intrónicas del gen ATM en gástrica humana líneas celulares de cáncer
Entre 10 líneas celulares de cáncer gástrico humano, SNU-1 y SNU-638 se caracterizaron como MSI,
ATM
pérdida de mutaciones del gen ATM positivo y positivo por IHC. En SNU-1 y SNU-638, 22 de base par supresión del exón 6 se detectó mediante RT-PCR y se confirmó en el análisis de secuencia posterior (Figura 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, y SNU-719 fueron MSI negativos y tenía tipo salvaje
ATM
gen. Aunque SNU-216 fue MSI negativa, albergado mutaciones en el
ATM
gen, y tenía una fuerte expresión ATM detectado por IHC (Tabla 1).
(A) BAT26 (azul) y BAT25 (verde) mostró patrón estable en SNU-5 (superior) y el patrón inestable en SNU-1 (inferior). (B) ATM productos de PCR del gen inintervening secuencia (IVS6) (naranja), IVS10 (azul), IVS20 (verde) mostraron longitud normal en SNU-5 (superior) y la manteca en SNU-1 (inferior). (C) RT-PCR de
ATM
exón 6, el exón 10 y el exón 20 en líneas celulares de cáncer gástrico. SNU-1 y 638 mostraron deleción de 22 pb en el exón 6. (D) La secuenciación directa de IVS 6. SNU-5 tiene la secuencia normal y SNU-1 tiene 22 deleción en las secuencias subrayadas. (E) La inmunohistoquímica de la proteína ATM en cáncer de líneas de células gástricas. Negativa en SNU-1, equívoca en SNU-638, leve positivo en SNU-16 y fuertemente positivo en SNU-5. (F) Representación esquemática de una deleción de 22 pb del exón 6 de
ATM
(882del22).
MSI
ATM
mutación del gen de mononucleótido intrónica repite
ATM
secuenciación
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS IVS 10
20
exón 6
exón 10
exón 20
exón 6
exón 10
exón 20
SNU-1 +++++ 22 pb pb delnono22 delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22 pb del nonoNegativeSNU-668 ----- ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ndndndnononoPositiveTable 1. microsatélites estado de inestabilidad y
ATM
perfiles de genes de líneas celulares de cáncer gástrico humano.
IVS, secuencia de intervención ; IHC, inmunohistoquímica. Descargar CSV CSV
La mutación en el intrón repeticiones de mononucleótidos de la
ATM
gen y la inestabilidad de microsatélites en el tejido de cáncer gástrico
La frecuencia de mutación intrónica en
se determinó ATM
gen como 12,9% (78/604). La frecuencia de la
ATM
mutación genética fue del 9,3% (50/540) en el intrón IVS 6 precedente; 11,0% (59/534) en el intrón que precede IVS 10 y 8,8% (46/523) en el intrón que precede IVS 20; entre ellos, IVS 6 y 10 IVS se superponen en 39, 10 y IVS IVS 20 en 35, 10 y IVS IVS 20 en 34, IVS 6, IVS 10 y 20 IVS en 31 casos (Tabla 2). Las frecuencias de MSI positividad fue del 9,2% (81/882) y la pérdida de proteína ATM fue de 15,2% (134/839) en nuestro estudio del GC. En 596 casos, se analizaron las asociaciones entre MSI (Figura 2A), ATM mutación de genes (Figura 2B), y la pérdida de proteína ATM (Figura 3).
ATM
se detectaron mutaciones intrón y la pérdida de proteínas cajero automático en el 69,3% (52/75) y el 53,3% (40/75) de GC MSI positiva. MSI positividad y la pérdida de proteína ATM estaban presentes en el 68,4% (52/76) y 48,7% (37/76) de GC con cajero automático mutación intrón. MSI positividad y ATM mutación intrón se detectaron en 35,7% (40/112) y 33,0% (37/112) de GC con pérdida de proteínas ATM (Tabla 3). La frecuencia de los resultados de IHC cajero automático ATM mostró una pérdida significativamente mayor en un subgrupo de MSI positiva y
ATM
mutación GC positivo (Figura 4A). Treinta y tres de los 596 casos (5,5%) tienen las características moleculares de los tres (Figura 4B).
Ubicación y Repeticiones (tipo salvaje)
mutación intrón en GC
mutación en el intrón MSI positivo GC
Intrón mutación en GC negativo ATM IHC
em
ATM
IVS 6 (T)
1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 10 (T)
1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 20 (T)
1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%)
ATM
IVS IVS 6 o 10 o 20 IVS (T)
1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabla 2. Incidències de
ATM
mutación del gen intrón en los tipos de cáncer gástrico (CG): perfil del IVS, secuencia de intervención.; MSI, inestabilidad de microsatélites; IHC, inmunohistoquímica. Descargar CSV CSV carril
Baja mostró inestabilidad en BAT26 (azul) y BAT25 (verde). (B) del carril inferior mostró mutación en la secuencia de intervención 6 (IVS6) (azul).
(A) Negativo. (B) equívocos (+/-). (C) positivo débil (1 + 2 + ~). (D) positivo fuerte (3+).
ATM IHC
MSI
ATM
mutación
N
negativo positivo
NegativeNegative49768 (13,7%) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3%) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Tabla 3. Frecuencia de la expresión de la proteína ATM en subgrupos de acuerdo con la inestabilidad de microsatélites (MSI) y el estado
ATM
intrón mutación.
CSV Descargar CSV
(a) Frecuencias de la pérdida de proteína ATM mediante técnicas de inmunohistoquímica en gástrica subgrupos de cáncer por estado de MSI y
ATM
mutación intrón. Diagrama (B) de Venn que muestra el número de casos de cáncer gástrico con la superposición de características moleculares entre la inestabilidad de microsatélites de alto nivel (MSI-H),
ATM
mutación intrón, y ATM pérdida de proteínas.
correlaciones clínico-patológicas de
ATM
mutación genética en GC
GC pacientes con
ATM
mutación del gen estaban asociadas con la vejez, gran tamaño tumoral, la localización distal, tipo intestinal, invasión más profunda y más baja tasa de recurrencia. pacientes con GC negativo ATM IHC se asociaron con la edad, tamaño grande del tumor, el tipo de bien a moderadamente diferenciado, y el tipo intestinal de la clasificación de Lauren (Tabla S1). prueba de chi-cuadrado
se realizó ATM
estado de la mutación de genes en grupos negativos y positivos ATM IHC con variables clínico-patológicas. En el grupo negativo ATM IHC,
ATM
GC positivo mutación se asocia con la edad avanzada (p = 0,032) y la ubicación distal (P = 0,045). En el grupo positivo ATM IHC,
ATM
mutación del gen se asoció con el tipo de bien o moderadamente diferenciado de GC (p = 0,022) (Tabla S1).
El análisis de supervivencia
el modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó en ambas pruebas univariantes y multivariantes. El análisis univariante de regresión de Cox para la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad mostró valor predictivo significativo de algunos factores de pronóstico establecidos, tales como metástasis de los ganglios linfáticos, la profundidad del tumor, y la clasificación del tipo histológico de Lauren. El grupo de pacientes que recibieron chemotherpy adyuvante tenían un significativamente alto riesgo relativo de global (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (SLE) (P & lt; 0,001, el riesgo relativo = [IC del 95,0%, 2,81-5,18] 3,82 para el sistema operativo y P & lt; 0,001, el riesgo relativo = 5,63 [IC del 95,0%, 3,69-8,58] para DFS). Sin embargo, no se observaron tendencias significativas de riesgo relativo (RR) para los
ATM
mutación intrón, pérdida de MSI, o ATM IHC. El análisis multivariado utilizando variables de profundidad del tumor, los ganglios linfáticos, la clasificación del tipo histológico de Lauren, la quimioterapia adyuvante,
ATM
se llevó a cabo la mutación intrón, y la expresión de la proteína ATM. ATM mutación intrón tiene un menor riesgo relativo con un límite importancia para la supervivencia global (p = 0,05, el riesgo relativo = 0,60 [IC del 95,0% 0,36-1,00]) (Tabla 4).
Supervivencia global
supervivencia libre de enfermedad
riesgo relativo
95,0% IC
valor de p
N
riesgo relativo
95,0% IC
valor de p
N
gástrico avanzado Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph nodo de tipo positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544
ATM
intrón mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM loss1.190.82-1.730 proteínas el análisis de regresión .355961.100.67-1.810.70544Table 4. multivariante de Cox.
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Discusión
Nuestros resultados mostraron que las mutaciones de una repetición de intrones en el gen
ATM
dar lugar a aberrantes de empalme, lo que lleva a la supresión de 22 pb y ATM pérdida de la expresión de proteínas en líneas celulares de GC. Estos resultados son consistentes con el informe anterior [13] con respecto a la identificación de un defecto de empalme en el
MRE11
precursor transcrito relacionado con mutaciones por un poli (T) 11 de repetición dentro de la secuencia interpuesta 4 (IVS-4), exclusivamente en líneas celulares de cáncer MMR deficientes y tumores primarios. Nuestros resultados revelaron que la pérdida de proteína ATM en GC se correlacionan significativamente con la presencia de la mutación del gen intrónica en
ATM
.
En los pacientes de Ataxia-telangiectasia, el 70% -90% de los
ATM
mutaciones sin sentido son, por cambio de marco, o empalme mutaciones que truncan la proteína [16]. De acuerdo con las bases de datos cósmicos (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), las mutaciones en las regiones de
se detectaron ATM
gen en el 5% (433 de 9249) de varios tipos de cáncer de codificación. Entre ellos el cáncer de estómago mostró mutación sólo en un 1,35% (1 de 74). Aunque
ATM
mutación genética en GC se informó anteriormente [3,9], amplia explicación estaba limitado por la baja frecuencia de la mutación y la relativamente alta incidencia de la pérdida funcional de ATM [2]. En nuestro estudio, el 70% de GC mostró MSI positiva significativa
ATM
mutación intrónica gen asociado con la pérdida de proteína ATM. Nuestros resultados apoyan firmemente que la mutación intrónica del
ATM
con MSI subyacente es uno de los principales mecanismos de pérdida de cajero automático en GC humana. pérdida de ATM se atribuye a corte y empalme aberrante asociada con manteca intrónica en líneas celulares de cáncer de colon MSI positivos. Ejima et al. buscado
ATM
mutaciones de genes usando 62 pares de cebadores de oligonucleótidos, que corresponden a la región que va desde el exón 4 a través de exón 65 de
ATM
y sus intrones flanqueantes. El acortamiento de los tractos de mononucleótidos de
ATM
intrones representó el 34 (87%) de 39 intronic cambios. Treinta y uno de ellos se encontraron en las líneas de células tumorales de colon-5 que tienen MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, y LoVo). También mostraron una baja expresión de la proteína ATM en las líneas positivas colorrectales MSI celulares de cáncer [14]. La expresión ATM se reduce significativamente en muchos carcinomas de mama, y no encontró
ATM
mutación en esa línea celular [17]. Esto indica diferentes características de
ATM
alteraciones genéticas entre los cánceres gastrointestinales y de mama.
Además de las mutaciones, los genes supresores de tumores pueden ser inactivados por metilación de residuos de citosina dentro de las islas CpG que se encuentran en el promotor de muchos genes.
ATM
gen es un objetivo novedoso para silenciamiento epigenético través de la metilación inadecuada de su región promotora proximal se correlaciona con el aumento de la radiosensibilidad y expresión de proteínas bajo en una línea humana de células tumorales de colon [18] y la línea celular de glioma humano [18]. sin
ATM
mutaciones genéticas.
El MSI orientación del gen
ATM
representan un vínculo entre MSI y reparación del ADN en GC. Varios estudios indican que la pérdida funcional de ATM se incrementa en MSI y el gen
ATM
humano es un objetivo importante para la inactivación en líneas celulares de GC positivo MSI y tejidos [19,20]. La razón de sorprendentemente alta incidencia de
ATM
mutación del gen intrón en GC MSI positiva podría ser debido a las repeticiones de mononucleótidos (T) 15, y una longitud de 13 nucleótidos o más eran particularmente susceptibles a esta dirigido acortando [14 ]. La frecuencia de
se informó de ATM
mutación del gen del marco de lectura (T) en el exón 7 6 secuencia de codificación en GC MSI positiva a ser sólo el 6% (2/36) [8], que es mucho menor que nuestra observación.
Se ha informado de que la deficiencia de ATM sensibiliza a las células a los efectos inhibidores del crecimiento de inhibidor de PARP, olaparib, en células de cáncer gástrico con reducida
ATM
expresión [21]. inhibidores de la polimerasa poli (ADP-ribosa) se evalúan actualmente en ensayos clínicos contra una variedad de cánceres, incluyendo en el carcinoma de colon [22]. En GC, la deficiencia de ATM es conocida por ser un predictor de la respuesta al inhibidor de PARP [23-25]. Un marcador de la recombinación homóloga, Rad 51, es conocido por ser marcador predictivo de quimioterapia neoadyuvante basada en anthracylcine en el cáncer de mama [26], así como de inhibidor de PARP en GC [24].
Nuestros resultados mostraron que ATM la pérdida de proteínas no es un factor agresivo de la GC, aunque se asocia significativamente con la evolución desfavorable de los recursos humanos en GC negativo MSI. Esto es comparable con otros estudios que reportan la pérdida de proteína ATM como un factor pronóstico adverso [20]. En nuestros estudios,
ATM
mutación y GC negativo ATM tenían características clínico patológicas; sin embargo, este grupo no mostró ninguna diferencia en la supervivencia con los demás. En el grupo negativo MSI, HR de GC con pérdida de proteína ATM fue significativamente más alta, sin embargo, en el grupo positivo MSI, HR en GC con pérdida de proteína ATM no fue significativa. Esto indica que MSI es un factor molecular potenciales que afectan el comportamiento biológico de GC. Por lo tanto, nuestro estudio apoya que el estado MSI podría influir en la sensibilidad al inhibidor de PARP al afectar el estado de daño en el ADN a través de la expresión de proteínas respuesta mononucleótido repite alteraciones.
En resumen,
ATM
mutación genética en GC es del 12,9%, y 33,0% de GC con
ATM
mutación del gen se asocia con la pérdida de proteína ATM. MSI GC mostró positivo
ATM
mutación en el 69,7%. Nuestros resultados sugieren que el resultado de la pérdida de ATM y la sensibilidad al compuesto quimioterapéutico, olaparib, puede entenderse mejor si los casos se estratifican en base a
ATM
estado de mutación del gen o MSI.
Conclusiones
Nuestro estudio reveló
ATM
mutación del gen intrón está presente en el 69% de GC MSI positivo y el 49% de
ATM
mutación intrón está asociado con la pérdida de la proteína ATM. Estos sugieren la
ATM
mutación del gen intrón blanco de la inestabilidad de microsatélites se asocia con la pérdida de proteína ATM en un subconjunto de cáncer gástrico humano.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
correlaciones clínico-patológicas del carcinoma gástrico con la mutación del gen ATM y expresión de la proteína ATM.
doi: 10.1371 /journal.pone.0082769.s001 gratis (DOCX)