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PLOS ONE: Nanosegundo de campos eléctricos pulsantes inhibe el crecimiento del cáncer seguida de alteración en las expresiones de NF-kB y Wnt /beta-catenina moléculas de señalización

2015/11/13


Extracto

El cáncer sigue siendo la principal causa de muerte en el mundo y el número total de casos a nivel mundial es cada vez mayor. estrategias de tratamiento novedosas, por tanto, se requiere desesperadamente para el tratamiento radical de los cánceres y de larga supervivencia de los pacientes. Una nueva tecnología con alto campo eléctrico pulsante ha surgido de aplicación militar en biología y la medicina mediante la aplicación de nsPEF como un medio para inhibir el cáncer. Sin embargo, los mecanismos moleculares de nsPEF sobre tumores o cánceres aún no están claros. En este trabajo, hemos encontrado que nsPEF tenía amplios efectos biológicos en los cánceres, y aclaró sus posibles mecanismos moleculares
in vitro Opiniones y
in vivo
. No sólo podría inducir la apoptosis celular a través de dependiente de la mitocondria vía de la apoptosis intrínseca que se desencadenó por el desequilibrio de proteínas de la familia Bcl-2 anti o pro-apoptosis, sino que también inhiben la proliferación celular a través de la represión de NF-kB vía de señalización para reducir la expresión de proteínas de ciclina . Por otra parte, nsPEF también podría inactivar la metástasis y la invasión de las células cancerosas mediante la supresión de Wnt /β-catenina vía de la regulación negativa de expresiones de proteínas de la familia de VEGF y MMP señalización. Más importante aún, nsPEF podría funcionar de manera segura y eficaz como una terapia anti-cáncer a través de la inducción de la apoptosis de las células tumorales, destruyendo microambiente tumoral, y presionando la angiogénesis en el tejido tumoral
in vivo
. Estos hallazgos pueden proporcionar una estrategia terapéutica creativa y eficaz para los cánceres

Visto:. Ren Z, Chen X, Cui G, Yin S, L Chen, Jiang J, et al. (2013) Nanosegundo de campos eléctricos pulsantes inhibe el crecimiento del cáncer seguida de alteración en las expresiones de NF-kB y Wnt /β-catenina moléculas de señalización. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10.1371 /journal.pone.0074322

Editor: Irina T Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América

Recibido: 10 de mayo de 2013; Aceptado: July 25, 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Ren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la National S & amp; T Proyecto Principal de China (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), SNCF para Innovative Research Group de China (81121002), Zhejiang Médico Financiación de la Investigación (2008B079, LY13H180003), SRF para ROCS, SEM (J20120279 ), y Xinjiang Ciencia y Tecnología Oficina de Proyectos (2013911131). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer siguen siendo la principal causa de muerte en el mundo y representaron 7,6 millones de muertes (alrededor del 13% de todas las muertes) en 2008, según la OMS, y se proyecta que las muertes por cáncer que aumente a más de 11 millones en 2030 [ ,,,0],1]. Una proporción significativa de los cánceres pueden curarse mediante cirugía, radioterapia o quimioterapia, especialmente si se detectan a tiempo. Sin embargo, algunos tipos de cánceres no pueden ser descubiertos en etapa temprana y tienen poca respuesta a la radioterapia y la quimioterapia, por lo tanto, los pacientes con este tipo de cáncer tienen un mal pronóstico. Por ejemplo, el cáncer de páncreas tiene aproximadamente un 23% de supervivencia a 1 año después del diagnóstico y el 5% de supervivencia a los 5 años en el mejor de [2]. Además, había un estimado de 43.140 nuevos casos y 36, 800 muertes atribuidas al cáncer de páncreas en los Estados Unidos [3,4]. Es esencial para buscar una nueva técnica de terapia para mejorar el pronóstico y la supervivencia de pacientes con cáncer.

Una nueva tecnología que utiliza alto campo eléctrico pulsado ha surgido de aplicación militar en biología y medicina mediante la aplicación de campo eléctrico de impulsos de nanosegundos (nsPEF ) como un medio para inhibir el cáncer [5]. La principal característica de nsPEF es su alta potencia y bajo consumo de energía que conduce a muy poca producción de calor y su habilidad especial para penetrar en las células para influir en orgánulos intracelulares [6,7]. Muy diferente de la electroporación membrana plasmática clásica, nsPEF puede producir energía de alta compresión (miles de millones de vatios), duraciones de pulso de ultra cortos (nanosegundos), tiempos de subida rápida (nanosegundos) y campos eléctricos elevados (kV /cm). El pulso de nanosegundo resultante puede penetrar en la célula antes de membrana plasmática está completamente cargada permitiendo nsPEF tener un mínimo efecto membrana plasmática, por lo tanto no causar electroporación [8]. En los últimos años, se han hecho estudios para determinar los efectos de nsPEF en investigaciones experimentales y modelo. Los resultados demostraron que nsPEF podría inducir la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer de
in vitro
[9,10] y un tumor de fibrosarcoma

ex vivo [7], y erradicar el tumor de melanoma B16F10

in vivo [11,12,13]. Sin embargo, los mecanismos moleculares de los efectos biológicos de nsPEF sobre tumores o cánceres aún no están claros.

En esta investigación, hemos tratado de investigar el efecto anticancerígeno de nsPEF y sus posibles mecanismos moleculares a través de
in vitro
y
in vivo
experimentos. Aquí, mostramos que nsPEF podría inhibir significativamente el crecimiento del cáncer
in vitro
y
in vivo
a través de la inducción de apoptosis, inhibición de la proliferación, la inactivación de la invasión y la metástasis, y la destrucción de microambiente tumoral, lo que proporcionará una novela y la estrategia terapéutica eficaz para el cáncer.

Materiales y Métodos

cultivo de células

línea celular de carcinoma de páncreas humano línea celular (PANC-1) y carcinoma hepatocelular (Hep-3B) eran adquirido de Banco de células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Ambas líneas celulares se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.).

la inducción de muerte celular por nsPEF

a medida que nuestra descripción anterior [11], generador nsPEF con una duración de 100 ns se muestra en la Figura S1. Los campos eléctricos variaron de 20 kV /cm a 60 kV /cm. Las formas de onda se controlaron con un osciloscopio digital de fósforo (Figura S1 A & amp; B, DPO4054, Tektronix, EE.UU.) equipado con una sonda de alto voltaje (P6015A, Tektronix, EE.UU.). células PANC-1 se cosecharon con tripsina y se re-suspendieron en medio DMEM fresco con 10% de FBS a una concentración de 5,0 x 10
6 células /ml. 500μl de suspensión de células se colocaron en una cubeta de 0,1 cm hueco (electrodos Figura S1 C, Biosmith, placa de aluminio) y se expuso a 100 pulsos a 0, 20, 40 y 60 kV /cm intensidad de campo eléctrico, respectivamente. La mayoría de las detecciones de las respuestas de células se realizaron a 1 hora después del tratamiento, incluyendo principalmente transwell ensayo, TEM celular, ensayo de escalera de ADN, ensayo de TUNEL celular, citometría de flujo y Western-blot. La viabilidad celular y la tasa de inhibición de proliferación se midieron a diferentes puntos de tiempo después del tratamiento para observar un proceso activo gradual. enteros Los experimentos se repitieron tres veces.

Medición de la viabilidad celular y de proliferación tasa de inhibición

células Panc-1 fueron expuestos a nsPEF y luego cultivadas. 2 × 10
5 células fueron expuestas a nsPEF con diferentes intensidades, y luego se cultivaron durante 0, 0,5, 1, 2, 24 y 48 h, respectivamente. Las células se trataron con tripsina y se contaron las células viables mediante un analizador de la viabilidad celular (células Vi, Backman). Después de la incubación durante 24, 48 y 72 h, respectivamente, las células se calcula contando Cell Kit-8 (8-CCK) ensayo (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, lo que refleja la inhibición celular proliferativa.

la detección de metástasis de las células y la capacidad de invasión transwell ensayo con

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células de supervivencia tratadas en el mismo número para realizar transwell ensayos basados ​​en cámaras transwell (Millipore, USA), lo que refleja la metástasis de células y la capacidad de invasión, tal como se describe anteriormente [14].

Observación de la ultraestructura celular por TEM

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron y se fija con 2,5% de glutaraldehído para observar células las células tratadas ultraestructura mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) en el Centro de Formación de imágenes de Plataformas Científicas, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, como se describe anteriormente [15].

Determinación de la fragmentación del ADN con el ensayo de escalera de ADN

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células tratadas para investigar la fragmentación del ADN celular mediante el ensayo de escalera de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante tal como se describe anteriormente [11].

Medición de la apoptosis de una sola célula con el ensayo TUNEL

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células tratadas para determinar la apoptosis de una sola célula usando el ensayo de TdT-dUTP Nick Terminal Labeling-end (TUNEL) con
In Situ
kit de detección de muerte celular (Millipore, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, tal como se describe anteriormente [14].

Detección de la apoptosis celular con citometría de flujo

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células tratadas para detectar la apoptosis de células por anexina V-FITC kit de detección de apoptosis (BD Biosciences) como se describe anteriormente [16].

Análisis del ciclo celular con citometría de flujo

a 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células tratadas con determinar el cambio del ciclo celular. ensayo de ciclo celular y el análisis se llevó a cabo como se describe anteriormente [17].

Western Blot análisis

A 1 h después del tratamiento nsPEF, se obtuvieron las células tratadas con extracto de proteína. La extracción de proteínas y análisis de transferencia de Western se realizaron como se describe anteriormente [18]. Los anticuerpos primarios y los detalles se enumeran en la Tabla S1.

inducción de tumores en ratones desnudos con células Hep-3B

Los 5 semanas de edad ratones desnudos fueron adquiridos de Shanghai Experimental Animal Centre, Academia China de Ciencias . Los animales experimentales se mantuvieron en las instalaciones de animales central de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang y alojados en armarios de fluencia laminar- en condiciones libres de patógenos especí fi cos a 22 ° C con un ciclo de 12 h de luz /oscuridad. Todos los ratones fueron anestesiados con ketamina (100 mg /kg intraperitoneal). modelos de ratones portadores del tumor se establecieron mediante la inyección de 2 × 10
6 células Hep-3B en el abdomen derecho en ratones. En 1 semana después de la inyección de células, tumor era típicamente 3 mm de ancho y había exhibido angiogénesis. Cuando los tumores crecieron hasta 10 mm de ancho o más --- típicamente alrededor de 4 semanas después de la inyección de células, 50 modelos de ratones portadores de tumores se establecieron y se dividieron con éxito en dos grupos: grupo control (n = 17) y el grupo nsPEF (n = 33) . Los ratones en el grupo nsPEF fueron expuestos a nsPEF (Figura S1 D & amp; E, 100 pulsos, 20 kV /cm) con la abrazadera. Los electrodos de fijación se hicieron de abrazadera del soporte de plástico con 5 mm de ancho delgada de cobre para cubrir el tumor. Nos recubrieron estos electrodos con un gel de ultrasonido para separar la piel del electrodo. Para el tratamiento, cada tumor se colocó entre dos palmas de las abrazaderas con una separación de 0,5 mm, mientras que 100 ns pulsos de duración y 20 kV /cm en la intensidad se aplicaron a una frecuencia de 0,5 Hz. A lo largo del experimento, el ratón se anestesió y se coloca en una etapa de calentamiento que mantiene la temperatura corporal del ratón dentro de la gama normal. Se observaron actividades y los pesos de los ratones física, así como cada tumor y se registran una vez o dos veces por semana. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la '' Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio '' publicado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH publicación 86-23 Revisión de 1985). los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Atención e Instalaciones Animales de la Universidad de Zhejiang.

Tumor
in vivo
de imagen con resonancia magnética especial de ratón

ratones portadores del tumor del grupo de control y nsPEF grupo fueron anestesiados y se pone en la pequeña bobina de ratón (Universidad de Pekín, china), y luego se coloca en la máquina de RMN (Avance 400, Hruker Company, Suiza). El
in vivo
imagen de ratones con tumor que se extirpó.

Muestra recogida

En alrededor de 6,5 semanas después de la inyección de células, todos los ratones fueron sacrificados por la anestesia sobre-dosificado y todos tumores se diseccionaron para comparar. El tejido tumoral se fijó en formalina tamponada con fosfato (10%) para llevar a cabo H & amp; E tinción, ensayo de TUNEL y tinción IHC. Mientras tanto, parte del tumor fue fijado en 2,5% de glutaraldehído (4 ° C, pH 7,4) para realizar TEM tumor

H & amp;. Tinción E e inmunohistoquímica

H & amp; tinción E e inmunohistoquímica (IHC ) se realizaron como hemos descrito anteriormente [19]. anticuerpos y detalles primarios se enumeran en la Tabla S1.

Tumor la detección in situ de apoptosis con TUNEL ensayo

apoptosis de las células del tumor se midió usando el ensayo de TUNEL, llevado a cabo como se describe anteriormente [14].

El análisis estadístico

Los datos actuales se expresan como media ± SEM. el software Graph Pad Prism 5 se aplicó para el análisis estadístico. la apoptosis celular y el ciclo celular se analizaron por FlowJo 7.6.1 Software. La intensidad relativa de cada banda de proteína fue analizada por el software Photoshop CS4. IHC resultados fueron analizados mediante el software Image Pro-Plus. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) con comparaciones múltiples de Dunnett y una, de dos colas la prueba t de Student para datos independientes se utilizaron para el análisis de datos. La significación estadística se fijó en el valor de P & lt; 0.05.

Resultados y Discusión

A pesar de los intensos esfuerzos en las prácticas de tratamiento de los cánceres, las tasas de supervivencia para algunos tipos de cánceres no se han mejorado sustancialmente en los últimos años, como el cáncer de páncreas [2], de próstata carcinoma [20] y el cáncer de pulmón [21]. estrategias de tratamiento novedosas se por lo tanto, desesperadamente necesaria para el tratamiento de los cánceres y de larga supervivencia de los pacientes. Durante el desarrollo de varios pasos, los cánceres humanos adquieren diez características biológicas que incluyen resistencia a la muerte celular, el mantenimiento de señalización de proliferación, activación de la invasión y la metástasis, lo que permite la inmortalidad replicativa, evadiendo supresores del crecimiento, la inducción de la angiogénesis, la reprogramación del metabolismo energético, evadir la destrucción inmune, la inflamación de promoción tumoral, y la inestabilidad del genoma y la mutación [22,23]. Estas características constituyen un principio de organización para la racionalización de las complejidades de la enfermedad neoplásica y objetivos principales se convierten también en la investigación del cáncer y las estrategias terapéuticas. Como una tecnología relativamente nueva para interpretar el cáncer, nsPEF es eficaz en diversas líneas celulares
in vitro
[5,9,10], y B16F10 melanoma y carcinoma hepatocelular [11,24], así como el carcinoma de páncreas humano [25]
in vivo
, lo que demuestra el potencial prospecto aplicación de nsPEF para la terapia del cáncer. Sin embargo, hasta ahora, no queda claro en los mecanismos moleculares de nsPEF en cánceres.

En este estudio, se utilizaron modelos de cáncer tanto
in vitro y Hoteles en
in vivo
experimentos a búsqueda de posibles mecanismos moleculares.

NsPEF inducida por el cáncer de células de la muerte y la inhibición de proliferación
in vitro

para hacer frente a efecto de nsPEF en las células PANC-1, las células fueron expuestas a nsPEF con campo eléctrico en 0, 20, 40 y 60 kV /cm, respectivamente (Figura 1A). La tasa de células viables /control se detecta contando las células con azul de tripano negativas a las 0h, 0,5 h, 1 h y el pulso de post 2h (Figura 1B). Encontramos que las células viables poste pulso se redujo significativamente en comparación con el control (p & lt; 0,001), pero la manera dependiente del tiempo y dependiente de la dosis de esta tendencia reducida no se observaron en un impulso corto poste tiempo, al menos dentro de 2 h. Por otra parte, las células tratadas se cultivaron durante 24 h y 48 h, y luego se calculan respectivamente. Se encontró que las células viables también se redujeron notablemente en comparación con el control (ambos p & lt; 0,001) (Figura 1C & amp; D). Además, las tasas de inhibición de la proliferación celular, detectados por CCK-8 ensayo, se aumentan notablemente en diferentes intensidades a las 48 h y 72 h después de la exposición a nsPEF. Especialmente en 72 horas después de pulso, intensidades más altas tasas de inhibición adquirieron más altas, que muestran una forma dependiente de la dosis, lo que indica que la proliferación de células de supervivencia fue influenciado con dependencia de la dosis (Figura 1E). La figura 1 muestra no sólo las células muertes, sino también inhibición de la proliferación celular inducida por nsPEF.

(A) Horario de las células cancerosas expuestas a nsPEF con diferentes intensidades para contar las células viables y CCK-8 ensayo. (B) La tasa de células viables /control se detecta contando las células con azul de tripano negativas a 0 h, 0,5 h, 1 h, y 2 h impulsos de enviar con diferentes intensidades. *** P & lt; 0,001. El número de células viables (C y D) se calcularon después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades durante 24 h y 48 h, respectivamente. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001. (E) De acuerdo con CCK-8 del ensayo, se detectaron tasas de inhibición de la proliferación de células inducida por nsPEF con diferentes intensidades. ** P & lt;. 0,01

apoptosis celular inducida NsPEF través de la vía dependiente de la mitocondria apoptótica intrínseca
in vitro

En primer lugar, para investigar las características de la muerte inducida por nsPEF en células de carcinoma de páncreas, se han detectado cambios en la morfología de las células después del tratamiento por TEM (Figura 2A). características de las células apoptóticas rara vez se observa en el control (0kV /cm). Sin embargo, las células tratadas con 20 kV /cm nsPEF comenzaron a presentar alteración morfología de las células de la apoptosis temprana: el encogimiento nuclear, muesca nuclear, condensación de la cromatina y marginación, y la degeneración mitocondrias menor. Bajo efecto de 40 kV /cm nsPEF, se observaron otros cambios, incluyendo principalmente la formación de grumos de cromatina, el citoplasma de condensación y algunas vacuolas que aparecen en la membrana celular o en el citoplasma. Mientras tanto, los fragmentos nucleares y componentes citoplasma fueron empaquetados en cuerpos apoptóticos, y las mitocondrias mostraron degeneración vacuolar. Cuando los campos eléctricos aumentaron hasta 60 kV /cm, las células tratadas presentaron lisis de la membrana, formación de ampollas en la membrana nuclear, la lisis nuclear y la fragmentación, así como daños en las mitocondrias, los cuales fueron considerados típicamente como necrosis.

(A) cambios en la morfología de cáncer las células expuestas a nsPEF con diferentes intensidades se observaron por microscopía electrónica de transmisión de la célula (TEM). N: cambios nucleares, incluyendo contracción nuclear, formación de ampollas en la membrana nuclear y la lisis nuclear. M: degeneración mitocondrias o degeneración vacuolar. (B) la apoptosis de células individuales de células cancerígenas expuestas a nsPEF con diferentes intensidades se calculó mediante el ensayo TUNEL de células. Aumento original, 400 ×. *** P & lt; 0,001. (C) Cell fragmentación del ADN de las células cancerosas expuestas a nsPEF se observó mediante el ensayo de escalera de ADN de apoptosis. las tasas de (D) la apoptosis de las células cancerosas expuestas a nsPEF con diferentes intensidades se ensayaron con el ensayo de tinción PI y Anexina-V mediante citometría de flujo. Los resultados se analizaron por FlowJo 7.6.1 Software. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. (E) las expresiones de proteínas de pro-apoptosis Bcl-2 familia anti- /, el citocromo C y la caspasa-3 en células de cáncer después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades se detectaron mediante el ensayo de Western-blot. La intensidad relativa de cada proteína se analizó mediante software Photoshop CS4. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001

A continuación, se estudió el daño del ADN y la fragmentación mediante el ensayo de TUNEL y ensayo de escalera de ADN de la apoptosis. En la tinción de TUNEL, las etiquetas combinadas sitios dañados de ADN y las células apoptóticas se tiñeron de color marrón-amarillo. Hemos observado que las tasas de TUNEL positivas fueron obviamente aumentando en las células PANC-1 mensaje pulso en 20, 40, y 60 kV /cm en comparación con el control, respectivamente (todos p & lt; 0,001) (Figura 2B). En consonancia con los resultados de TUNEL, la fragmentación de ADN presentada en PANC-1 en las células expuestas a nsPEF en 20 y 40 kV /cm, en comparación con el control positivo y el control negativo de ensayo de escalera de ADN (Figura 2C).

Para investigar más a fondo apoptótica grado en las células cancerosas enviar impulsos, hemos probado las tasas de apoptosis de las células tratadas con Anexina-V /PI tinción por citometría de flujo (Figura 2D). En comparación con el control, la tasa de Anexina V
-PI
- células (células viables) se redujo significativamente después de la exposición a nsPEF, pero la tasa de Anexina V
+ PI
- células (principios apoptosis) se incrementó notablemente a 20 kV /cm (p & lt; 0,001), y luego disminuyó significativamente a 40 kV /cm (p & lt; 0,05) y 60 kV /cm (p & lt; 0,01). En agudo contraste, la tasa de Anexina V
+ PI
+ células (apoptosis tardía o necrosis) estaba aumentando continuamente en dependencia de la dosis a las 20, 40 y 60 kV /cm (todos p & lt; 0,01). Estos datos sugieren la muerte células inducida por nsPEF presenta desde apoptosis temprana a tardía apoptosis o necrosis con aumento de la intensidad de nsPEF, en otras palabras, dependencia de la dosis. Estos resultados fueron idénticos con nuestros hallazgos a través de TEM de la célula.

Investigaciones recientes han demostrado que la apoptosis juega un papel importante en la muerte celular inducida por nsPEF [11,26]. De acuerdo con estos estudios, encontramos apoptótica mitocondria cuerpo y la degeneración por TEM después del tratamiento nsPEF. Además, los resultados de ensayo de TUNEL, el ensayo de escalera de ADN de apoptosis y /PI tinción con anexina-V también demostraron la apoptosis inducida por nsPEF en las células PANC-1. Algunos estudios [5,9] informó de que la muerte celular inducida por el cáncer nsPEF se atribuyó principalmente a la apoptosis, e interpretaron que el aumento de Anexina V
+ PI
+ células en dependencia de la dosis podría ser atribuida a una especial "imitando necrosis "que la alta dosis de pulso inducido agujeros más grandes en las membranas celulares y células continuación PI tinción introducido. Sin embargo, nuestra mayor evidencia a través de TEM celular demostró que la muerte celular presenta desde principios de la apoptosis a finales de la apoptosis o necrosis, con aumento de la intensidad de nsPEF, no sólo la apoptosis de la célula
.
La apoptosis intrínseca inducida por estímulos inductores de estrés y la apoptosis extrínseca través de la activación del receptor de muerte son dos vías principales de apoptosis. la función de las mitocondrias y proteínas Bcl-2 anti /pro-apoptosis familia desempeñan papeles esenciales en la vía de la apoptosis intrínseca [27]. miembros de la Bcl-2 de proteínas anti /pro-apoptosis son proteínas integrales de membrana inicialmente se encuentran en las mitocondrias, retículo endoplasmático (ER), o membrana nuclear [28]. Un sitio de activación importante de proteínas Bcl-2 es de membrana mitocondrial [27]. Para explorar posibles mecanismos de apoptosis inducida por nsPEF, se han detectado proteínas expresión relativa de la vía intrínseca de apoptosis, tales como proteínas pro-apoptosis familia Bcl-2 (malo, p-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak y Puma) , pro-supervivencia proteínas de la familia Bcl-2 (p-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-xL y MCL-1), y la apoptosis proteínas directamente relativos (citocromo-C y la caspasa-3) (Figura 2E). En comparación con el control, las expresiones de las proteínas Bcl-2 de la familia anti-apoptosis, incluyendo principalmente p-Bcl-2, Bcl-XL y Mcl-1, se redujeron notablemente en diferentes grados, mientras que las expresiones de proteínas de la familia Bcl-2 pro-apoptosis , incluyendo principalmente Bax, Bim y el BID, fueron significativamente elevados en diferentes grados con el aumento de la intensidad de nsPEF. Mientras tanto, las expresiones de citocromo-C y la caspasa-3 eran obviamente aumentaron después de la exposición a nsPEF. Llegamos a la conclusión de que la apoptosis inducida por nsPEF fue provocada por la regulación de desequilibrio de las proteínas de la familia Bcl-2 anti o pro-apoptosis en la membrana mitocondrial. Estos resultados fueron consistentes con la degeneración mitocondrias y daños en la celda ultra-estructura. Colectivamente, estos datos indicaron que apoptóticas nsPEF indujo apoptosis en células Panc-1 a través de la mitocondria dependen de la vía intrínseca de la apoptosis que se desencadenó por el desequilibrio de las proteínas anti o pro-apoptosis Bcl-2 de la familia.

NsPEF inhibe la proliferación celular a través de la represión de NF-kB vía de señalización
in vitro

Además de la apoptosis, nsPEF tuvo una notable influencia en la proliferación de las células de nuestro ensayo de CCK-8 que la tasa de inhibición de la proliferación celular se incrementó notablemente de una manera de la dependencia de la dosis y la dependencia temporal de impulsos después de 48 h después. En el ciclo celular, la traducción de la fase G1 a la fase S y el porcentaje de fase G2 /M refleja típicamente célula capacidad proliferativa. Examinamos ciclo celular de las células tratadas, y se encontró que el porcentaje de la fase G1 se incrementó obviamente (p & lt; 0,01), mientras que el porcentaje de la fase G2 /M se redujo (p & lt; 0,05) después de la exposición a nsPEF (Figura 3A), lo que indica que nsPEF podría detener la fase G1 del ciclo celular para inhibir la proliferación celular.

(a) del ciclo celular de las células cancerosas expuestas a nsPEF con diferentes intensidades se examinó con ensayo de tinción PI por citometría de flujo, y los resultados se analizaron por FlowJo 7,6 Software 0.1. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. (B) las expresiones de proteínas de la vía de señalización NF-kB, incluyendo IKK-α, β IKK-α-I? B, p65 y p-p65 en células de cáncer después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades fueron detectados por el ensayo de Western-blot. (C) las expresiones de proteínas de las proteínas de ciclina incluyendo ciclina D1 y ciclina A en las células cancerosas después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades se detectaron mediante el ensayo de Western-blot. La intensidad relativa de cada proteína se analizó mediante software Photoshop CS4. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001

vía de señalización de NF-kB juega un papel importante en la proliferación celular [29]. la inhibición del crecimiento del cáncer a través de la inhibición de NF-kappa B ha sido recientemente descrito en varios carcinomas humanos, tales como de colon [30], de pulmón [31] y de mama [32]. Los genes diana regulación de la proliferación celular a través de la vía NF-kappa B incluyen c-Myc, CyclinD1, ciclina E y CDK2, que desempeñan un papel esencial en la regulación positiva o negativa de ciclo celular [33,34]. Para explorar más a fondo los posibles mecanismos de inactividad proliferativa de las células pulsadas, se detectó expresión de NF-kB señalización proteínas de la vía y las proteínas ciclinas en las células PANC-1. Nuestros resultados revelaron que las expresiones de proteínas de la vía NF-kB incluyendo IKK-α, IKK-β, I? B-α, p-65 NF-kappa B y p-p65 eran obviamente disminuyeron después de la exposición a nsPEF frente al control (todos p & lt; 0,01 o 0,001) (Figura 3B). Mayor intensidad de nsPEF llevó a expresiones mucho más bajos de estas proteínas en comparación con el control. Mientras tanto, las expresiones de las proteínas de ciclina incluyendo CyclinD1 y Ciclina A también se redujeron significativamente después de la exposición a nsPEF frente al control (p & lt; 0,01, 0,001, o 0,05) (Figura 3C). Así consideramos que nsPEF podría deprimir NF-kB vía para reducir las expresiones de las proteínas de ciclina señalización.

Estos datos sugirieron que nsPEF inhibió la proliferación celular a través de la represión de NF-kB vía de señalización para reducir la expresión de proteínas de ciclina, deteniendo de ese modo la fase G1 del ciclo celular.

NsPEF la migración celular y la invasión inactivado mediante la supresión de la vía de señalización de Wnt /β-catenina
in vitro

la activación de la metástasis y la invasión es una característica importante de cáncer [22,23]. El grado de metástasis y la invasión es un estándar para clasificar etapa del tumor maligno, y también determina directamente estrategias terapéuticas de cáncer y la supervivencia de los pacientes [35]. , Por lo que detectamos la capacidad de la migración y la invasión de las células del cáncer después del tratamiento. En nuestro estudio, la capacidad de migración de células de cáncer de enviar impulsos se redujo marcadamente inferior con el control mediante ensayo Trans pocillos (p & lt; 0,001) (Figura 4A). Además, hemos encontrado que las células cancerosas expuestas a nsPEF poseían una capacidad significativamente débil para invadir comparación con el control usando el ensayo de invasión Matrigel (p & lt; 0,001) (Figura 4B). Estos resultados demostraron que nsPEF podría disminuir la metástasis e invasión celular en el cáncer.

(A) la capacidad de migración de las células cancerosas expuestas a nsPEF se ensayó mediante el ensayo de trans-así. Las células migraron expuestos a nsPEF se tiñeron de color púrpura por la solución de cristal violeta al 0,1%, observado bajo microscopio de luz durante 40 o 400 aumentos, y se contaron para el análisis estadístico. Aumento original, 40 × & amp; 400 ×. *** P & lt; 0,001. (B) la capacidad de invasión de las células cancerosas expuestas a nsPEF se detectó usando el ensayo de invasión de Matrigel. Después del tratamiento nsPEF, las células que poseían la capacidad de invasión penetrado a través de la matrigel, se tiñeron de color púrpura por solución de cristal violeta 0,1%, y se contaron para el análisis estadístico. Aumento original, 40 × & amp; 400 ×. *** P & lt; 0,001. (C) las expresiones de proteínas de vía de señalización Wnt /β-catenina incluyendo hDPR1, β-catenina y c-Myc en las células cancerosas después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades fueron detectados por el ensayo de Western-blot. expresiones (D) de proteína de MMPs familia y VEGF en las células cancerosas después de la exposición a nsPEF con diferentes intensidades se detectaron mediante el ensayo de Western-blot. La intensidad relativa de cada proteína se analizó mediante software Photoshop CS4. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001

La evidencia acumulada ha demostrado que la vía de señalización de Wnt /β-catenina desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario y diversos tumores malignos humanos. [36]. Las acciones de los /β-catenina vía de señalización Wnt en las células diana incluyen principalmente alteraciones en la expresión génica, la polarización celular, la migración y la invasión a través de la regulación de las moléculas sensibles aguas abajo distintas [37]. Como efector aguas abajo de /β-catenina vía de señalización Wnt, proteínas de la familia MMP y VEGF juegan un papel crítico en la invasión tumoral y la metástasis [38]. De este modo se detectó proteína expresiones de Wnt /β-catenina vía de señalización, la familia MMP y VEGF. Hemos encontrado que las expresiones de Wnt /β-catenina señalización proteínas de la vía, incluyendo principalmente hDPR1, β-catenina y c-Myc en las células cancerosas expuestas a nsPEF fueron notablemente disminuido con dependencia de la dosis en comparación con el control (p & lt; 0,05 a 20 kV /cm, p & lt ; 0,01 a 40 kV /cm, p & lt; 0,001 a 60 kV /cm) (Figura 4C). Además, los resultados también indicaron que las expresiones de proteínas de la familia de VEGF y MMP incluyendo principalmente MMP1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP12, MMP14 y MMP21 se redujeron significativamente en diferentes grados con diferentes intensidades de nsPEF frente al control (Figura 4D). Así que pensamos que nsPEF pudo reprimir Wnt /β-catenina vía de señalización para regular a la baja la expresión de genes de proteínas de la familia de VEGF y MMP.

Estos resultados sugieren fuertemente que nsPEF podría inactivar la metástasis e invasión capacidades de las células cancerosas mediante la inhibición Wnt /β-catenina vía de señalización para regular a la baja la expresión de genes de proteínas de la familia de VEGF y MMP.

NsPEF funcionó de manera segura y efectiva como una terapia antitumoral
in vivo

sobre la base de la
vitro
experimento en, nsPEF podría inducir apoptosis de las células, inhibir la proliferación celular, e inactivar la metástasis y la invasión. Para identificar adicionalmente la función de anti-tumor de nsPEF, se realizó el experimento nsPEF en el modelo de ratones portadores de tumor ectópico. El modelo de tumor ectópico es un estudio piloto para más modelo ortotópico en profundidad que refleje mejor las aplicaciones clínicas
.
Durante todo el experimento con animales, 2 ratones en el grupo nsPEF murieron a causa de la anestesia sobre-dosificado y 1 en el el control murió de causas ambiguas. Hemos observado condición de supervivencia de los 47 ratones de descanso que tienen tumores (16 en el control y 31 en el grupo nsPEF), y observó que los ratones nsPEF mantiene la actividad física normal y no tenía ninguna influencia sobre el peso de ratones (Figura 5A), lo que indica que anti- la función del tumor de nsPEF era seguro para el cuerpo mismo
in vivo
.

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