Extracto
retos heterogeneidad intratumorales paradigmas para la terapia contra el cáncer existentes. Hemos demostrado anteriormente que las células madre embrionarias humanas (células madre) -derivado microambiente celular en ratones inmunocomprometidos, permite distinción funcional de las células tumorales heterogéneos, incluyendo las células que no crecen en un tumor en una plataforma de xenoinjerto de tumor directa convencional. Hemos identificado y caracterizado seis subpoblaciones celulares de cáncer cada clonal ampliado de una sola célula, derivado de ovario humano carcinoma de células claras de un solo tumor, para demostrar sorprendente heterogeneidad fenotípica intratumoral que depende dinámicamente en el microambiente crecimiento del tumor. Estas subpoblaciones celulares de cáncer, caracterizados como subpoblaciones de células madre de cáncer, recapitulan fielmente el espectro completo de la heterogeneidad fenotípica histológica conocida para el carcinoma de células claras de ovario humano. Cada uno de los seis subpoblaciones muestra un nivel diferente de la morfológica y diferenciación tumorigénico en el que el crecimiento en el microambiente células madre derivadas favorece el crecimiento de CD44 + /aldehído deshidrogenasa bolsillos positivos de células auto-renovación que sustentan el crecimiento del tumor a través de un proceso de diferenciación tumorigénico en CD44- /derivados negativos aldehído deshidrogenasa. Sorprendentemente, estas células derivados exhiben plasticidad microambiente dependiente con la capacidad para restaurar marcadores de auto-renovación y expresión CD44. En el estudio actual, en que se delimiten la expresión de genes distintos y perfiles epigenéticos de dos de tales subpoblaciones, que representan los extremos de heterogeneidad fenotípica en términos de nicho dependiente de auto-renovación y diferenciación tumorigénico. Mediante la combinación de conjunto de genes de enriquecimiento, ontología de genes y Pathway-centrado analiza matriz con el estado de metilación, se propone un conjunto de diferencias robustas en tumor de auto-renovación y diferenciación de las vías que subyacen a la sorprendente heterogeneidad fenotípica intratumoral que caracterizan a este y otros tumores sólidos malignos.
Visto: Abelson S, Shamai Y, Berger L, K Skorecki, Tzukerman M (2013) nicho dependiente de la Expresión génica del perfil de intratumoral heterogéneo cáncer de ovario poblaciones de células madre. PLoS ONE 8 (12): e83651. doi: 10.1371 /journal.pone.0083651
Editor: Anita B. Hjelmeland, Clínica de Cleveland, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de mayo de 2013; Aceptado: 6 de Noviembre de 2013; Publicado: 17 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Abelson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Soporte Finnancial para esta investigación fue proporcionado por la Fundación Benéfica Daniel M. Soref, la Fundación Skirball y por una beca de investigación de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención Nº 453 /06MT y concesión N º 62/10 MT) .Los donantes tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ahora es ampliamente apreciado que un solo tumor está compuesto de poblaciones heterogéneas de células, cada una de las cuales muestra una morfología celular, diversa expresión fenotípica, las capacidades de la iniciación del tumor y la inherente o la resistencia adquirida a fármacos contra el cáncer. La investigación recientemente publicado que describe la heterogeneidad intratumoral del comportamiento celular y funcional cáncer colorrectal, que se muestran por una amplia variación en la dinámica de crecimiento, la persistencia a través de pasajes de xenoinjertos de serie y la respuesta al tratamiento resalta aún más la complejidad de los tumores humanos [1].
La agresividad y el ingenio de los cánceres humanos emanan principalmente de tal heterogeneidad intratumoral compleja, que a su vez se ha atribuido a cambios genéticos y epigenéticos, junto con las respuestas de adaptación al microambiente tumoral. La evidencia acumulada demuestra que el modelo de "células cancerosas madre '(CSC) y el modelo de evolución clonal, sí contribuyen a la heterogeneidad intratumoral, como CSC mismos se someten a la evolución clonal [2-7]. La acumulación continua de mutaciones genera heterogeneidad de las células dentro de un tumor sólido y sus metástasis, y puede reflejar el proceso por el cual ciertos subconjuntos de células tumorales se vuelven más agresivos en el proceso de progresión del tumor. Una visión crucial se refiere a la comprensión de que la capacidad de auto-renovación de las células madre del cáncer no es un estado duradero, sino más bien dinámica y dependiente del nicho. señales de interacción estroma tumoral también regulan la plasticidad de las células del cáncer epitelial a través del epitelio de los programas de transición mesenquimal (EMT) que, además de facilitar la invasión y la metástasis de las células cancerosas, permite la conversión de los no células madre cancerosas en células madre cancerosas y pueden influir en la alteración del microambiente del tumor mediante la conversión las células cancerosas en el tumor de estroma de apoyo [8-11]. Como tal, la complejidad y la plasticidad de los tumores sólidos emana de la exigencia de un microambiente de apoyo que proporciona una red compatible de las interacciones entre las células cancerosas heterogéneas y diversas células de soporte del tumor [12-16]. El reclutamiento de tumor de soporte células madre mesenquimales pluripotentes, junto con una amplia remodelación de los tejidos adyacentes es un proceso esencial para proporcionar un microambiente que apoya la proliferación de células de cáncer, la migración y la invasión [17,18]. Los procesos específicos que se han estudiado más ampliamente incluyen neo-angiogénesis [19], la atracción de células inflamatorias [20] y el cáncer asociado fibroblastos [21-23] que junto con la matriz extracelular (ECM) crear la complejidad de la masa tumoral [24] .
modelos Xenotransplantation para la generación de tumores humanos en ratones inmunodeficientes están limitados por las diferencias entre la murina y el microambiente humano, especialmente con respecto a las propiedades de nicho dependiente de CSC auto-renovación [25,26]. En muchos casos, esta limitación conduce a diferentes salidas de lectura de subclones tumorales distintos en ensayos de xenotrasplante [5,21,27,28]. En consecuencia, hemos establecido y validado un modelo microambiente tumoral basada en el potencial de las células madre embrionarias humanas (células madre) para generar teratomas en ratones inmunodeficientes. Este modelo tiene la facilidad de modelos de xenoinjerto estándar, pero la ventaja de que el microambiente tumoral se compone de una amplia variedad de tejidos no transformadas diferenciadas derivadas de las tres capas germinales y las estructuras de origen humano [29,30]. Hemos demostrado anteriormente que este
in vivo
modelo proporciona un microambiente tumorigénesis preferencial con las siguientes características: a) una mayor viabilidad de las células del tumor; b) invasión de células tumorales prominente; c) vasculogénesis inducida por el tumor; y d) relativa protección de la regresión inducida inmunotoxina [29,30].
ovárico carcinoma de células claras (OCCC), se caracteriza por golpear heterogeneidad morfológica intratumoral, incluyendo las células con características de variación estructural de ovario avanzado, por un lado, y las células con características de diferenciación tumorigénicos (por ejemplo, invasión, proliferación) y superficie de la célula correspondiente y intracelular marcador heterogeneidad [31-35]. Hemos aislado y caracterizado seis subpoblaciones celulares de cáncer diferentes (CCSPs) de un tumor de un solo paciente, y demostró nicho dependiente capacidades tumorigénicas y fenotipos histológicos cuando se crece dentro del tejido teratoma hESC derivados, que acumulativamente recapitular el espectro completo de la heterogeneidad tumoral [ ,,,0],36]. Los seis CCSPs se caracterizaron como CSC de ovario, en virtud de la expresión fenotípica y funcional de CD44 + CD24 + EpCAM + y la actividad ALDH1 [5,36]. Además, estos seis distintas subpoblaciones se han caracterizado funcionalmente como se presentan las propiedades de células madre clave de ambas capacidades de auto-renovación y diferenciación tumorigénico en una forma dependiente de nicho. En el nicho murino, existe un apoyo limitado para la auto-renovación de CSC, junto con una alta tasa de diferenciación tumorigénico, mientras que el nicho de células madre derivadas de manera más prominente mantiene CSC auto-renovación en oposición a la diferenciación. Por lo tanto, el modelo basado en células madre ofrece una importante
in vivo
plataforma en vista del papel esencial de la CSC auto-renovación en la resistencia a las terapias contra el cáncer y en la prestación de heterogeneidad intratumoral susceptibles de análisis biológico, así como las pruebas de terapia contra el cáncer [5]. Por otra parte, se ha demostrado recientemente que el modelo basado en células madre expresan
de buena fe
vasos sanguíneos tumorales humanas y mejorar la proporción de injertos tumorales por las células primarias humanas de cáncer de ovario madre-como (CSC) [37]. En consecuencia, el objetivo fue examinar los respectivos perfiles de expresión génica de dos CCSPs derivados de OCCC diferentes que representan los extremos del espectro en términos de nicho dependiente de auto-renovación frente a la diferenciación tumorigénico. Los resultados obtenidos vías de relieve que rigen la heterogeneidad intratumoral en la expresión génica y niveles epigenéticos, y la importante contribución del microambiente del tumor a esta heterogeneidad.
Materiales y Métodos
Derivación de las subpoblaciones de células de cáncer de ovario
Colección de líquido ascítico se realizó con un consentimiento informado por escrito de un paciente de 64 años diagnosticado de ovario en estadio IV Claro Carcinoma de células y el protocolo fue aprobado por el Comité de Revisión institucional de Ética del Centro Médico Rambam. Seis subpoblaciones celulares de cáncer diferentes, clonal ampliado de una sola célula, incluyendo CCSP C12 y C13, se derivaron de la ascitis de ovario malignos y propagaron en cultivo como se describe anteriormente [5,36]. ensayos de clonalidad usando el método de HUMARA [38] y el análisis de STR Forense indicaron un origen monoclonal para todos los seis CCSPs examinados (datos no mostrados). Sin embargo, el análisis de cariotipo de los cromosomas en metafase extraídos de cada subpoblación de células de cáncer, se extendió sobre portaobjetos y se analizaron por Spectral-Cariotipo (SKY), demostró un alto nivel de cambios cromosómicos y variaciones entre los CCSPs (datos no mostrados). Cabe señalar que, si bien se mantuvieron en cultivo durante más de 6 años, los cultivos celulares se inician en varias ocasiones de existencias congeladas, cada 3-4 meses, y los CCSPs duraderamente y mantengan constantemente los "
de buena fe
" las características del cáncer de ovario , características CSC y tumor xenoinjertado fenotipo histológico [5,36].
Animales, teratoma, formación y gastos de tejido tumoral
SCID /ratones de color beige se adquirieron de Harlan Laboratories Ltd., Jerusalén, Israel. Los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos según las instrucciones del Comité de Supervisión de la experimentación con animales en el Technion - Instituto de Tecnología de Israel, Haifa, Israel. Esto fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Technion (Protocolo#IL-026-02-12). Los ratones se observaron durante el teratoma y tumores formación de una vez por semana y se sacrificaron mediante CO
2 inhalación. Para la formación de teratoma, células madre no diferenciadas a partir del clon H9.1 (46XX), se inyectaron en la musculatura de las extremidades posteriores de ratones (~ 5x10
6 células por inyección) [29]. En 7-8 semanas después de la inyección inicial de la hESC, 4X10
6 células cancerosas se inyectaron en el teratoma (i.t tumores) y se dejaron crecer durante otros 20 a 60 días. Los tumores de control derivadas de inyección directa (tumores im) de 4x10
6 células en la musculatura de las extremidades posteriores fueron cosechadas en 20 a 60 días después de la inyección.
estudios de expresión génica
Los estudios de expresión eran llevado a cabo con tres conjuntos de muestras independientes utilizando el Illumina HumanWG-6 expresión V3.0 matriz BeadChip. Las imágenes escaneadas fueron analizados utilizando el software de Illumina GenomeStudio V.2009.1 (iluminación Inc San Diego, CA, EE.UU.) para la extracción y control de calidad. Los datos en bruto obtenido de los tres experimentos independientes de microarrays se importaron en el software de la genómica (Genómica suite; Partek Inc., St. Louis, MO), normalizada, y una eliminación de cualquier lote, "efectos" no biológicos, que pueden interferir con la los resultados obtenidos. Las señales de expresión de genes se transformaron mediante el cálculo de la base de dos logaritmos. Los genes que su determinado transcripción no se expresó sobre el fondo definido por las sondas de control negativo de la BeadChip Illumina en todas las muestras se separaron por filtración. Los datos se han depositado en el Centro Nacional de Información de Biotecnología GEO7, y son accesibles a través de GEO serie GSE43208 adhesión.
La expresión diferencial de los genes individuales
Los genes que son regulados diferencialmente en cada grupo, fueron seleccionados en función de su factor de cambio. El promedio de las señales de los genes normales entre los distintos grupos se comparó y se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística de la diferencia veces entre ellos. Los genes fueron seleccionados sobre la base de cambio veces (& gt; 2), y la correspondiente estadística de p-valor significativo (& lt; 0,05). Para reducir la posibilidad de falsos positivos, genes que no siguió el umbral de 2 veces en cada una de las 3 arrays de expresión génica independientes fueron omitidos.
análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA)
GSEA se realizó utilizando el software basado en Java [39]. Se utilizó la herramienta de Análisis de borde de ataque (LEA) para extraer el gen miembros del núcleo de los conjuntos de genes enriquecidos con el fin de crear listas de genes que producen la mayor contribución a las puntuaciones de enriquecimiento correspondientes (ES) obtenidos para cualquiera C12 im, C12 es, C13 im, y que las diferencias de clase C13. Se determinó 0,05 después de 1.000 permutaciones aleatorias; un umbral conservador de la tasa de falsos detección (FDR) & lt; 0,05 y el valor p & lt. Sólo los principales genes de borde que fueron compartidos por al menos 5 conjuntos de genes enriquecido estadísticamente fueron posteriormente utilizados para el análisis de ontología de genes.
Gene Ontología (GO) el análisis
La herramienta basada en la web del gorila (http : //cbl-gorilla.cs.technion.ac.il) que utiliza clasificado listas de genes se utilizó con el fin de identificar las anotaciones GO enriquecido [40]. Como entradas de la lista de destino, se utilizaron los miembros de genes del núcleo de herramienta GSEA LEA se correlaciona con C12 o C13 tumores derivados que se desarrollaron intramuscular (i.m.) o intra-teratoma (i.t). Las cuatro listas de objetivos fueron utilizadas por separado, mientras que la lista que representa a todos los genes probados en la plataforma de la expresión de genes Illumina sirvió de fondo para cada uno de los análisis. Un umbral conservador valor de p & lt; 0,005 fue elegido después de la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples
criterios de análisis restrictivas
1) Los genes que no siguieron el umbral de 2 veces en cada uno de los 3 independiente. arrays de expresión de genes se omitieron (criterios muy restrictivos). 2) En el GSEA, conservador nominal valor de p & lt; 0,05 (p NOM) y FDR valor de q & lt; 0,05 se eligieron se utilizó 3) LEA. 4) En el análisis de enriquecimiento GO, de corte del valor de p & lt;. Se eligió 0,005
Las matrices Pathway-Centrado
El Wnt humana, Sonic Hedgehog y Notch vía de señalización RT
2 matrices de perfiles de PCR (SuperArray Bioscience, Frederick, EE.UU.) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 1 g de ARN como material de partida en cada matriz. El análisis de los datos se realizó con la matriz de PCR basada en la web SABiosciences software de Análisis de Datos (http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) y el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).
La extracción de RNA a partir de muestras tumorales microdiseccionadas láser, y de
en
in vitro
células en crecimiento, analiza QRT-PCR y secuenciación de bisulfito se describen en Materiales y Métodos S1. Genes cebadores específicos utilizados para QRT-PCR y análisis de bisulfito se proporcionan en las Tablas S2 y S3.
Resultados
Perfiles de expresión de células de cáncer heterogéneas derivadas de OCCC
in vitro y
in vivo
recientemente hemos informado de la observación de que la heterogeneidad consistente en propiedades oncogénicas entre seis CCSPs derivados de diferentes OCCC se reflejó más sorprendente en su nicho dependiente de
in vivo
capacidades oncogénicas y fenotipos celulares tumorales [36], y que el nicho de células madre derivadas apoya aún más la auto-renovación de CSC y expone todo su repertorio de fenotipos tumorigénicos [5]. Con el fin de arrojar luz sobre la contribución microambiente tumoral a esta heterogeneidad, nos centramos en microarrays de expresión génica análisis para caracterizar los perfiles de expresión génica de dos subpoblaciones celulares de cáncer distintos, CCSP C12 y C13 que crecen con éxito tanto en el xenotrasplante y el hCME basados en los modelos teratoma, y que presentan los extremos de atributos fenotípicos tumorigénicas y la capacidad de auto-renovación nicho dependiente de [5,36]. tumores derivados-C12 se caracterizan por una abundancia de estructuras ováricas altamente diferenciadas, mientras que C13 derivados de tumores exhiben pobre diferenciación estructural de ovario [36]. Además, C13 conserva su capacidad de auto-renovación como se demuestra por
in vivo
perpetuación de células cancerosas tumorigénicas tanto en el murino y el tejido celular células madre derivadas de C12, mientras que no perpetuar las células oncogénicas en el tejido murino, pero genera tumores altamente agresivos e invasivos dentro del tejido celular células madre derivadas [5]. A la luz de este efecto sorprendente, que tuvo como objetivo delinear el perfil de expresión génica de CCSP C12 y C13 tumores derivados como un reflejo de la interacción entre las células tumorales y el microambiente tumoral. Las muestras de ARN se extrajeron a partir de C12 y C13 crecido en cultivo de células, y de los tumores generados i.m y i.t (cada muestra por triplicado) y se hibridaron en arrays de expresión de todo el genoma (ver Material y Métodos). Representación esquemática del procedimiento de análisis se describe en la Figura 1. La matriz se realizaron análisis en los siguientes niveles: C12 C13 frente a
in vitro
células cultivadas, C12 frente a tumores im C13 y C12 C13 frente que los tumores (Figura 1A , B). Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) de los datos obtenidos para evaluar la contribución relativa jerárquica de las diferencias en la expresión de genes entre las muestras (Figura 2A). agrupación distinta de C12
in vitro
células cultivadas muestras y C13
in vitro se observó
de muestras de células cultivadas, sin embargo, una relación obvia entre el C12 se demuestra im y muestrea y entre C13 y im muestras, lo que indica diferencias significativas en los perfiles de expresión génica entre CCSPs C12 y C13. análisis de agrupamiento jerárquico (HCA) de cada muestra por triplicado adicionales confirma estos resultados (Figura 2B). los genes expresados diferencialmente (DEG) entre C12 y C13
in vitro
células cultivadas y entre los tumores generados im y que fueron identificados con base en el cambio veces (& gt; 2) y los correspondientes valores de p estadísticamente significativas (& gt; 0,05) . Superposición de DEG en todas las muestras examinadas reveló 47 genes superpuestos que se han cambiado significativamente (Figura 1A) que comprenden las diferencias fundamentales entre C12 y C13 subpoblaciones celulares de cáncer, de los cuales, 26 y 21 genes demostraron una expresión elevada en C12 y en C13 respectivamente (Tablas 1 y 2).
Un
, flujo de trabajo de los análisis realizados para perfiles de expresión génica de células de cáncer subpoblaciones (CCSPs) C12 y C13
en
in vitro
y
en
in vivo
.
B Opiniones, Identificación de genes expresados diferencialmente entre C12 y C13
en
in vitro
células cultivadas y entre los tumores generados por vía intramuscular (im) y intrateratoma (es), y Gene Ontología anotaciones que se correlacionan con tumores generados im y
Un
, los resultados del ACP se proporcionan como representaciones bidimensionales basándose en los resultados de contribución para los dos primeros componentes. La discriminación entre subpoblaciones muestras (CCSPs) C12 y C13 celulares de cáncer se muestra como se indica en la captura de color.
B Opiniones, agrupación jerárquica de las muestras usando todos los elementos de sonda 48,803 en el chip del grano Illumina demostraron la variabilidad entre las muestras CCSPs C12 y C13.
Elevada en CCSP C12 C12
vs células C13
C12 C13 vs im
C12 C13 vs
Illumina probe_ID
Gen Símbolo
Gen
doble cambio
valor p
doble cambio
p-valor
doble cambio
valor p
ILMN_1677814ABCC3ATP de unión de cassette, subfamilia C (CFTR /MRP), miembro de factor de 310.030.00212.40010.400.003ILMN_2081070BTCbetacellulin6.380.0012.7103.290ILMN_1677108CAPN13calpain 135.800.01211.070.0015.930.005ILMN_1777190CFDcomplement D (adipsina) 4.370.0013.6803.140.001ILMN_1656560DKFZP564O0823prostate proteína similar a la mucina regulada por andrógenos 15.2503.780.0013.830.004ILMN_1815673DKK3dickkopf WNT inhibidor de la vía de señalización WNT 32.630.0256.380.0036.270.004ILMN_2398159DKK3dickkopf inhibidor de la vía de señalización 33.210.0098.700.0018.490.001ILMN_1729455EML1echinoderm asociada a los microtúbulos proteínas como 13.150. 0105.680.0035.680ILMN_1743445FAM107Aamily con similitud de secuencia 107, miembro de A29.680.00917.21016.300ILMN_1715748FLNCfilamin C, gamma10.7003.750.0064.380.001ILMN_1799744GALCgalactosylceramidase9.140.00112.380.00113.480ILMN_1726666GPX3glutathione peroxidasa 3 (plasma) 169.140409.810368.950ILMN_1696183HBQ1hemoglobin, theta 17.6802.9903.020ILMN_2217329IAH1isoamyl de etilo-hidrolizar esterasa 1 homólogo (S. cerevisiae) 13.4309.4506.930ILMN_1673521KISS1RKISS1 receptor5.6204.1403.970ILMN_1662358MX1myxovirus (virus de la gripe) Resistencia a 1, p78 proteína de interferón-inducible (ratón) dominio de la familia 17.36039.970.00127.660ILMN_1709814NMRAL1NmrA similar que contiene derivados de 18.7409.41010.100ILMN_1680339PDGFRLplatelet del receptor del factor de crecimiento-like2.950.0035.200.0015.310.001ILMN_1792506PLA1Aphospholipase miembro de la familia A1 A4.8402.4902.840.003ILMN_1736533RND2Rho GTPasa 26.800.0017.360.0016.500.002ILMN_1726928TCEA3transcription Un factor de elongación (SII ), proteína 312.4903.970.0015.620ILMN_1760245TMEM42transmembrane 426.780.0015.260.0015.190ILMN_1713990TRIP6thyroid interactor receptor de la hormona 63.370.0016.210.0015.120.004ILMN_1670377ZNF20zinc proteína con dedos 203.950.0016.4905.680ILMN_1798533ZNF22zinc proteína con dedos 227.7206.7206.570ILMN_2117904ZNF22zinc proteína proteína con dedos 227.6906.5107.660ILMN_1728710ZNF816Azinc dedo 8166.510.0017.040.0017.220 proteína con dedos ILMN_1802053ZNF91zinc 914.180.0063.9003.770.001Table 1. genes expresados diferencialmente entre las subpoblaciones de células cancerosas (CCSPs) C12 y C13
en
in vitro
células cultivadas y entre los tumores generados por vía intramuscular (im) y intrateratoma (IT).
Los valores de cero (0) = menos de 0,001 Descargar CSV CSV elevada en CCSP C13 C13
vs células C12
C13 C12 vs im
C13 vs C12 que
NOMBRE
gene Símbolo
Gen
doble cambio
valor p
doble cambio
valor p
doble cambio
valor p
ILMN_1802167ALDH1L1aldehyde deshidrogenasa 1 familia, L15.1103.870.0016.570.001ILMN_1805410C15orf48chromosome miembro 15 de lectura abierta factor de 488.380.0073.060.0092.830.002ILMN_1774287CFBcomplement marco B4.450.0013.500.0015.350ILMN_1810942CYP3A5cytochrome P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido de dominio que contiene 54.870.0115.760.0179.230.007ILMN_1725597FXYD4FXYD regulador de transporte de iones 44.570. 0056.080.0056.800.004ILMN_1660973GAD1glutamate descarboxilasa 15.440.0012.520.0022.550.001ILMN_1712082GCNT3glucosaminyl (N-acetil) transferasa 3, mucina type5.900.0093.6504.190.002ILMN_1739813HYAL1hyaluronoglucosaminidase 14.030.00815.84014.140ILMN_2314417HYAL1hyaluronoglucosaminidase 12.430.0046.050.0025.650.001ILMN_1778010IL32interleukin 322.870.0096.450.0015.180ILMN_1705814KRT80keratin 803.990.0153.840 .0023.570ILMN_1692223LCN2lipocalin 220.320.0052.500.0023.820.006ILMN_1814270LY6Dlymphocyte antígeno 6 compleja, locus D10.2909.520.00212.990ILMN_1802780M160CD163 molécula similar a 13.290.0015.320.0044.830.001ILMN_1651568MUC13mucin 13, la superficie celular associated4.570.0053.980.0027.130ILMN_1709809NHP2L1NHP2 proteínas no histonas el cromosoma 2-como 1 (S. transferencia cerevisiae) 11.1407.9505.260.001ILMN_1773389PLTPphospholipid protein6.3803.280.0034.610.006ILMN_1713829PTGESprostaglandin E synthase5.9108.5309.180ILMN_1651429SELMselenoprotein M2.530.0013.510.0023.800.001ILMN_1683670SLC10A2solute familia de transportadores 10 (biliar /cotransportador de ácido de sodio), calcio asociada a 25.650.00115.1105.140.006ILMN_1739001TACSTD2tumor miembro transductor de señal 276.1505.310.0125.460.004ILMN_1725387TMEM200Atransmembrane proteína 200A4.540.0047.310.0047.950.003Table 2. Los genes expresados diferencialmente entre las subpoblaciones de células cancerosas (CCSPs) C13 y C12
en
in vitro
células cultivadas y entre tumores generados por vía intramuscular (im) y intrateratoma (es): perfil valores de cero (0) = menos de 0,001 Descargar CSV CSV
microambiente -. genes dependientes del tumor perfil de expresión
Para examinar el perfil de expresión génica CCSP de C12 y C13 - tumores derivados como un reflejo de la interacción entre las células tumorales y el microentorno del tumor (Figura 1B), se aplicó el análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA) [39] para evaluar si los conjuntos de genes distintos fueron estadísticamente significativas. Para este fin se utilizó un total de 3279 conjuntos de genes que se publican en la base de datos de firmas moleculares de sitio web oficial GSEA (http://broadinstitute.org/gsea). GSEA detecta enriquecimiento de conjuntos completos de los grupos relacionados funcionalmente de genes mediante la comparación de los datos de expresión con conjuntos de genes seleccionados a partir de bases de datos de genes disponibles. Los conjuntos de genes con nominal valor de p & lt; 0,05 (p NOM) y FDR valor Q & lt; 0,05 se utilizan para minimizar la identificación de falsos positivos en el análisis GSEA. De los 3279 conjuntos de genes que se probaron en el C12 i.m. frente i.t comparación, 401 conjuntos de genes fueron enriquecidos en C12 i.t, y 43 conjuntos de genes enriquecidos en C12 por vía intramuscular Además, en el C13 i.m frente comparación i.t, 120 conjuntos fueron enriquecidos en clase i.t C13, y 43 conjuntos de genes se correlacionaron con la clase i.m C13 (Tabla 3). Para interpretar esta gran cantidad de datos de manera efectiva, se utilizó la herramienta del software LEA GSEA, la extracción de los miembros de genes fundamentales de los conjuntos de genes enriquecido que más contribuyen a los valores ES correspondientes. Al tomar en consideración únicamente que lleva los genes de borde, generamos 4 listas de genes que representan los subconjuntos más importantes para i.m. C12, C12 i.t, i.m. C13 y C13 i.t. La Figura 3 muestra los 100 genes expresados diferencialmente más clasificados por GSEA para C12 y C13
in vitro
células cultivadas (Figura 3A) y de C12 y i.m. i.t (Figura 3B) y i.m. C13 y i.t. (Figura 3C).
conjuntos de genes enriquecidos
conjunto de genes Nombre Ver.2.5
conjunto de genes Tamaño
Es NES
NOM p
FDR q
C12 i.m. DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.755-2.27700GNF2_IGF125-0.667-2.18200.002GNF2_LYN26-0.630-2.15000.003MODULE_345114-0.495-2.22300.003MODULE_436124-0.449-2.08200.006MODULE_7121-0.633-2.01400.01IFN_BETA_UP65-0.477-1.96700.011MODULE_171128-0.428-1.97900.014PROTEASOME17-0.588-1.7620.0060.045ANDROGEN_AND_ESTROGEN_METABOLISM23-0.552-1.7910.010.038 C12 i.tHSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.7942.65200HSA01430_CELL_COMMUNICATION1350.7082.51600DNA_REPLICATION_REACTOME440.6912.10400.002CANCER_UNDIFFERENTIATED_META_UP680.6412.08300.003HSA04350_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY880.5721.94500.012CELL_ADHESION1710.5181.86700.022HSA04310_WNT_SIGNALING_PATHWAY1470.5151.82700.03CELL_CYCLE770.5651.8520.0010.024HSA05217_BASAL_CELL_CARCINOMA550.6171.9400.0010.013SRC_ONCOGENIC_SIGNATURE580.5621.7530.0060.044 i.m. C13 BECKER_TAMOXIFEN_RESISTANT_UP38-0.487-3.12600DSRNA_UP36-0.436-2.13200CMV_8HRS_UP32-0.451-2.08800MODULE_35528-0.416-2.10900DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.535-2.21300.001HPV31_DN48-0.379-2.16700.002CMV_24HRS_UP72-0.263-1.26100.007NF90_UP24-0.487-1.92600.008RIBAVIRIN_RSV_UP22-0.409-1.79800.016ET743_RESIST_UP17-0.385-1.68900.036C13 eso HSA01032_GLYCAN_STRUCTURES_DEGRADATION300.5931.59000.002MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE1900.4941.52100.006RAS_ONCOGENIC_SIGNATURE2490.4491.39600.029HSA04910_INSULIN_SIGNALING_PATHWAY1350.4541.3860.0010.032HSA04012_ERBB_SIGNALING_PATHWAY870.4851.4330.0020.019HSA04370_VEGF_SIGNALING_PATHWAY700.4821.4150.0040.023HSA04150_MTOR_SIGNALING_PATHWAY480.5201.4770.0050.011HSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.4541.3350.0120.052HSA04330_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY460.4881.3810.020.033HSA00100_BIOSYNTHESIS_OF_STEROIDS240.5421.4180.0310.022Table 3. Representante enriquecido conjuntos de genes para CCSPs C12 y C13 -derivado tumores generados por vía intramuscular (im) y intrateratoma (es).
Valores de cero (0) = menos de 0.001MSigDB Ver.2.5ES = enriquecimiento Resultado NES = Normalizado Enriquecimiento Puntuación FDR = False Discovery Rate Descargar CSV CSV
Los 100 genes expresados diferencialmente más entre las subpoblaciones de células cancerosas (CCSPs) C12 y C13
en
in vitro
células cultivadas (
a
), los tumores derivados de C12-CCSP generan intramuscular (im) y intrateratoma (es) (
B Opiniones) y los tumores derivados de C13 CCSP generada im y (
C
). La expresión diferencial de genes se calculó según la métrica de señal a ruido. Los 50 primeros símbolos representan genes que estaban elevados en los tumores desarrollados i.t. Los siguientes 50 símbolos representan genes que elevaron en los tumores desarrollados i.m. Los genes que están situados más altos en cada una de las dos 50 grupos de genes indica un mayor nivel de diferencia de genes localizados en las posiciones inferiores. Expresión valores se representan como se muestra en la leyenda de color.
Gene Ontología (GO) de enriquecimiento de análisis
Las listas de genes resultantes se sometieron a análisis GO enriquecimiento [40], utilizando el gorila software basado en web. La entrada para este análisis consistió en las listas de los principales genes de borde y una lista de fondo que representa a todos los genes probados en la plataforma de la expresión de genes Illumina. Con un criterio conservador de Bonferroni ajustado valor de p & lt; 0,005, se obtuvieron dos listas de términos GO enriquecido por CCSP, lo que representa su interacción con los dos microambientes diferentes. Es importante destacar que, en el nicho de murina, se encontró que sólo un número limitado de las diferencias entre los dos CCSPs (Figura 4A, C). 10 y 7 GO términos fueron enriquecidos en CCSP C12 y C13, respectivamente. Todas las 7 GO términos que fueron enriquecidos en CCSP C13 i.m. también fueron enriquecidos en i.m. CCSP C12 con los valores de las puntuaciones de enriquecimiento similares (ES). Todos estos términos GO designadas están relacionados con el sistema de respuesta inmune y participan en la "respuesta de las células a un estímulo producido por un organismo vivo". El enriquecimiento de estos van términos demuestra un cambio en el estado o actividad de la CCPSs como resultado de la interacción con el ambiente externo heterólogo como sería de esperar. Por otro lado, en el microambiente hESC derivados se observaron mucho mayores diferencias entre los dos CCSPs (Figura 4B, D). CCSP C12 mostró enriquecimiento de múltiples GO términos relacionados con el ciclo celular, lo que podría reflejar el efecto del microambiente hESC derivados como un nicho más de apoyo en contraste con el microambiente murino. Por otra parte, GO términos relacionados con el proceso de transición epitelial a mesenquimal (EMT) también fueron enriquecidos en los tumores derivados de C12 en el microambiente células madre derivadas. En relación con los tumores C12, C13 CCSP deriva en la exposición microambiente células madre derivadas de sólo unos pocos de bajo valor, ES enriquecido GO términos, la mayoría relacionados con los procesos metabólicos. Las listas de términos GO enriquecido en C12 y C13 - tumores derivados generaron i.m. y i.t se presentan en la Tabla S1.
estadísticamente significativas conjuntos de genes GSEA se sometieron a análisis conduce borde (LEA) y los genes resultantes fueron agrupados en anotaciones ontológicas de categorías de procesos biológicos. Los gráficos circulares presentan las anotaciones enriquecido GO y sus puntajes de enriquecimiento juego (Es) en:
Un
, GO anotaciones upregulated en tumores C12 i.m. generados en comparación con los tumores i.t. C12 generada
B Opiniones, GO anotaciones upregulated en tumores C12 generadas i.t comparación con los tumores C12 i.m. generado (se muestran los 20 GO anotaciones con las puntuaciones más altas de enriquecimiento).
C
, GO anotaciones hasta regulada en tumores C13 i.m. generados en comparación con los tumores i.t. C13 generada
D
, GO anotaciones upregulated en tumores C13 generado que en comparación con los tumores C13 genera im
En su conjunto, este análisis demuestra que las diferentes vías de interacción entre CCSPs C12 y C13 con el microambiente durante el proceso de progresión del tumor. En contraste con el modelo murino convencional, el modelo basado en células madre demuestra una interacción célula-microambiente del cáncer más compleja, que puede proporcionar una reflexión más auténtico de la relación correspondiente entre las células tumorales de un paciente y los complejos tejidos humanos que rodean el tumor.