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PLOS ONE: Optimización de los efectos de la invasión-específicos de derivados de betulina en células de cáncer de próstata a través de plomo Development


Extracto

Los efectos anti-invasivos y anti-proliferativos de betulins y derivados abietano se realizan sistemáticamente análisis utilizando un modelo organotípicos sistema de, cánceres de próstata avanzados resistentes a la castración. Una pantalla preliminar del conjunto inicial de 93 compuestos se realizó en dos dimensiones condiciones de crecimiento (2D) utilizando células epiteliales de próstata no transformadas (EP156T), una línea sensible a andrógenos de la próstata de células de cáncer (LNCaP) y la resistente a la castración, línea celular altamente invasiva PC-3. Los 25 compuestos más prometedores eran todos los derivados de betulina. Estos fueron seleccionados para una pantalla secundaria centrado en condiciones de crecimiento tridimensionales (3D), con el objetivo de identificar los compuestos anti-invasivos más eficaces y específicos. a continuación, las pruebas adicionales de sensibilidad y de citotoxicidad se realizaron utilizando un panel de línea celular prolongado. Los efectos de estos compuestos sobre la progresión del ciclo celular, la mitosis, la proliferación y la citotoxicidad no específica, frente a su capacidad de interferir específicamente con la motilidad celular y la invasión de células tumorales se abordó. Para identificar los posibles mecanismos de acción y los objetivos compuestos probables, se llevó a cabo de perfiles multiplex de los efectos del compuesto sobre un panel de 43 proteínas quinasas humanas. Estos estudios de-convolución de destino, junto con el análisis fenotípico de los organoides multicelulares en modelos 3D, reveló inhibición específica de la señalización Akt relacionado con efectos sobre la organización del citoesqueleto de actina como el piloto más probable de una alteración en la morfología celular y la motilidad.

Visto: Härmä V, Haavikko I, J Virtanen, Ahonen I, Schukov HP, Alakurtti S, et al. (2015) Optimización de los efectos de la invasión-específicos de derivados de betulina en las células cancerosas de la próstata a través del desarrollo de plomo. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10.1371 /journal.pone.0126111

Editor Académico: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, AUSTRALIA

Recibido: 3 Febrero 2015; Aceptado: March 23, 2015; Publicado: 12 de mayo de 2015

Derechos de Autor © 2015 Härmä et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. los autores reconocen la amabilidad de apoyo financiero (Proyecto número 252308; BARC - Betulins, abietans y resinas como nuevos compuestos de plomo para el cáncer) de la Academia de Finlandia ( a KMOC), y el tumor microambiente & amp; Metástasis en el cáncer de próstata resistente a la castración (número de proyecto 267 326) a Mn. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Además de cáncer de piel, cáncer de próstata (AEP) es el cáncer más común en los hombres, especialmente en Europa. PRCA es típicamente dependiente de hormonas y el papel de los andrógenos en la progresión de andrógeno-dependiente de hormona-refractario PRCA está bien establecida [1]. La AEP en etapa temprana puede ser manejado con éxito por la operación solo y tumores recurrentes son tratados por la ablación de andrógenos circulantes por la castración química. Por el contrario, la fase final del resistente a la castración PRCA (CRPC) con diseminación metastásica característica del tumor primario, por lo general hasta el hueso, sigue siendo la principal causa de muerte asociada al cáncer. Aunque se han hecho avances significativos en el tratamiento de los tumores de próstata primarios y sensibles a los andrógenos, en la actualidad no existen tratamientos curativos que apuntan específicamente a la diseminación metastásica del CRPC avanzada y agresiva. En parte, esto está relacionado con la falta de sistemas de modelos experimentales que representan fielmente las características de capacidad de invasión y la motilidad celular
in vitro
o
in vivo
.

Ni estándar de dos modelos bidimensionales (2D) de cultivo celular (líneas celulares) ni modelos animales (xenoinjertos de ratón) presentan fielmente la complejidad de los tumores clínicos. modelos 2D carecen particularmente el microambiente tumoral (TME), la matriz extracelular (ECM), y los tipos de células del estroma. Tales modelos sólo escasamente se corresponden con la sensibilidad al fármaco observado
in vivo
[2]. Estas deficiencias funcionales de descubrimiento de medicamentos preclínicos son reflejadas por las altas tasas de desgaste para fármacos contra el cáncer (& gt; 95%) [3] en los estudios clínicos posteriores. Por lo tanto, biológicamente más relevante
in vitro
modelos de tumores necesitan ser desarrolladas para mejorar la productividad de descubrimiento de fármacos y reducir el número de animales necesarios para el desarrollo de drogas [4]. preparaciones de ECM de diferentes orígenes han demostrado ser especialmente crítico para investigar las interacciones célula-célula y la diferenciación en cultivo 3D [5]. Integrado, robusto y plataformas 3D estandarizados se han convertido compatible tanto de alto rendimiento (HTS) y la configuración de selección de alto contenido (HCS) [2], y la traducción eficiente de métodos de cultivo celular 3D a partir de la investigación básica a las aplicaciones industriales está en curso [6 ]. ECM biológicamente relevante, como los colágenos o extractos de membrana basal laminina-ricos como Matrigel se utiliza ampliamente para estudiar los mecanismos celulares, tales como la motilidad celular y la invasión. El espectro de morfologías multicelulares formados por células epiteliales y cáncer de próstata en cultivos 3D varía entre los acinos glandulares completamente funcional, esferoides tumorales disfuncionales; a las estructuras estrelladas invasivos [7,8] que carecen de propiedades más diferenciadas. Por lo tanto, la diferente morfología manifestado en cultivo 3D lrECM es un indicador sólido que se correlaciona con las diversas etapas de la progresión maligna. Tales modelos celulares 3D biomiméticos proporcionan un medio poderoso para cuantificar los procesos biológicos relacionados con el cáncer. Invasión y metástasis son las características más importantes de cáncer que pueden transformar el cáncer localizado en una enfermedad que amenaza la vida [9]. En la cultura 3D, invasión de células tumorales se manifiesta ya sea por las células individuales o agregados de células que invaden activamente la ECM circundante, utilizando diferentes modos de motilidad (por ejemplo ameboides o invasión colectiva) [10]. PC-3 es una de las pocas líneas celulares PrcA que muestra características de invasión colectiva tanto
in vitro
y
in vivo
[7,11]. Tales procesos multicelulares complejos no pueden ser reproducidas en sistemas independientes de anclaje, no adherentes 3D que carecen de ECM biológicamente funcionales, tales como poli HEMA [12], las culturas "gota colgante" de esferoides aislados agar blando [13] o [14] . Un estudio reciente mostró que los perfiles de expresión génica de las células del cáncer de mama cultivadas en 3D lrECM eran mucho más cerca de
in vivo
que los cultivos de poli-HEMA monocapa o [15]. El alto contenido de pantallas (HCS) que utilizan las plataformas basadas en lrECM se ha informado de próstata [16], de mama [15], de páncreas [17], y los cánceres de ovario [18]. Se requiere que dichos modelos de tejido similar a fondo estandarizados y miniaturizados para capturar sistemáticamente los efectos de moléculas pequeñas compuestos /medicamentos, siRNAs, (por ejemplo anticuerpos y péptidos) biológicos, factores de crecimiento, o toxinas en la biología del tumor. Estos enfoques biomiméticos complejos son útiles como herramientas de pre-clínicos para investigar fieles a corto y respuestas de drogas a largo plazo, la terapia falla, o el desarrollo de resistencia a los medicamentos [19]. Combinado con métodos de alto contenido de imágenes y de análisis de imágenes microscópicas, modelos fenotípicos 3D también pueden ser altamente informativo para el descubrimiento de plomo y estudios de optimización de plomo (LD o LO, respectivamente), en particular si la diana de fármaco molecular es desconocido, y mecanismos complejos, tales como la diferenciación específica de tejido y célula-célula interacciones pueden ser evaluados en base a prejuicios, multiparamétrico lectura. Multiplexación de lectura basada en la formación de imágenes también permite la evaluación simultánea de la citotoxicidad, la apoptosis, y los efectos sobre el ciclo celular, por ejemplo, mediante el uso de sondas fluorescentes apropiados [2,20], lo que reduce la necesidad de estudios de validación excesivas. Además, en tiempo real y los ensayos de células vivas 3D basado en el análisis de alto contenido de la imagen se pueden combinar con los estudios de punto final que abordan la expresión de biomarcadores, como se describe en las publicaciones anteriores [7,11].

Los productos naturales ( NPS) han sido de gran valor como herramientas para descifrar la lógica de la biosíntesis y como materiales para el desarrollo de fármacos de primera línea [21] de partida. De hecho, la mayoría de las nuevas entidades químicas aprobados como medicamentos por la Food and Drug Administration (FDA) han sido consistentemente ya sea PN o compuestos derivados de NP [22]. Los triterpenoides pentacyclic, metabolitos secundarios de las plantas encuentran abundantemente en la cáscara de la fruta, hojas y corteza del tronco, han atraído un gran interés como agentes terapéuticos y suplementos dietéticos [23,24]. Además, los derivados semisintéticos de los triterpenoides naturales se han estudiado activamente en la búsqueda de nuevos agentes contra el cáncer, con especial énfasis en las propiedades anti-invasividad [24-29]. Betulina y ácido betulínico son de tipo Lupane triterpenos pentacyclic abundantes en la corteza de abedul especies del género
Betula
L. [30]. derivados del ácido betulínico y betulina otros tienen antivirales, anti-inflamatorios, anti-malaria, y efectos contra el cáncer [31]. Además, el ácido betulínico fue identificado como un inductor de la apoptosis selectiva en células de melanoma [32], lo que provocó un fuerte interés en triterpenos como agentes anticancerosos. Además, se encontró betulina para bloquear las propiedades invasivas de las células del cerebro y cáncer de pulmón, muy por debajo de su concentración citotóxica, lo que sugiere un efecto quimiopreventivo prometedora contra metástasis [33]. En el presente estudio, hemos utilizado una combinación de modelos de células 2D y 3D PrcA HCS y métodos basados ​​en imágenes y análisis de imágenes automatizado, para evaluar y validar las propiedades antineoplásicos y anti-invasivos de una biblioteca de 93 compuestos. En esta biblioteca, hemos incluido la betulina compuestos parentales, ácido betulínico (2) y sus derivados semi-sintéticos y compuestos de otra clase de terpenoides con efectos biológicos menos estudiados, los abietanes. En general, la biblioteca compuesta por 78 y 15 betulins abietanes.

Resultados y Discusión

síntesis de una biblioteca de betulina y derivados abietano
de partida
Se preparó un conjunto de 76 derivados de betulina a partir de betulina y ácido betulínico (1), mientras que 13 se prepararon a partir de derivados del ácido deshidroabiético y dehydroabietylamide (figuras 1-3, ver archivos también S1), utilizando nuestra experiencia en la química de productos naturales y siguiendo cualquiera de los procedimientos previamente comunicados, o los de otros [ ,,,0],34-37]. se obtuvo ácido betulónico (2) a partir de betulina por oxidación de Jones, y se utiliza como un intermedio versátil para la síntesis químicas. Diferentes sustituyentes se insertaron en las posiciones 3 y 28 del núcleo Lupane. Algunos derivados también se prepararon mediante la fusión de heterociclos de anillo A, en las posiciones 2 y 3. Otros compuestos contenidos un anillo adicional condensado con los anillos C, D y E. Reducción de la cadena lateral del núcleo isoproprenyl triterpeno fue hecho para algunos de los derivados de . reordenamiento de la cadena lateral resultó también en compuestos de tipo germanicane. En los abietanes establecen los compuestos preparados consistía principalmente en derivados de urea y amida.

High Throughput Screening (HTS) para la bioactividad

Estos compuestos fueron compilados como la biblioteca y la actividad biológica se ensayó utilizando cultivos de células 2D en placas de 384 pocillos en cribado de alto rendimiento (HTS) formato (S1 figura). Las líneas celulares utilizadas fueron EP156T (epitelio de próstata no transformado), LNCaP (andrógeno sensibles APCR) y PC3 (resistente a la castración, invasor AEP). Los experimentos se realizaron en tres concentraciones de compuestos diferentes (0,1, 1 y 10 mM), por triplicado, utilizando CellTiterGlo como un punto final de lectura para la proliferación celular. Un panel de 25 derivados de betulina se sintetizó de acuerdo con los compuestos más eficaces y específicos del cáncer identificados en la pantalla 2D preliminar, y seleccionó para estudios posteriores.

High Content Screening (HCS) para la actividad de la invasión de bloqueo

a continuación, estos 25 compuestos más efectivos fueron probados en entornos 3D para propiedades anti-invasivos específicos. Tres estándar de cuidado de compuestos ampliamente utilizados contra APCR se añadieron como controles; a saber, la Enzalutamida antagonista del receptor de andrógenos (MDV3100), la C17α-hidroxilasa /C
17,20-liasa inhibidor de abiraterona (Zytiga), y el clásico paclitaxel inhibidor mitótico. Los tratamientos comenzaron en el día 4, cuando se establecieron los acinos redondas bien diferenciados. Compuesto exposición se continuó durante seis días, cuando la mayoría de las estructuras multicelulares no tratados habían transformado en un fenotipo altamente invasiva.

imagen morfométrico automatizado de análisis (AMIDA) y la evaluación estadística

La célula 3D en vivo culturas fueron teñidas con colorantes reactivos de calceína AM para detectar de estar, y homodímero de etidio para detectar las células muertas. Imágenes (Fig 4A) fueron adquiridos con los datos del microscopio y la imagen confocal se analizaron con el software AMIDA [38]. Los principios de análisis de imágenes morfométricas se describen brevemente en la figura S2.

PC-3 células fueron cultivadas en 3D Matrigel ECM durante 4 días y se trataron durante 6 días con 25 derivados de betulina (desde pantallas 2D de alto rendimiento), DMSO /control del vehículo, y tres compuestos de referencia. A) proyecciones de máxima intensidad representativos de imágenes de la consola microscopio confocal para tratamientos compuestos seleccionados a 300 nM de concentración (5 × objetivo, escala de 100 micras). B) tres gráficos que muestran el impacto relativo de tres parámetros morfométricos de 7 derivados de betulina, control de DMSO, y un compuesto de control (paclitaxel). escalamiento de datos: muestra la diferencia relativa entre la mediana de la proporción de área /Complejidad /Zona, al control de DMSO. tratamientos de paclitaxel y controles de DMSO se han asignado valores de -100 y 0, respectivamente. C) La agrupación jerárquica se realizó utilizando tres parámetros morfológicos derivados de organoides PC3: tamaño de esferoides (área), la complejidad y el número de células muertas. D) de la herida curvas de los dos derivados de betulina 4 y 20 de la curación, destacando el nivel de corte del 50% (línea discontinua de color naranja).

La figura 4A muestra imágenes de microscopia confocal representativos de algunos de los derivados de betulina . El, control antimitótico paclitaxel altamente eficaz de drogas se destacó incluso a concentraciones muy bajas (30 y 100 nM), que muestra un fuerte efecto sobre todas las medidas morfométricas (Fig 4B): esto resultó en menor (reducción de la superficie), organoides menos invasivos (reducción de la complejidad ), con aumento del número de células muertas. La abiraterona compuestos de control y Enzalutamida no tuvieron un efecto notable en células PC-3. Curiosamente, el ácido betulínico (1) y ácido betulónico (2) no mostraron efectos anti-invasivos significativos, mientras que el compuesto 3, que lleva un sustituyente isopropilo a C19, fue uno de los agentes inhibidores de anti-invasivo, de crecimiento más potentes. Del mismo modo, los derivados de isoxazol 4 y 5 muestran una fuerte inhibición del crecimiento y los efectos anti-invasivos en concentraciones más bajas (tan bajo como 100 nM de 4 y 300 nM para 5). Todos estos compuestos eficaces sólo difieren en la posición C19: compuesto 4 tiene una cadena lateral de isopropilo, mientras que el compuesto 5 tiene la isopropenilo original de cadena lateral. Además, cuando el anillo de isoxazol de 5 fue sustituido por un anillo de pirazol, el compuesto resultante 6 era incluso más potente y resultó ser específicamente anti-invasivo. Por el contrario, los derivados de isoxazol con un grupo formilo (7) o un grupo acetoxi (8), una amida primaria (9) o un grupo hidroxi (10) grupo en la posición C28 muestran efectos insignificantes en el fenotipo invasivo. La relevancia del grupo carboxilo en la posición original de C28 (ácido betulónico, 2) para la actividad anti-invasivo o citotóxico se estudió mediante la sustitución de este grupo con varios grupos amida. Ninguno de estos compuestos mostraron efectos anti-invasivos significativas (11, 12, 13, y 14) (no mostrado). También compuesto 15 mostraron fuertes efectos anti-invasivos en 1,0 M sin ningún tipo de inhibición del crecimiento. Sin embargo, cuando su grupo carboxilo en C17 se convierte en un grupo amida primaria, el compuesto resultante 16 tenía el mismo alto nivel de efectos anti-invasivos como el compuesto 15. En contraste, los derivados con amida terciaria (17) o grupos de nitrilo (18) en C17 eran inactivos (no se muestra). También se ensayaron dos derivados de piridina. No se observó pérdida de actividad anti-invasivo si el nitrógeno de la piridina fue adyacente a la posición C3 del esqueleto original de Lupane (19), o al lado de la posición C2 del esqueleto Lupane (20). Curiosamente, ambos compuestos 19 y 20 fueron potentemente anti-invasivo en forma significativa las concentraciones más bajas, en comparación con el compuesto 15.

A continuación, se llevaron a cabo análisis estadísticos para interpretar los datos de imagen complejos (Fig 4B y 4C). Para simplificar, nos centramos en sólo tres, parámetros morfológicos básicos de la multiparamétrico lectura AMIDA (figura 4B): 1) en la zona (que indica un crecimiento de organoides), 2) la complejidad estructural (como una medida de la intensidad de la invasión), y 3) área relativa de las células muertas dentro de organoides (señal roja como una medida de citotoxicidad o apoptosis). Area (Tamaño de organoides; Figura 4B, panel superior) se midió como el número de píxeles dentro de una estructura segmentada. La transformación logarítmica de los datos Área /tamaño se utilizó, que mostró una distribución de cerca de Gauss (normal) dentro de las imágenes. Complejidad de forma (Fig 4B, panel central) se obtuvo usando el tamaño de la estructura (área) y el perímetro (número de píxeles del borde). El ordinario de la forma más de una organoid, cuanto más cerca está a un círculo perfecto, reduciendo así al mínimo el perímetro en relación con el objeto al tamaño. Se ha observado una estrecha a la dependencia lineal entre log (Área) y log (perímetro), lo que indica una relación natural (funcional) entre estas dos características. El montaje de una línea de regresión a los datos dio lugar a una estimación útil del perímetro promedio de cualquier estructura organoid. Las desviaciones de esta media (residuos) se interpretaron como una medida de la complejidad forma de organoides. Como límite inferior lógica para esta medida (representado por un círculo perfecto), ajustamos el punto de intersección (nivel alto) de la línea de regresión para procesar todos los residuos devueltos como números positivos. Esta rápida medida simplificada, de la complejidad multicelular indicó que el logaritmo de los residuos resulta en una distribución casi simétrica de valores. La agrupación jerárquica, el uso de estas tres medidas básicas de las culturas PC3 se obtuvo un dendrograma simple con dos ramas principales: el primer grupo incluye los compuestos más potentes anti-proliferativa y anti-invasivos (Figura 4C: amarillo). El segundo grupo representa débil (Figura 4C: rojo) y no efectiva (Figura 4C: grises). Compuestos

Validación de propiedades anti-invasivos

Sobre la base de la pantalla principal, se seleccionaron seis derivados de betulina para una validación adicional de los efectos anti-invasivos de métodos adicionales. En un ensayo de cicatrización de heridas estándar realizado en monocapa de cultivo 2D, la eficacia de algunos compuestos era notablemente diferente a la configuración de 3D. Por ejemplo, los compuestos 4 y 20 reduce completamente invasión en 3D ya a 300 nM, respectivamente (Fig 4A), pero mostró sólo una reducción del 50% de cierre de la herida después de 64 horas (Fig 4D) a la misma concentración. Además, el compuesto 5 inhibió de manera efectiva la transformación invasivo de PC-3 esferoides ya a 300 nM en 3D (S3 A la figura), medida como "% redondez" retenido después de 10 días), pero se requiere concentraciones superiores a 1 M en cultivo 2D para efectos comparables (S3 B figura). También los agentes anti-invasivos más potentes 6, 16 y 19 (que trabajan a 100 nM en condiciones 3D) redujo cierre de la herida en 2D sólo 50% a 3 M y 1 M, respectivamente (Fig S3B). Compuesto 21 se incluye aquí como ejemplo de derivados inactivos. El hecho de que muchos compuestos carecían de la misma potencia en el cultivo en monocapa 2D convencional sugiere que los objetivos o rutas implicadas en la motilidad de las células biológicas no son igualmente activos en la migración celular en las superficies de plástico. También es probable que la motilidad celular en un cultivo monocapa 2D es controlado por otros mecanismos que invasión colectiva en un andamio 3D.

pantallas 3D secundarios.

A continuación, los 25 derivados de betulina seleccionados representado en las figuras 1-3 compuestos de control que incluyen de nuevo se prueban a fondo a través de la misma panel de líneas celulares de próstata derivadas ya utilizadas en la pantalla de alto rendimiento preliminar, 2D. Los dendrogramas resultantes se generan por separado para cada línea celular (Fig S4), combinados en un solo dendrograma (figura 5A), o muestran como la reducción de tamaños de organoides (area; figura 5B). En los organoides LNCaP no invasivos, pero sensibles a las hormonas, la mayoría de los efectos del compuesto fueron relativamente leves. Los tratamientos no eficaces comprenden la gran mayoría de la gráfica (Fig S4: gris), mientras que los pocos compuestos eficaces se dividen en dos ramas conectadas (amarillo y rojo). Como era de esperar, la Enzalutamida antagonista de andrógenos abiraterona pero no estaban entre los tratamientos eficaces. racimos de paclitaxel junto con derivados de betulina en altas concentraciones en estos compuestos también son eficaces en las células resistentes a la hormona, invasivos PC-3. El dendrograma para la hormona dependiente, no invasiva LAPC-4 (S4B Fig) de nuevo demuestra la eficacia de todos los controles positivos (abiraterona, Enzalutamida y paclitaxel; dentro de las agrupaciones amarillo y rojo). Los derivados de betulina más activos de nuevo caen dentro de estos mismos grupos (3, 4, 6, 16, 19 y 20) adyacentes a los controles positivos. En contraste con las líneas celulares APCR, la línea no transformada normal como células Ep156T (Fig S4C) también respondió al ácido (2) betulónico, al menos a la mayor concentración. En general, como con las células LNCaP y LAPC4, los efectos sobre el crecimiento Ep156T fueron leves (Fig 5B).

derivados de betulina experimentales y los compuestos de control se probaron a través de un panel de líneas de cáncer de próstata (LNCaP, LAPC-4) y no transformadas, las células epiteliales de la próstata (EP156T) en cultivo 3D. A) El dendrograma se basa en tres principales parámetros morfológicos y combina todos los datos de las pantallas 3D primarias y secundarias. tratamientos eficaces compuestos se indican en ser rojo y amarillo, amarillo los más invasión específica. B) Diagramas de caja que muestra el impacto de los compuestos seleccionados en el tamaño del esferoide (Area). escalamiento de datos:. como se describe en la Figura 4 C) Efectos de todos los derivados de betulina y compuestos de control sobre la muerte celular (número de células muertas) guía empresas
Con el fin de ayudar a la clasificación funcional de los derivados de betulina, se combinaron todos los datos en una única dendrograma, que se muestra en la figura 5A. Además, la representación multiparamétrico de todos los datos experimentales como un único mapa de calor es altamente informativo (S5 Fig) y un medio potente para ilustrar los efectos de los compuestos sobre el crecimiento, la complejidad estructural y la muerte celular a través de múltiples líneas celulares. Dividimos los compuestos y controles en tres grupos: compuestos 1) inhibidora del crecimiento, 2) compuestos anti-invasivos fuertes y débiles, y 3) compuestos inactivos. Los efectos morfológicos en cultivo 3D se resumen en S6 Fig Los efectos anti-invasivos más potentes (en células PC-3) se muestra por los compuestos 3, 4, 6, 15, 19 y 20, a concentraciones de 300 nM o inferior (con la excepción del compuesto 15), sin efectos notables en las otras líneas celulares. La mayoría de estos compuestos, sin embargo, mostraron efectos inhibidores del crecimiento en todas las líneas celulares a concentraciones de 1 M o más altas. En conclusión, muchos derivados de betulina son citotóxicos e inhiben el crecimiento de células a altas concentraciones (& gt; 1 M). Sin embargo, a concentraciones más bajas, estos compuestos pueden actuar como inhibidores potentes y específicos de la invasión celular y la motilidad.

Estimación de anti-invasiva vs actividad citotóxica.

Para descartar que citotóxicos y antimitóticos efectos fueron malinterpretadas como anti-invasivo, hemos probado los compuestos 4, 5, 6, 19 y 20 para la inhibición de la proliferación y la inducción de la muerte celular en un cultivo en monocapa 2D (que se resumen en la figura 6). Una amplia gama de concentraciones de compuesto (1 nM a 30 mM) se utilizaron para, líneas celulares LNCaP y Ep156T PC-3, y se analizaron con el generador de imágenes de alto contenido de PerkinElmer Operetta. En las células PC3, la mayoría de los compuestos no mostraron efectos notables sobre la proliferación a concentraciones menores de 10 micras (Fig 6A). células LNCaP fueron más sensibles, con inhibición del crecimiento /citotoxicidad a partir de 3 micras. Los efectos sobre las células no transformadas, la apoptosis sensible Ep156T fueron más fuertes. Aquí, los efectos citotóxicos fueron típicamente observaron ya en 0,3-1 M. Ninguno de los compuestos específicamente inducida muerte celular en células PC-3 o LNCaP a concentraciones inferiores a 30 mM (figura 6B y 6C, a excepción de compuesto 19). Tenemos más calculados CE
50 valores para la proliferación, la apoptosis y muerte celular para cada compuesto, utilizando el software Harmony PerkinElmer (validación del método se muestra en la figura S7). El único ensayo que produce resultados coherentes con las de los derivados de betulina probados en el modelo de cultivo celular 2D fue el ensayo de proliferación (Tabla 1)
.
A) La proliferación celular /número de células, B) la muerte celular programada (apoptosis ), y C) número de células muertas se evaluó mediante ensayos convencionales, en combinación con la microscopía de alto contenido (Opereta). Las células se trataron con los cinco derivados de betulina más eficaces, incluyendo el control de paclitaxel durante 72 h. La proliferación se midió como el número total de núcleos (= células), la apoptosis como la relación de la caspasa-3 positivo frente a todas las células, y la muerte celular como homodímero de etidio-2 núcleos positivos frente a todas las células.

efectos sobre la progresión del ciclo celular y la mitosis

a continuación se probó si los derivados de betulina tenían efectos específicos sobre la progresión del ciclo celular y la mitosis en concentraciones de 300 nM (no mostrado) y 1 M en cultivo 2D (Fig 6D y S8 figura). No hubo diferencias notables en la progresión del ciclo celular en respuesta a cualquiera de los compuestos ensayados. También se evaluó la proliferación celular y la mitosis mediante la medición de PCNA y los niveles de proteína ciclina B1 (S8B FIG). Como era de esperar, los derivados de betulina no mostraron ningún efecto sobre la expresión de cualquiera de las proteínas a la concentración ensayada. Estos hallazgos apoyan de nuevo que los derivados de betulina sólo son citotóxicos o causan daño en el ADN a altas concentraciones (APCR CE
50 valores que van desde 1-90 M), mientras que promueven efectos anti-invasividad considerables a bajas concentraciones nanomolares.

mecanismo (s) de acción posible de los derivados de betulina.

con el fin de dilucidar posible mecanismo de acción de los derivados de betulina, que utiliza una matriz de fosfo-quinasa que detecta cuantitativamente los niveles de fosforilación de las quinasas en 43 lisados ​​celulares (figura 7). Los lisados ​​fueron extraídos de cultivos de células en 3D de células PC-3, y se expusieron a los compuestos betulina derivado por períodos cortos (4 horas) o largo plazo (6 días). Para estos estudios, se seleccionaron los dos derivados representativos 5 y 20 como los inhibidores citotóxicos más específicos, menos de la invasión celular. El corto plazo (4 h) de exposición se realiza a una concentración relativamente alta de 1 M, mientras que para la exposición a largo plazo (6 d), una concentración de solamente 300 se utilizó nM; tanto muy por debajo de la CE citotóxica valores
50 (10 micras para el compuesto 5 y 67 micras para el compuesto 20). Las matrices quinasa también se cuantificaron por densitometría imagen (figura 7A). los niveles de fosforilación de cuatro quinasas, en tanto las exposiciones a corto y largo plazo, claramente se redujeron: STAT3 (Y727), c-Jun (S63), eNOS (S1177) y el PLC-γ1 (Y783) (arriba a la figura 7A y paneles inferiores) . Ambos compuestos también reducido p53 (S15) la fosforilación en la exposición a corto plazo y p70 S6 quinasa (T389), p53 (S392) y PYK2 (Y402) la fosforilación en la exposición 6-d, y el aumento de la fosforilación AMPKα1 (T174). efectos específicos para el compuesto de sustancia 20 incluyen la fosforilación diferencial de los sitios, pan-JNK, GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) y WNK1 (T60) Hck (Y411). Akt (S473) fosforilación fue inhibida solamente por la exposición de 6 d. El compuesto 20 también aumentó la fosforilación de mTOR (S2448), Fyn (Y420) y Src (Y419). Por el contrario, el compuesto 5 no provocó ningún cambio específico en la actividad quinasa de la exposición a corto plazo, y sólo mostró pocos cambios distintos en el tratamiento a largo plazo. Más notablemente, Akt (T308) de la fosforilación también se abolió casi por completo en respuesta a la exposición con el compuesto 5, mientras que la fosforilación de sitios p53 S46 y S392 se disminuyó constantemente (figura 7A). La reducción de la actividad de AKT por ambos compuestos se validó mediante inmunotransferencia de tipo Western, utilizando un, p-AKT anticuerpo específico independiente (Fig 7B). Los tratamientos cortos causaron solamente cambios modestos con una reducción máxima de la fosforilación de proteínas por 2 veces (20: GSK-3α /β S21 /S9 y STAT3 Y705). los niveles de fosforilación de sólo tres quinasas se alteraron más de 2 veces en las exposiciones a largo plazo, a saber, AKT (T308), p53 (S46) y eNOS (S1177), causadas por concentraciones nanomolares de compuesto 5. Compuesto 20 tenían mucho menos dramática efectos sobre la fosforilación de la quinasa en comparación con el compuesto 5, a pesar de sus efectos anti-invasivos en general más pronunciados. En resumen, la actividad de p53 observó reducción AKT y así como las alteraciones de los niveles de fosforilación de varias proteínas, incluyendo la eNOS, pan-JNK, y GSK-3α /β, sugieren desaceleró el metabolismo celular o disminución de la viabilidad celular.

PC -3 esferoides fueron expuestos a dos derivados de betulina representativos, 5 y 20, para 4 h (a 1 mM) y 6 días (a 0,3 M). A) la cuantificación de la intensidad de la señal de cómputo de las matrices quinasa, alineados por cambios veces observados (de izquierda a derecha). B) Western blot del total y fosfo-Akt (S473) que se muestran tanto para la exposición a corto y largo plazo a 20 y 5.

Además, se estudiaron las morfologías multicelulares 3D de PC-3, LNCaP y esferoides Ep156T expuestos a los derivados de betulina 5 seleccionados tanto por períodos cortos y largos de 4 horas y 6 días. De un análisis detallado del citoesqueleto de actina F (tinción faloidina), se hizo evidente que los compuestos 5, 6, 15 y 20 interrumpidos eficazmente la organización de citoesqueleto de actina después de 48 horas de exposición (figura 8A). Curiosamente, la actina casi idéntico fenotipo "sacacorchos" fue visto en los acinos Ep156T normal y PC-3 esferoides (Fig 8A: El panel de ampliación a la derecha), mientras que la organización de la actina cortical típica en esferoides LNCaP se mantuvo intacta. Esto sugiere que estos derivados de betulina pueden orientar vías pertinentes en la morfogénesis acinar y procesos dinámicos implicados en la motilidad celular (también células EP156T forman dinámica "de ramificación" estructuras que penetran en la ECM). Para las comparaciones fenotípicas, hemos probado un grupo de compuestos de referencia de orientación Akt, Rac, ROCK, Src, y otras vías, en términos generales vinculados con el citoesqueleto de actina. Ninguno de los compuestos ensayados de control afectado el citoesqueleto de una manera comparable, con la excepción de la, estaurosporina inhibidor no específico pan-quinasa. Sin embargo, estos efectos no fueron uniformes a través del panel de líneas celulares (Figura 8B, la ampliación de la derecha).

citoesqueleto de actina (filamentosos o F-actina) se tiñe de verde (faloidina), los núcleos con un tinte rojo (

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