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PLOS ONE: PD-1 bloqueo y OX40 La activación sinérgica Protege contra el crecimiento tumoral en un modelo murino de cáncer de ovario Cancer


Extracto

El receptor co-inhibidor muerte programada-1 (PD-1) restringe la respuesta inmune y prevenir la autoinmunidad, sin embargo, los tumores explotan esta vía para escapar de la destrucción inmune. El receptor co-estimuladoras OX40 es upregulated en las células T después de la activación y aumenta su expansión clonal, la supervivencia y la producción de citoquinas cuando se activa. Aunque los anticuerpos anti-OX40 antagonista anti-PD-1 o agonistas pueden promover el rechazo de varios tumores murinos, algunos tumores pobremente inmunogénicos fueron refractarios a este tratamiento. En el presente estudio se evaluaron los efectos y mecanismos de combinatoria PD-1 bloqueo y OX40 desencadenar en un modelo murino de cáncer de ovario ID8 antitumorales. Aunque individuo anti-PD-1 o el tratamiento OX40 mAb fue ineficaz en la protección de tumor contra 10 días establecido tumor ID8, excrecencia tumoral combinada anti-PD-1 /tratamiento OX40 mAb marcadamente inhibida con 60% de los ratones libres de tumor 90 días después de la inoculación del tumor . protección del tumor se asocia con una respuesta inmune sistémica con la memoria y especificidad de antígeno y requiere CD4
+ células y CD8 + células T
. El anticuerpo anti-PD-1 /OX40 tratamiento aumentó mAb CD4
+ células
+ y CD8 y CD4 disminuyó inmunosupresor células
+ FoxP3
+ T reguladoras (Treg) y CD11b
+ Gr- 1
+ células mieloides supresoras (MDSC), que dan lugar a proporciones significativamente mayores de ambos efectores CD4
+ y CD8
+ células Treg a MDSC y en la cavidad peritoneal; Cuantitativos RT-PCR datos demostraron además la inducción de un medio inmunoestimulador local anti-PD-1 tratamiento /OX40 mAb. El bazo CD8
+ células T de ratones tratados mAb combinado produce altos niveles de IFN-γ tras la estimulación de antígeno de tumores y exhibió actividad citolítica específica de antígeno. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio probar los efectos antitumorales de combinación anti-PD-1 /mAb OX40 en un modelo de cáncer de ovario murino, y nuestros resultados proporcionan un fundamento para ensayos clínicos que evalúan la inmunoterapia del cáncer de ovario usando esta combinación de mAb.

Visto: Guo Z, Wang X, Cheng D, Z Xia, Luan M, Zhang S (2014) PD-1 bloqueo y OX40 la activación sinérgica Protege contra el crecimiento tumoral en un modelo murino de cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10.1371 /journal.pone.0089350

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japón

Recibido: 10 de noviembre de 2013; Aceptado: 20 de enero de 2014; Publicado: 27 Febrero 2014

Derechos de Autor © 2014 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Investigador libre del hospital Shengjing (No.200806). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Antecedentes

el carcinoma de ovario (CO) es la neoplasia maligna más letal en las mujeres, con 22.280 nuevos casos y 15.460 muertes estimadas en los Estados Unidos para el año 2012 [1]. La alta tasa de letalidad de OC se debe principalmente a la etapa avanzada de la enfermedad al momento del diagnóstico. primeras etapas de cáncer se pueden curar hasta en el 90% de los pacientes con terapias actuales [2], pero esta tasa cae sustancialmente para la enfermedad avanzada, con aproximadamente el 30% de los pacientes con OC etapa avanzada sobreviven 5 años después del diagnóstico inicial [3]. El tratamiento estándar para el cáncer de ovario es la citorreducción quirúrgica seguida de quimioterapia basada en platino-taxano [4]. Aunque la mayoría de los pacientes responden a la quimioterapia en un primer momento, la mayoría de ellos en algún momento tendrá una recaída y morir de la enfermedad. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas estrategias para mejorar los resultados de cáncer de ovario.

La evidencia acumulada sugiere que la inmunoterapia debe ser eficaz para el tratamiento OC [5]. En primer lugar, las células expresan OC muchos antígenos asociados a tumores contra los que se han detectado respuestas inmunes específicas [6] - [10]. En segundo lugar, los estudios iniciados por Coukos y sus colegas indican la respuesta inmune del tumor es un determinante crítico de los resultados clínicos de los pacientes con OC apoyados por la estrecha correlación entre la supervivencia de estos pacientes y la infiltración tumoral con CD3
+ células T en la gran anotada clínica muestras [11]. En tercer lugar, aunque OC es una enfermedad devastadora, las metástasis son frecuentemente restringidos a la cavidad peritoneal donde el microambiente tumoral es directamente accesible, lo que evita la necesidad de la administración sistémica de los tratamientos inmunoestimulantes [12]. A pesar de la abundante evidencia de apoyo OC inmunoterapia, el éxito clínico con terapias inmunológicas para OC ha sido generalmente modesta [13].

muerte programada 1 proteína (PD-1) es un receptor coinhibitory clave en las células T con una estructura similar a la de CTLA-4, pero con una función y ligando biológico distinta especificidad [14]. funciona principalmente en los tejidos periféricos, donde las células T puede encontrar el inmunosupresora de PD-1 ligandos PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC), que se expresan por las células tumorales, células del estroma, o ambos 1 PD- [15], [16]. El bloqueo de la interacción entre PD-1 y PD-L1 potencia la respuesta inmune de células T in vitro y media la actividad antitumoral preclínica [16] - [18]. PD-L1 es la principal PD-1 ligando que es hasta reguladas en los tumores sólidos, en los que puede inhibir la producción de citoquinas y la actividad citolítica de PD-1
+ tumores infiltrantes de CD4
+ y CD8
+ células T [14], [19]. Estas características hacen de PD-1 /PD-L1 vía un objetivo intervención prometedora para la inmunoterapia tumoral, que será validada por la recientemente informó de los resultados de dos ensayos clínicos que muestran anticuerpos monoclonales específicos para el PD-1 y PD-L1 desencadenan un efecto antitumoral impresionante en la no cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma y cáncer de células renales con regresión completa logrado en algunos pacientes [20] - [22]

OX40 (también conocido como CD137) es una molécula coestimuladora que pertenece a la familia de receptores TNF se expresa principalmente en. células T (eff) efector activado T y las células T reguladoras ingenuas [23]. La ligación de OX40, principalmente en células CD4
+ T, activa ruta de NF-KB y hasta regula moléculas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, dando lugar a células T expansión clonal, la activación, la memoria, y la producción de citoquinas [24] - [26]. OX40 compromiso de CD4
+ FoxP3
+ células Treg conduce a la expansión, desactivación, o muerte celular dependiendo del entorno local [27] - [30]. Teniendo en cuenta que OX40 provocando potencialmente pueden estimular las células T y potencialmente bloquear /eliminar las células T reguladoras, agonistas OX40 se han investigado en varios modelos preclínicos de tumor [31] - [34] y un anticuerpo monoclonal anti-humano OX40 se está evaluando actualmente en ensayos clínicos (números de registro de ensayos clínicos NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 y NCT01642290).

Aunque los anticuerpos OX40 PD-1 o agonistas antagonistas pueden promover el rechazo de algunos tumores murinos, los tumores sin embargo, muy poco inmunogénica como el cáncer de ovario ID8 no responden a la terapia con anticuerpos por sí sola [35]. La hipótesis de que combinado PD-1 bloqueo y activación OX40 promoverían la inmunidad antitumoral. Aquí, utilizando ID8 murino modelo de cáncer de ovario, se muestra que anti-PD-1 tratamiento combinado /OX40 mAb suprimió significativamente los 10 días establecidos crecimiento peritoneal tumor ID8, lo que resulta en 60% de los ratones tratados tumorales libres 90 días después de la inyección del tumor. Un examen más detallado reveló que combina anti-PD-1 /OX40 mAb aumenta prominentemente las células T efectoras y atenúa las células inmunosupresores en los sitios tumorales con la inducción de la respuesta de CTL específica de antígeno sistémica.

Métodos

Ratones

hembra C57BL (6-8 semanas de edad) fueron adquiridos de el Centro Experimental Animal de la Universidad de Medicina china. El uso de animales fue aprobado por el Consejo de la Universidad Médica de China

Cell Cultura y
ID8, un clon del carcinoma de ovario MOSEC de /6 origen C57BL fue una donación del Dr. George Coukos (Revisión Institucional Universidad de Pensilvania, Filadelfia, EE.UU.) [36]. las células de melanoma B16 murino, cáncer de pulmón TC1 y células EL4 linfoma de células T se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Las células tumorales se cultivaron en el medio DMEM completo suplementado con 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina antes de suspensiones celulares se prepararon y se trasplantan a ratones. Las células EL4 y esplenocitos se mantuvieron en un medio completo de RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.

anticuerpos monoclonales ( mAb)

terapéutico anti-OX40 (Clon OX-86; catálogo: BE0031), anti-PD-1 (Clon RMT3-23; Catálogo#BE0115), anti-CD4 (clon GK1.5; Catálogo #: BE0003-1), anti-CD8 (clon 2.43; Catálogo #: BE0061), anti-NK1.1 (Clone PK136; Catálogo #: BE0036) y el control de rata IgG2a mAb (clon 2A3; Catálogo #: BE0089) fueron adquiridos de BioXcell (West Lebanon, NH). Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se adquirieron de Tianjing Sungene (Tianjing, China) y eBioscience (San Diego, CA).

Los experimentos con animales

Ratones (5 o 10 ratones /grupo) se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con 1 x 10
células 6 ID8 en 0,1 ml de PBS. Al día 10, 14 y 18 después de la inoculación del tumor, cada ratón recibió la i.p. inyección de 200 mg de control, anti-PD-1, anti-OX40 o anti-PD-1 /OX40 mAb en 200 l de PBS. Los ratones se pesaron dos veces por semana y se comprueban todos los días para el signo clínico de vientres hinchados indicativa de la formación de ascitis y para las pruebas de toxicidad, tales como dificultad respiratoria, la movilidad, la pérdida de peso, diarrea, postura encorvada, y el fracaso para comer mientras histopatología se llevó a cabo en órganos principales (es decir, el hígado, los riñones, los intestinos, los pulmones y colon). Siguiendo las directrices institucionales, los ratones fueron asesinados cuando desarrollaron ascitis y tuvo un aumento de peso & gt; 30%. se recogieron y se pesaron Las masas tumorales peritoneales, la supervivencia de cada ratón se registró y se calculó la supervivencia global.

Para la evaluación inmune de memoria, agrupadas (2 experimento independiente) ratones supervivientes 12 de largo plazo (90 días después de la primera la inyección del tumor) del grupo de terapia anti-PD-1 /OX40 combinado o ratones ingenuo grupo de edad (que sirvió como control) fueron desafiados ip o por vía subcutánea (s.c.) con 1 × 10
6 células ID8 o 1 × 10
6 singénicos pero antigénicamente diferentes células TC1. Tres diámetros perpendiculares de s.c. tumores se midieron cada segundo día usando un calibre y se calcularon los volúmenes tumorales de acuerdo con la fórmula: 1/2 x (longitud) x (anchura)
2. Los ratones se sacrificaron cuando parecían moribundos o sus tumores alcanzaron 10 mm de diámetro. La supervivencia de cada ratón se registró y se calculó la supervivencia global.
Por vía intraperitoneal
Para el agotamiento de los subgrupos de linfocitos, los ratones fueron inyectados con 500 g de mAb contra CD8, CD4, o NK1.1, 1 día antes y dos días después del reto del tumor, seguido de la inyección de 200 mg cada 5 días durante todo el experimento. La eficacia de la depleción de células se verificó por tinción de leucocitos de sangre periférica para subconjuntos específicos después de la depleción (datos no mostrados).

i.p. Evaluación de las células inmunes peritoneales (PIC)

ratones que habían sido trasplantados con ID8 células fueron sacrificados 7 días después de que habían sido tratados con el control, sola o combinada combinación mAb se describe como en experimentos con animales. Para obtener PIC, 3 ml se inyectó PBS en la cavidad peritoneal de ratones con tumores ID8 inmediatamente después de la eutanasia, su vientre se masajeó y se retiró el fluido, se filtraron a través de un filtro de células de 70 m (BD Biosciences), se lavó y las células inmunes se aislaron mediante el uso de un tampón de aislamiento de linfocitos de ratón (Cedarlane, Burlington, Ontario) siguiendo las instrucciones del fabricante y la mayoría de las células resultantes (& gt; 95%). eran células inmunes CD45-postive como se confirma por análisis de citometría de flujo (Figura S1)

para el flujo de la tinción de citometría, suspensiones de células individuales de PIC se lavaron con tampón de tinción FACS y se incubaron con la unión al receptor Fc de ratón inhibidor (eBioscience) durante 10 minutos antes de la tinción con mAbs (Tianjing Sungene) contra CD45 de ratón (clon 30-F11), CD3 (clon 145-2C11), CD4 (clon GK1.5), CD8 (clon 53-6,7), CD19 (clon eBio1D3), CD11b (clon M1 /​​70) y Gr-1 (clon RB6-8C5), CD44 ( clon 1M7) y CD62L (clon MEL-14) durante 30 minutos. Para la tinción intracelular de FoxP3 (clon FJK-16 s; eBioscience), se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron siguiendo las instrucciones del kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience). La citometría de flujo se realizó usando FACSCalibur (BD Biosciences) y la población de células inmunes fue seleccionado por gating células CD45-positivas. Los datos fueron analizados utilizando el software Flow Jo (Árbol Star, Ashland, Oregón). Todo citometría de flujo experimentos se realizaron al menos 3 veces.

RT-PCR cuantitativa

El ARN celular total fue extraído por medio de RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden, GA) y se transcribió inversamente en cDNA utilizando superíndices III transcriptasa inversa (Invitrogen). Expresión de genes de interés se analizó en PIC en el día 7 después de la tercera inyección de mAb. Los cebadores para todos los genes probados, incluyendo el control interno GAPDH, fueron sintetizados por Invitrogen, Shanghai, China. Primer secuencias fueron los follows:GAPDH:For:5′-GTGGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,Rev:5′-CAGTGGATGCAGGGATGATGTTCTG-3′;T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5'-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 '; FoxP3: Para: 5'-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 ', Rev: 5'-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3'; IFN-γ: Para: 5'-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 ', Rev: 5'-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3'; IL-10: Para: 5'-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 ', Rev: 5'-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3'. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó a través de ABI PRISM 7500 Real-Time PCR Systerm (Applied Biosystems) con 1 × SYBR Green PCR Universal Mastermix (Takara). Los niveles de transcripción se calcularon de acuerdo con el método 2-ΔΔCt, normalizó a la expresión de GAPDH, y se expresaron como factor de cambio en comparación con el control.

Análisis de IFN-γ e IL-10 por el PIC

Los ratones inyectados ip con 1 × 10
se inyectaron células ID8 6 10 día antes tres veces a los 4 días de intervalo, con 200 g de control o anti-PD-1 /OX40 mAb. Siete días después de la última inyección de mAb, agrupado PIC (2 × 10
6 /pocillo) recogidos de ratones tratados se estimularon con 50 ng /ml de PMA y 1 mg /ml ionomicina durante 6 horas antes del análisis de IL 10 e IFN-γ secreción en el sobrenadante de cultivo mediante el ratón IFN-γ /IL-10 Quantikine ELISA Kit de acuerdo con el manual. (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN)

Evaluación de la respuesta inmune específica de antígeno

esplenocitos aislados de los ratones tratados se cultivaron en presencia de 10 g /péptidos de mesotelina derivado restringidas-H-2Db ml (amino ácido 406 a 414) o el control de péptido derivado de HPV-E7 (aminoácidos 49-57 ; todos de GenScript, Nanjing, CA) durante 3 días. IFN-γ en los sobrenadantes se determinó por el IFN-γ de ratón Quantikine Kit ELISA (I + amp; D systems). Los resultados también se analizaron después de la normalización de los porcentajes de esplénica CD8
+ T células.

Para los ensayos de CTL-mesotelina específica, se obtuvieron células efectoras por cocultivo 5 × 10
6 esplenocitos con 5 × 10
5 células ID8 irradiadas con UV durante 4 días. células diana EL4 pulsadas con péptido se generaron mediante la adición de 10 mg /ml de péptido y se incubaron durante 4 horas. la actividad de CTL se midió usando el kit no radiactivo CytoTox96 Ensayo de citotoxicidad (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante. En breve, las células diana se incubaron con diferentes cantidades de células efectoras durante aproximadamente 4 horas, y los sobrenadantes se analizaron después de la liberación de lactato deshidrogenasa. Los resultados se expresan como porcentaje de lisis específica, calculada como (/release liberación espontánea total liberación liberación espontánea Experimental) × 100. En algunos experimentos, las células efectoras se incubaron con anti-CD4 o CD8 (10 mg /ml) durante 2 horas antes de ensayo CTL.

Para la evaluación de anticuerpos específicos mesotelina, se aplicó el método descrito anteriormente [37] . Se obtuvo sangre de los ratones ingenuos (5 ratones) o de ratones tratados con mAb solo cuando se practicó la eutanasia (5 ratones) o 2 tratados con mAb supervivientes a largo plazo (90 días después de la inoculación del tumor; 4 ratones). La presencia de anticuerpos-mesotelina específica se determinó mediante la tinción de las células de cáncer de ovario ID8 de ratón utilizando el suero de los ratones tratados en una dilución 1:200, seguido por tinción con secundaria con ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpo anti-ratón IgG (eBioscience). La tinción con disponible comercialmente IgG de ratón anti-mesotelina (sc-33672; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) más anticuerpo secundario o anticuerpo secundario solo se utilizó como control positivo o negativo. Se calcularon los coeficientes de intensidad media de fluorescencia (MFI) del control positivo o sueros de MFI de control negativo.

Estadísticas

Los resultados se expresaron como media ± SEM. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando se utilizó la prueba t de GraphPad Prism 5. Student para comparar la diferencia estadística entre los dos grupos y unidireccional ANOVA se utilizó para comparar tres o más grupos. Las tasas de supervivencia fueron analizados utilizando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron con la prueba de log-rank con la corrección de Bonferroni. Las diferencias significativas fueron aceptados en p. & lt; 0,05

Resultados

Combinado anti-PD-1 /tratamiento OX40 mAb inducida por un efecto antitumoral sinérgico en ratones portadores de tumores ID8

evaluaron la eficacia antitumoral de anti-PD-1 sola o combinada y anti-OX40 mAb en ratones C57BL /6 ratones ip trasplantado 10 días antes con 1 × 10
6 células ID8. ratones no tratados y ratones tratados con un control mAb desarrollado ascitis alrededor de 30 días después de la inoculación del tumor y tuvo que ser sacrificado como se describe anteriormente [38]. Como se muestra en la figura 1A, ya sea solo mAb tenía pequeños efectos sobre el crecimiento de 10 días establecidos tumor ID8 que conduce a la formación de ascitis en el casi mismo tiempo que los ratones no tratados o de control mAb tratados; sin embargo, anti-PD-1 combinado de tratamiento /OX40 mAb aumentó significativamente la supervivencia global de los ratones con 60% (6 de 10 ratones) de ratones libres de tumores (confirmado por laparotomía) 90 días después de la inyección del tumor (p & lt; 0,001, combinado mAb comparó a mAb solo o control), e incluso los ratones sucumbieron al crecimiento del tumor también había prolongó significativamente el tiempo de supervivencia (MST) significa en comparación con el control o ratones individuales tratados con mAb (Figura 1B; MST 30.90, 34.00, 34.00and 75,75 días para el control, anti- PD-1, anti-OX40 y el grupo anti-PD-1 /OX40; p & lt; 0,001, combinado mAb en comparación con mAb solo o control). El peso de las masas tumorales de ratones tratados con mAb combinada también en gran medida disminuyó en comparación con la de los ratones de control o mAb solo tratado (Figura 1C). Una repetición del experimento dio resultados similares (datos no mostrados). En estos experimentos con animales, no se observó ninguna toxicidad evidente como el peso o pérdida de cabello en ratones que reciben anti-PD-1 /OX40 mAb individual o combinada. Además, también no detectamos cualquier expresión de moléculas de PD-1 y OX40 y sus respectivos ligandos PD-L1 /PD-L2 y OX40L en la superficie de las células de cáncer de ovario ID8 (datos no mostrados), excluyendo la posibilidad de que la inhibición de la el crecimiento del tumor ID8
in vivo
está mediada directamente por anti-PD-1 o anti-OX40 mAb.

a, los ratones (10 ratones por grupo) trasplantado ip con 1 × 10
6 células ID8 10 día antes de que se trataron tres veces con 200 g de control, anti-PD-1, anti-OX40 y anti-PD-1 /OX40 mAb a los 4 días de supervivencia de intervalo y en general de los ratones era grabado. B, El tiempo medio de supervivencia de los ratones se calculó con el crecimiento del tumor. C, Las masas tumorales peritoneales se pesó cuando los ratones fueron sacrificados con cada punto que representa cada ratón. D, sobreviviendo a largo plazo (90 días después de la primera exposición al tumor) ratones (4 ratones por grupo) de 2 grupos de tratamiento fueron puestos a prueba nuevamente con mAb por vía intraperitoneal células ID8 dada o por vía subcutánea o con células TC1 no relacionados singénicos trasplantado s.c., y se registró la supervivencia a continuación, en general de los ratones. E, los ratones (5 ratones por grupo) tratados con anti-PD-1 /mAb OX40 combinado también se inyectaron con un anticuerpo anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, o mAb de control con 500 g de cada uno mAb por ratón 1 día antes y dos días después del reto del tumor seguida de la inyección de 200 mg cada 5 días a partir de entonces durante la duración de los experimentos. Tumor de soporte de los ratones no tratados eran como controles negativos (UNT). La supervivencia global de los ratones se registró. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, excepto para D y E, que era de un experimento. *** P & lt; 0,001, combinado mAb vs control o mAb solo en ratones A-C tratada; *** P & lt; 0,001, s.c. o i.p.ID8 vs s.c.TC1 en C; * P & lt; 0,05, control o NK1.1 vs UNT, CD4 o CD8 en D.

Los ratones que rechazan las células ID8 a tratamiento combinado fueron resistentes a una nueva provocación por vía intraperitoneal subsecuente o por vía subcutánea con la misma línea celular, pero no por vía subcutánea con células de cáncer de pulmón no relacionados TC1 (Figura 1D). Estos resultados indican que el tratamiento combinado induce una respuesta inmune antitumoral específica y de larga duración en los ratones tratados. experimentos de reducción de linfocitos subconjunto demostraron que la protección del tumor por anti-PD-1 /OX40 mAb era dependiente de la CD4
+ y CD8
+ células T como la eliminación de las células CD4
células
+ o CD8 + T pero las células NK no abrogadas por completo el efecto antitumoral conferida por los anticuerpos anti-PD-1 /tratamiento OX40 mAB (Figura 1E).

combinado anti-PD-1 tratamiento /OX40 mAb aumenta significativamente las proporciones de ambos T CD4 y CD8 células Treg y MDSC a

Para explorar los mecanismos que subyacen a la sinergia entre la EP-1 bloqueo y activación OX40, se analizaron los efectos de mAb sola o combinada en las células infiltrantes de tumores peritoneales inmunes (PIC) recogidos de ratones tratados 3 o 7 días después de la última inyección de mAb. En comparación con un control o de un solo mAb, combinado mAb aumentado significativamente los porcentajes de efector CD4
+ FoxP3
- (valor medio para el control, anti-PD-1, anti-OX40 y anti-PD-1 /OX40 grupo: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% en el día 3 y 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22,80% en el día 7; p & lt; 0,05) y CD8 + (valor medio 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% en el día 3 y 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 en el día 7; p & lt; 0,01) las células T y la disminución de la frecuencia de CD11b
+ GR-1
+ células supresoras de origen mieloide (MDSC; valor medio 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% en el día 3 y 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% en el día 7; p & lt; 0,05 y 0,01 para los días 3 y 7, respectivamente) en PIC en día 3 después del tratamiento y los cambios se convirtió en más prominente en día 7 después del tratamiento (Figura 2A-D); sin embargo, no se observó alteración en el porcentaje de CD4
+ FoxP3
+ células T reguladoras (Treg) en ratones tratados con mAb combinados en dos puntos de tiempo evaluados. Estos cambios de contraste en las células efectoras y inmunosupresores dieron lugar a las proporciones significativamente elevados de tanto efector CD4
+ y CD8
+ células T a Treg y MDSC en la cavidad peritoneal de los ratones que recibieron tratamiento con mAb combinada (Figura 2E-H) . En cuanto a tratamiento con mAb individual, el compromiso OX40 significativamente elevado el porcentaje de CD4
+ FoxP3
+ Treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% en el día 3 y el 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% en el día 7; p & lt; 0,05 en el día 7) con un modesto aumento en el porcentaje de CD4 efectoras
+ FoxP3
- y CD8 + células T en el día 7 después del tratamiento; Sin embargo, solo PD-1 bloqueo ligeramente atenuado los niveles de inmunosupresor Treg y MDSC en la cavidad peritoneal. Hemos observado un aumento en el número absoluto de células inmunes en total de 2 ratones tratados con mAb en dos puntos de tiempo analizados (valor medio (× 10
6 /ratón): 3.5, 3.7, 3.8, 5.6 en el día 3 y 3.7, 3.8, 4.0, 6.2 en el día 7, p. & lt; 0,05) y los cambios en el número absoluto de cada subgrupo presentó una tendencia similar a sus porcentajes (datos no mostrados)

los ratones (5 ratones por grupo) inyectados ip con 1 × 10
se inyectaron células ID8 6 10 día antes tres veces a los 4 días de intervalo, con 200 g de control, sola o combinada anti-PD-1 /OX40 mAb. Tres o siete días más tarde, lavados peritoneales de ratones tratados se analizaron por citometría de flujo para la composición de los diversos subconjuntos inmunes. Los porcentajes de CD4
+ FoxP3
-
células linfocitos T, T CD8 +, CD4
+ FoxP3
+ Treg y CD11b
+ GR-1
+ MDSC en CD45
+ células inmunes peritoneales se muestran en a, B, C y D, respectivamente, con cada punto de datos que representan de cada ratón. Las proporciones de CD4
+ y CD8
+ células T a Treg y MDSC se muestran en E, F, G y H, respectivamente, con cada punto que representa los datos de cada ratón. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01

Un análisis más detallado fenotipo demostrado que aumentó significativamente el porcentaje de CD44
+ CD62L
- efectoras /de memoria. (valor medio para el control, anti-PD-1, anti-OX40 y anti-PD-1 /OX40 grupo: 9.4%, 10.3%, 14.0%, 33.4% y 18.6%, 21.6%, 26.2%, 53.0% para Las células CD4 y CD8; p & lt; 0,01 para ambas células) y CD44
+ CD62L
+ de memoria central (35%, 40,9%, 42,8%, 54,2% y 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % para las células CD4 y CD8; p & lt; 0,05 para las células CD4) las células se observó en las células CD4 + y T CD8 + peritoneales de anti-PD-1 /OX40 mAb ratones tratados en comparación con los de control o solo mAb ratones (Figura 3A, B tratados ), cuya PIC contenían niveles más altos de ingenuo CD4
+ y CD8
+ células T (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73% y 32.7%, 33.6%, 27.1%, 6.3% de CD4 y células CD8; p & lt; 0,01, tanto para las células) con CD44
-CD62L
+ fenotipo (Figura 3C). Las gráficas de puntos representativos se muestran en la Figura 3D.

Los ratones (5 ratones por grupo) inyectados por vía intraperitoneal con 1 × 10
se inyectaron células ID8 6 10 día antes tres veces a los 4 días de intervalo, con 200 g de control, sola o combinada anti-PD-1 /OX40 mAb. Siete días más tarde, la expresión de CD44 y CD62L en peritoneal CD4
+ y CD8
células de ratones tratados + T se analizó por citometría de flujo. Las frecuencias de CD44
+ CD62L
- efectoras /de memoria, CD44
+ CD62L
+ de memoria central y CD44
-CD62L
+ células de los animales en peritoneal CD4
+ y Las células CD8
+ T se muestran en a, B y C, respectivamente. Las gráficas de puntos representativos se muestran en D con los paneles superior, medio e inferior presentan isotipo, CD44 y CD62L tinción en las células CD4 cerrada + células T
+ y CD8
, respectivamente. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes, * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0.01

En resumen, estos resultados indican que concomitante PD-1 bloqueo y activación OX40 crea mayores proporciones de células T efectoras a las células inmunosupresoras en la cavidad peritoneal de los ratones tratados, lo que representa el cambio del medio tumor supresor normalmente a un estado más estimulante que es más permisiva para la destrucción del tumor mediada inmune.

combinado anti-PD-1 /mAb OX40 tratamiento fomentó un microambiente inmunoestimulante locales

Para fundamentar aún más el desplazamiento del microambiente del tumor, el próximo examinado la expresión de genes asociados al sistema inmune en el PIC recién aisladas durante los días 3 al 7 después del tratamiento mAb. El uso de RT-PCR cuantitativa, los factores asociados con la activación inmune (T-bet y IFN-γ) y los asociados con la actividad inmunosupresora /regulador (FoxP3 y IL-10) fueron evaluados por sus niveles relativos de expresión. En el día 3 después del tratamiento, en un momento en que se observaron aumento de la frecuencia de las células efectoras T, niveles de transcripción de T-bet y los genes de IFN-γ se han mejorado dramáticamente en el grupo de tratamiento combinado (Figura 4A, B). En contraste, la expresión de genes de citoquina inmunosupresora IL-10 era disminuyó considerablemente mientras gen FoxP3 se mantuvo sin cambios (Figura 4C, D), que era consistente con el cambio de Treg y MDSC en PIC. La alteración en la expresión de T-bet, IFN-γ y IL-10 genes fueron más pronunciado en el día 7 después del tratamiento. Sobre la base de las relaciones de las transcripciones de genes-estimuladoras a regulatorio (relación de ambos T-bet /FoxP3 e IFN-γ /IL-10), llegamos a la conclusión que el tratamiento combinado fomentó un microambiente tumoral inmuno-activación local (Figura 4E, F ). OX40 único desencadenante moderado aumento de la expresión de los cuatro genes, sin embargo, ninguna elevación de ambas IL-10 /relaciones T-bet /FoxP3 e IFN-gamma fue observada.

Los ratones (5 ratones por grupo) por vía intraperitoneal inyecta con 1 × 10
se inyectaron células ID8 6 10 día antes tres veces a los 4 días de intervalo, con 200 g de control, sola o combinada anti-PD-1 /OX40 mAb. Tres o siete días más tarde, la expresión de T-bet asociada a Th1 y genes de IFN-γ y inmunorreguladora FoxP3 y IL-10 genes en PIC de los ratones tratados se analizó por RT-PCR cuantitativa. La expresión de T-bet, IFN-γ, FoxP3 e IL-10 genes se muestran en A, B, C y D, respectivamente. Las proporciones de ambos T-bet /FoxP3 y IFN-γ /IL-10 se muestran en E y F respectivamente. Recién aisladas PIC de ratones tratados se estimularon con 50 ng /ml de PMA y 1 g /ionomicina ml durante 6 horas (como se describe en Materiales y Métodos) y los sobrenadantes se evaluaron para los niveles de IL-10 (G) y IFN-γ (H ). Los datos se expresan como M ± SEM de 5 ratones y representativo de 2 experimentos independientes, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0.001

Para asegurar que las alteraciones en el IFN -γ y IL-10 expresión de ARN correlacionado con alteraciones en el nivel de proteínas, PIC se aislaron en días 3-7 después del tratamiento y se estimularon in vitro antes del análisis de IFN-γ y IL-10 niveles de secreción por ELISA. Notablemente, PIC aislada 3 y 7 días después de iniciar la terapia de mAb combinado producido niveles significativamente más altos de proteína IFN-γ y menores niveles de IL-10 de citoquinas en comparación con el cosechado de control o ratones solo tratado con mAb en estos mismos puntos de tiempo (Figura 4G , H).

combinado anti-PD-1 /tratamiento OX40 mAb provocó una respuesta CTL específica del antígeno

a medida que las células ID8 expresan la mesotelina, un antígeno tumoral bien caracterizado [38], cosechamos esplenocitos de ratones tratados, y el mismo número de esplenocitos se cultivaron en presencia de 10 mg /ml de H-2Db-restringido péptido (aminoácido 406-414)-mesotelina específico o control de HPV-péptido E7 (aminoácidos 49 -57) durante 3 días y se analizó la producción de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo por ELISA. En comparación con los de control o ratones individuales tratados con mAb, los esplenocitos de los ratones tratados con mAb combinadas produjeron niveles significativamente más altos de IFN-γ cuando son estimuladas con el péptido mesotelina (P & lt; 0,01; Figura 5A). No se observó aumento de la secreción de IFN-γ en esplenocitos de todos los grupos de ratones cuando se estimularon con péptido de control HPV, lo que demuestra la inducción de la respuesta inmune-mesotelina específico en ratones que recibieron tratamiento combinado mAb. Se evaluó adicionalmente la actividad citolítica de esplenocitos de control o ratones tratados mAb combinados. Los esplenocitos se volvieron a estimular con células ID8 irradiados con UV durante 4 días antes de los ensayos de CTL se realizaron utilizando células EL4 pulsadas con mesotelina o péptido derivado HPV-E7 como células diana. Como se muestra en la Figura 5B y 5C, los esplenocitos de /OX40 ratones tratados mostraron niveles significativamente más altos de actividad citotóxica contra células EL4 pulsadas con mesotelina pero no con el péptido HPV-E7 1 anti-PD-.

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