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PLOS ONE: PORCN Luz de luna en una vía Wnt-independiente que regula la proliferación de células del cáncer

2016/5/31


Extracto

Porcupine (PORCN) es una transferasa O-acilo unido a la membrana que se requiere para la palmitoilación de proteínas Wnt, y que es esencial en diversas vías de Wnt para Wnt-Wntless (WLS) de unión, la secreción de Wnt, y la actividad de señalización Wnt. Hemos probado si se requería PORCN para la proliferación de las células transformadas. Desmontables de PORCN de múltiples siRNAs resultados independientes en un defecto de crecimiento de células en un subgrupo de líneas celulares de cáncer epitelial. El defecto de crecimiento es dependiente de la transformación en células humanas epiteliales mamarias (HMEC). Además, PORCN inducible desmontables por dos shRNAs independientes reduce marcadamente el crecimiento de las establecidas MDA-MB-231 de cáncer en xenoinjertos ortotópico en ratones inmunodeficientes. Inesperadamente, el defecto de proliferación resultante de la pérdida de PORCN se produce de una manera Wnt-independiente, ya que es rescatado por la re-expresión de catalíticamente inactiva PORCN, y no se observa después de la precipitación mediada por ARNi de la proteína portadora Wnt WLS, ni después del tratamiento con el IWP inhibidor PORCN. En consonancia con un papel en una vía Wnt-independiente, desmontables de PORCN regula un conjunto distinto de genes que no son alterados por otros inhibidores de la señalización de Wnt. por lo tanto la proteína PORCN parece claro de luna en una nueva vía de señalización que es limitante de la velocidad para el crecimiento de células cancerosas y la tumorigénesis independiente de su función enzimática en la biosíntesis y secreción de Wnt

Visto:. Covey TM, Kaur S, T Tan Ong , Proffitt KD, Wu Y, Tan P, et al. (2012) PORCN Luz de luna en una vía Wnt-independiente que regula la proliferación de células cancerosas. PLoS ONE 7 (4): e34532. doi: 10.1371 /journal.pone.0034532

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: 8 de Diciembre, 2011; Aceptado: March 1, 2012; Publicado: 11 Abril 2012

Derechos de Autor © 2012 Covey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Programa de Investigación de la firma Duke-NUS y la Investigación traslacional Premio de Singapur (estrella) Investigador (DMV), financiado por la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación, Singapur, y el Ministerio de Salud, Singapur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Wnt son secretadas glicoproteínas acilados que pueden actuar moléculas de señalización de corto alcance como autocrina o morfógenos y de largo alcance. El Wnts 19 humana diferente a regular múltiples vías de señalización, y su desregulación está implicada en diversos trastornos del desarrollo, biología de células madre, la proliferación y la angiogénesis [1], [2]. Por tanto, existe un gran interés en la manipulación de la vía de Wnt aunque la intervención en diversos puntos de la producción de Wnt y las cascadas de señalización aguas abajo. Una de las estrategias para lograr una amplia interrupción de las vías de señalización Wnt es para prevenir la secreción de Wnt a través de la inhibición de la proteína PORCN.

Porcupine (PORCN) fue descubierto por primera vez como un gen de polaridad de segmento de Drosophila necesaria para la distribución normal de los sin alas (WG ), el homólogo de Drosophila WNT [3]. PORCN es un miembro de la familia unidos a la membrana O-acil transferasa (MBOAT) y se conserva entre las especies [4], [5]. PORCN es residente enzima de la membrana integral de pasos múltiples en el retículo endoplásmico y es necesario para la modificación de lípidos de las proteínas Wnt. La acilación por PORCN parece ser absolutamente esencial para la secreción adecuada y la actividad de todos los vertebrados Wnts [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] y la eliminación genética de PORCN es letal embrionaria [12], [13]. PORCN no tiene función conocida más allá de su papel en la biogénesis de Wnts, y por lo tanto es una atractiva diana terapéutica en enfermedades con aumento de la señalización de Wnt. De hecho, se ha informado de varios inhibidores de molécula pequeña de la función PORCN recientemente, incluyendo inhibidor de Wnt de Producción 1 y 2 (IWP-1 y PIM-2) [14]. Hay dos enfoques generales para la inhibición PORCN, farmacológica y genética. En particular, estos métodos de inhibición PORCN pueden dar resultados diferentes. Esto puede ser debido a las diferentes duraciones y grado de inhibición, sino también porque la ablación genética de una enzima puede desenmascarar inesperadamente múltiples funciones independientes para un solo producto génico

dos sitios en las proteínas Wnt puede acilarse:. La serina correspondiente a S209 de Wnt3a se palmitoleated, mientras que la cisteína que corresponde a Cys77 se palmitoylated [4], [11], [15]. Se requiere acilación Ser209 por la unión a Wntless (WLS) WNT [16], una proteína transmembrana multipaso altamente conservada implicada específicamente en la secreción de Wnt [17], [18], [19]. WLS transporta Wnts a la membrana plasmática, donde son liberados a continuación, en el espacio extracelular de una manera dependiente del pH. En consonancia con el papel de WLS en la secreción de Wnt, las células que carecen de WLS funcionales acumular el GT en el Golgi [17] y ratones que carecen de WLS tienen fenotipos de desarrollo letales consistentes con un papel clave en la señalización Wnt [20]. El papel de Wnt acilación cisteína es menos clara [21]. Cys77 parece estar implicado en la actividad de la proteína secretada de señalización, ya que la mutación de los resultados de sitios de una proteína secretada con actividad de señalización de forma variable reducida [15]. Palmitoylation en este sitio puede ser necesario para la unión a Frizzled u otros receptores.

Mientras PORCN es claramente crítico para la secreción y la función de Wnt, no se sabe si desempeña funciones adicionales distintas de su función enzimática en la vía de Wnt . Por ejemplo, podría PORCN acilar sustratos no Wnt adicionales. Como alternativa, ya que es un PORCN evolutivamente antigua proteína presente en los metazoos más simples [22], puede tener co-evolucionado con enzima independiente, "Luz de luna" funciones. Como PORCN es tanto crítico en el desarrollo y una posible diana terapéutica en la enfermedad humana, es importante para entender completamente el papel de la proteína PORCN en las células. Para diseccionar el papel de PORCN en Wnt-dependiente frente a las vías de Wnt-independientes, se comparó el efecto de la inhibición de la secreción de Wnt por varios medios, entre ellos PORCN caída, caída WLS, y la pequeña molécula de la inhibición de PORCN. Encontramos que las funciones PORCN en al menos dos vías independientes, uno que controla la secreción de Wnt, y un segundo que no requiere la actividad de transferasa palmitoil pero que es limitante de la velocidad para el crecimiento de células epiteliales transformadas y regula la expresión de un conjunto distinto de genes . El papel de PORCN Wnt-independiente en la proliferación rápida tiene importantes implicaciones tanto para el desarrollo embrionario y el cáncer.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todos los experimentos realizados en ratones dirección relevante y necesaria cuestiones científicas. Estos se realizaron con anestesia y analgésicos durante los procedimientos recomendados y llegaron a la conclusión de una manera oportuna para evitar el dolor o la carga innecesaria para los ratones. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el empleo NUS Institucional (IACUC).

Células, plásmidos y reactivos

Todas las líneas celulares de cáncer se obtuvieron de la ATCC. Las células STF y STF3A se obtuvieron a partir de células HEK 293 como se ha descrito anteriormente [23]. HMEC transformado (p53 desmontables hTERT + H-Ras-V12 +) y células inmortalizadas (hTERT) fueron el regalo de Mathijs Voorhoeve, Duke-NUS Graduate Escuela de Medicina, Singapur. Las células madre embrionarias masculinas murino (ES) con un locus PORCN apuntado que coloca a los sitios LoxP aguas arriba del exón 8 y aguas abajo del exón 10 fueron hechas por Ozgene. Se seleccionaron las células madre embrionarias genéticamente dirigido nulos PORCN por el laboratorio de Davor Solter (Instituto de Biología Médica, Singapur). Se hicieron MDA-MB-231 células que expresan pTRIPZ mediante transducción lentiviral (Open Biosystems). Las secuencias utilizadas fueron shRNA P1: 5'-GGA CCT TAT CCT TCC ACA GCT -3 'P2: 5' TAT TTA GCC AAT AAG TGG ACA T-3 ', W1: 5'-CAC AAG AAG CTG TGC ATT GTT - 3 ', W5: 5'-TGG TTG CCT ACA TCA AGC TAA-3'. pMKIT-HA-mPORC-D (regalo de Tatsuhiko Kadowaki) se clonó en el plásmido retroviral MSCV-puro (regalo de Mathijs Voorhoeve). Punto y mutantes siRNA-inmune se hicieron utilizando Stratagene QuikChange Site mutagénesis dirigida. células MDA-MB-231 y MCF7 expresan de forma estable de tipo salvaje y mutante PORCN fueron generados por transducción retroviral y selección en puromicina. La pequeña molécula de inhibidores PORCN IWP-1 y PIM-2 fueron generosamente proporcionado por el Dr. Lawrence Lum. siRNAs fueron de Dharmacon: control /No focalización (# D-001810-01-05), PORCN 7 (# J-009613-07), PORCN 8 (# J-009613-08), WLS 5 (# J-018728 -05), beta-catenina 11 (# J-093415-11).

RT-PCR /qPCR.

ARN total fue extraído de las células utilizando Qiagen RNeasy Kit, 1 g de ARN era a transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de Bio-Rad iScript ADNc y PCR cuantitativa se llevó a cabo con Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix. Modelos

tumorales de ratón.

en caída transitoria, 100.000 MDA-MB-231 las células fueron transfectadas con los ARNsi indicados (control o P7) y luego inyectadas en el 4
TH almohadilla de grasa mamaria de posición de edad ratones NOD-SCID hembra de 6 semanas. Para los modelos tumorales PORCN y WLS, se inyectaron 500.000 MDA-MB-231 células en 50 l de DMEM ortotópica en el 4
º almohadilla de grasa mamaria de la posición 6 semanas de edad ratones hembra Balb /c desnudos. Una semana después de la inyección, las grapas se retiraron y el crecimiento del tumor se cuantificó por medición del calibre. Para inducir PORCN caída, el agua potable se complementó con doxiciclina a 0,5 mg /ml y se actualiza cada dos días. A la finalización del estudio, se recogieron los tumores, se pesaron y se analizó la expresión génica.

Estudios de proliferación.

Las células se cultivaron en placas a 70-80% de confluencia en placas de 6 pocillos y se transfectaron con los siRNAs especificados en 100 nm utilizando Dharmafect 1 siguiendo el protocolo del fabricante. 24 h después de la transfección, se tripsinizaron las células y se volvieron a sembrar en una dilución de 1:40 a 1:80 en placas de 12 pocillos. Para los estudios de proliferación con IWP, las células se sembraron en placas de 12 pocillos a 10% de confluencia. Medios que contienen vehículo (DMSO) o IWP-1/2 se actualizan diariamente. Las placas de 12 pocillos se recogieron durante un período de 7 días, se fijaron con helado de MeOH, y se tiñeron con violeta cristal (0,5% CV de MeOH al 25%). Para cuantificar el número de células, el cristal violeta se solubilizó en desoxicolato de sodio al 1% en agua y se midió la absorbancia a 590 nm. Experimentos paralelos se realizaron y se tripsinizaron las células y se contaron con un contador Coulter Beckman durante un período de 7 días.

Microarray.

células 231 MDA-MB-(70-80% confluentes) eran transfectadas con 50 nM de ARNsi durante 48 horas. ARN se aisló utilizando el kit de purificación RNeasy de Qiagen. CRNA marcado, se preparó y se hibridó con microarrays de Affymetrix U133_Plus_2.0 de acuerdo con los protocolos del fabricante. El conjunto de datos se normalizaron utilizando el algoritmo de RMA. 1482 genes diferentes se detectan antes del 1 de manera algoritmo de ANOVA (Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) & lt; = 0,01). El análisis de agrupamiento jerárquico identifica significativamente diferentes grupos de muestras desde 1482 diferentes genes. El análisis se llevó a cabo utilizando el software Partek.

Resultados

PORCN es necesaria para la secreción de Wnt

Para generar herramientas para la investigación de la función PORCN, hemos identificado y validado dos independientes y no siRNAs se superponen, y SIP7 siP8, que se dirigen a todas las variantes de corte y empalme de PORCN y dieron más de un 90% desmontables de PORCN ARNm (Figura 1) en células HEK-293. Como era de esperar, desmontables de PORCN en presencia de Wnt3a transfectadas dio como resultado una disminución en la expresión de luciferasa de β-catenina /TCF impulsado en células HEK-293 con un reportero de SuperTopFlash integrado (células STF) (Figura 1B). Del mismo modo, desmontables de PORCN en células STF con integración estable de Wnt3a (células STF3A) dio lugar a un defecto de la secreción de Wnt3a en el medio (Figura 1C), consistente con el papel esencial de PORCN en la secreción de Wnt.

A. células STF3A se transfectaron con 100 nM del siRNA se indica y el mensaje PORCN se analizaron 48 horas después por PCR cuantitativa en tiempo real. Histograma representa ARNm PORCN relativa normalizada a la actina mRNA. NT, no transfectadas; SiC, control de siRNA; SIP7 y siP8, PORCN específica siRNAs. B. PORCN desmontables bloques de señalización de Wnt /β-catenina. señalización /β-catenina Wnt relativa se midió en las células transfectadas con STF3A 100 nM de SiC, SIP7, o siP8 siRNA. C. PORCN caída inhibe la secreción de Wnt3a. células STF3A se transfectaron con 100 nM del siRNA se indica. El medio se cambió a 1% de medio FCS 48 horas después de la transfección, y se recogió 16 horas más tarde. La abundancia de Wnt3a se evaluó en 30 l medio acondicionado (medio) y 15 g de lisados ​​de células enteras (WC) por SDS-PAGE y la inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. inmunotransferencia actina demuestra la igualdad de carga de lisados ​​de células enteras. D. número relativo de células de cáncer de mama MDA-MB-231 se reduce después de PORCN caída. Las células fueron transfectadas con los ARNsi indicados y proliferación evaluados como en procedimientos experimentales. Las barras de error indican la desviación estándar. E. PORCN caída se desacelera el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer de mama. El número de células se evaluó 4 días después de la transfección de SIP7 siRNA y se representa como% de la proliferación de las células siRNA transfectadas de control. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0.01 para la diferencia de control. F. PORCN knockdown retarda selectivamente el crecimiento de HMECs transformadas. El efecto de PORCN caída en el crecimiento de HMECs inmortalizadas con células hTERT o HMEC-hTERT transformadas por expresión de H-RasV12 y caída estable de p53 se evaluó 6 días después de la transfección con el control o SIP7 siRNA. La eficacia de transfección en ambos tipos de células fue & gt; 80% según la evaluación de la expresión de GFP. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control de siRNA. G. PORCN altera desmontables expresión de Wnt /β-catenina genes diana. mensaje relativo de PORCN y otros genes diana Wnt /β-catenina en MDA-MB-231 células (parte superior) y células-BR-3 SK (abajo) se evaluó mediante qRT-PCR de 72 horas después de la transfección con 100 nM de la indicada siRNA.

Pérdida de PORCN inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama

para probar si PORCN era importante para la proliferación de células de cáncer de mama se evaluó por primera vez su expresión en un panel de líneas celulares de cáncer de mama. PORCN mRNA estuvo presente en todas las líneas ensayadas, con MDA-MB-231 y las células SUM-159 que muestra el mensaje más abundante (Figura S1 A). Se analizaron, además, estas células para la señalización de Wnt /β-catenina basal, pero no vimos la activación consistentes o estadísticamente significativa de TOPflash sobre el reportero de control FOPFLASH negativa en cualquiera de las líneas celulares sometidas a prueba (datos no mostrados). Aunque algunas de estas líneas celulares se han notificado a tener la activación de Wnt /β-catenina endógena debido a la regulación al alza de los Wnt y el silenciamiento de los inhibidores de Wnt secretadas [24], [25], [26], en nuestras condiciones de cultivo que no había indicios de un bucle autocrino Wnt.

Debido a que la señalización de Wnt puede activar las vías tanto β-catenina dependiente y β-catenina-independiente, hemos probado si PORCN caída afectó a la proliferación y supervivencia de estas líneas celulares de cáncer de mama humano, incluso en ausencia de la señalización de β-catenina endógena detectable. PORCN siRNAs SIP7 y siP8 fueron capaces de producir al menos 75% desmontables de PORCN mRNA en células MDA-MB-231 (Figura 1G). Inesperadamente, esto provocó una marcada disminución en la proliferación celular con el tiempo (Figura 1D). Estos hallazgos se extendieron en cinco líneas celulares de cáncer de mama adicionales; knockdown mediada por ARNi de PORCN causó una disminución estadísticamente significativa en la proliferación (Figura 1E) en cada línea celular probada. knockdown mediada por ARNi de PORCN ha informado para causar apoptosis en células de cáncer de pulmón humano [27], aunque este hallazgo no podría reproducirse de forma independiente [28]. Si bien hemos encontrado una disminución del crecimiento en una serie de líneas celulares de cáncer de mama, PORCN caída no dio lugar a la apoptosis o un cambio en la distribución del ciclo celular en ninguna de las líneas de cáncer de prueba (Figura S1B, y los datos no se muestra). Notablemente, PORCN caída no afecta a la proliferación de todas las células. Por ejemplo, líneas de cáncer de mesodermo derivados tales como las células de fibrosarcoma HT-1080 y fibroblastos BJ transformadas no se vieron afectados mensurable (datos no mostrados). También, PORCN no es esencial para el crecimiento de células madre embrionarias y fibroblastos de embrión de ratón [12], [13]. Es importante destacar que el efecto del crecimiento de PORCN desmontables es la transformación específica en células epiteliales. HMECs transformadas son sensibles a PORCN caída mientras que HMECs inmortalizadas no se ven afectados (Figura 1F). Consistente con el hallazgo de que el efecto de la caída en el crecimiento PORCN no depende de la señalización de Wnt, los HMECs transformadas no muestran ninguna evidencia de la señalización autocrina /β-catenina vía (datos no mostrados).

Las consecuencias de PORCN caída también se estudiaron, mediante el análisis de los genes diana de Wnt endógeno en células SK-BR-3 y MDA-MB-231 células, ya que tenían el mayor defecto de la proliferación después de PORCN caída. Estas líneas se han notificado a tener autocrina de señalización Wnt [24], [29], aunque no pudimos detectar esto en ensayos TOPFLASH en nuestras líneas celulares específicas. PORCN caída en células MDA-MB-231 dio lugar a una disminución modesta pero estadísticamente significativa en la abundancia de las transcripciones que codifican los genes diana de Wnt AXIN2, ciclina D y LEF1 (Figura 1G, panel superior). Una disminución significativa tanto de AXIN2 y mRNA LEF1 se encontró en SK-BR-3 células (Figura 1G, panel inferior). Tomados en conjunto, PORCN desmontables disminuyó la tasa de crecimiento de un número de líneas celulares transformadas, y esta correlacionada con imperfectamente desmontables de gen diana Wnt /β-catenina incluyendo AXIN2, ciclina D y CMYC.

Desmontables de PORCN ralentiza tumor el crecimiento en un modelo de ratón ortotópico

Para resolver si PORCN caída podría retardar el crecimiento de células tumorales en un entorno más complejo en el que las señales adicionales del estroma derivadas también pueden estimular la proliferación, se determinó la tasa de establecimiento de los tumores
in vivo
. MDA-MB-231 células transfectadas con siCONTROL o SIP7 siRNA se inyectaron ortotópicamente en ratones NOD-SCID y se controló toma tumor. MDA-MB-231 células con caída PORCN transitoria muestran un retraso de 2 semanas en el tumor tomar comparación con los controles (Figura S1C). El retraso en la formación de tumores sugiere que la función del gen PORCN es importante tomar tumoral y /o progresión y nos animó a seguir un enfoque caída estable.

Para probar si la pérdida de PORCN afectaría el crecimiento de tumores establecidos, seleccionados 25 miR-30 y construcciones basadas identificados dos microARN independientes que proporcionaron robusta caída PORCN. Estos se clonaron en un vector lentiviral inducible, pTRIPZ, que proporciona la doble expresión de proteína roja fluorescente (RFP) y el shRNAmir en presencia de doxiciclina. células MDA-MB-231 se generaron con pTRIPZ integrado de forma estable ya sea de conducción revueltos shRNAmir (shControl) o uno de los dos shRNAmirs independientes contra todas las variantes de corte y empalme de PORCN (aquí llamados SHP1 y SHP2). En células cultivadas, la adición de doxiciclina condujo a la inducción de la shRNAmir con la reducción de ~ 75% de mensaje PORCN y alta expresión de RFP (Figura 2A). Como era de esperar, esta disminución de PORCN mRNA en las células MDA-MB-231 condujo a una disminución en la señalización de Wnt3A-activado de la reportero STF (Figura 2B). Para probar si se podía inducir PORCN knockdown
in vivo
, se inyectaron células ortotópicamente en ratones BALB /c desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño palpable (~ 0,2 cm), se añadió doxiciclina al agua de bebida. Después de 7 días de doxiciclina, se recogieron los tumores y se analizaron para el mensaje PORCN. Tanto los tumores SHP1 y SHP2 tuvieron una reducción en el mensaje PORCN, lo que indica que la doxiciclina está llegando a las células e inducir PORCN caída
in vivo gratis (Figura 2C).

A. Establecimiento de PORCN caída inducible. MDA-MB-231 células con integración estable de pTRIPZ- SHC (control), -shP1, o -shP2 shRNAmir fueron tratados con 5 ng /ml de doxiciclina (derecha) o vehículo de control (izquierda). PORCN y mRNA de actina fueron evaluados por RT-PCR, y la expresión de RFP se evaluó por microscopía de fluorescencia. B. inducible desmontables de PORCN inhibe la señalización /β-catenina vía. Las líneas de células MDA-MB-231 estables fueron transfectadas transitoriamente con el vector de expresión Wnt3a y SuperTOPflash y luciferasa de Renilla plásmidos informadores, y luego tratados con 5 ng /ml Dox durante 48 horas antes de la evaluación de la señalización /β-catenina Wnt como se describe. Histograma representa SuperTOPflash señalización relativa a la expresión de luciferasa de Renilla. C. inducible desmontables de PORCN ARNm en xenoinjertos ortotópico. Las líneas celulares estables fueron inyectadas de forma ortotópica en el 4
º almohadilla de grasa mamaria de ratones Balb /c desnudos. Después del establecimiento de tumores palpables (15 días), Dox se añadió al agua por un período de 7 días, los tumores se cosecharon y la abundancia de ARNm se evaluó mediante qRT-PCR. Histograma representa ARNm PORCN relativa normalizada a la actina mRNA. D. PORCN caída se ralentiza el crecimiento del cáncer. Los tumores se cosecharon y pesaron 19 días después del inicio del tratamiento doxiciclina. E. crecimiento del cáncer se hace más lenta por inducible desmontables PORCN. El volumen tumoral se midió mediante calibradores en los tiempos indicados.

Para probar si PORCN caída afecta el crecimiento del tumor, se inyectaron las mismas líneas celulares de forma ortotópica en ratones Balb /c desnudos. Los tumores se dejaron llegar a aproximadamente 0,2 cm de diámetro (aproximadamente 2 semanas después de la inyección), y luego caída PORCN se indujo mediante la adición de doxiciclina al agua. Después de la inducción por doxiciclina, hubo una reducción significativa en la tasa de crecimiento de tumores que expresan bien SHP1 o SHP2 (Figura 2E). Esto parecía ser dependiente de la dosis, como SHP1 produce tanto una mayor caída de PORCN y una mayor reducción en el crecimiento del tumor (Figura 2C y E). Una vez que los tumores control alcanzaron ~ 1 cm de diámetro, se sacrificaron los ratones. Los tumores se extirparon, se pesaron y se midieron. Los tumores fueron significativamente más pequeños y ligeros si contenían la inducida SHP1 o SHP2 shRNAmir (Figura 2D). Estos resultados demuestran que desmontables de PORCN mRNA en contratadas resulta ortotópico de cáncer de mama en un retraso significativo en el crecimiento del tumor. Por lo tanto, PORCN juega un papel crítico en la proliferación de células MDA-MB-231 tanto en cultivo, y en xenoinjertos.

Pérdida de PORCN afecta el crecimiento de células de cáncer de una manera
Wnt-independiente
Lo anterior resultados muestran que desmontables de PORCN regula la proliferación de varias líneas celulares de cáncer de mama. El efecto sobre la proliferación no es debido a los efectos fuera de la diana de la RNAi, ya que se obtuvieron resultados idénticos con dos siRNAs independientes y dos shRNAmirs independientes adicionales contra un total de 4 diferentes regiones de PORCN. Es importante destacar que todas las construcciones de RNAi estaban dentro de la secuencia contenida dentro de cada una de las cuatro variantes de corte y empalme PORCN humanos codificación. Debido a que el efecto de PORCN caída no se correlaciona fuertemente con su efecto sobre los genes dependientes de β-catenina como AXIN2, ciclina D y CMYC, se consideró la posibilidad de que PORCN caída podría disminuir el crecimiento celular a través de una β-catenina bucle de Wnt autocrina independiente o , de forma alternativa, que PORCN tiene algunas funciones adicionales, Wnt-independientes. Para diferenciar entre estas posibilidades, se inhibió la secreción de Wnt por dos enfoques independientes adicionales.

La acilación de Wnts por PORCN es requerido para su unión a la proteína de transporte, WLS, que lleva Wnts de la ER o Golgi a la plasma membrana antes de la secreción [16]. Como tal inhibición, farmacológica de acilación y la pérdida de WLS tanto inhibir la secreción de Wnt similar a PORCN knockdown [17], [18]. En la medida en que sabemos hasta la fecha, todos los Wnt mamíferos requieren tanto PORCN y WLS para la secreción. Como era de esperar, siRNA desmontables de WLS y PORCN todo inhibió de manera similar y con eficacia Wnt3a guiado de señalización (Figura 3A). función enzimática PORCN puede inhibirse con el inhibidor de molécula pequeña IWP-1 [14]. Similar a los resultados publicados, encontramos que IWP-1 inhibe la secreción de Wnt en el medio con una CI
50 de ~ 200 nM (Figura 3B). IWP-1 también inhibe eficazmente la señalización de Wnt3A impulsada en MDA-MB-231 células a dosis similares (Figura 3C). El uso de estos enfoques alternativos, se analizó la consecuencia de la disminución de la secreción de Wnt en el crecimiento de las células cancerosas.

A. WLS, β-catenina, y PORCN desmontables toda inhiben la señalización de Wnt /β-catenina en las células STF3A. Los siguientes siRNAs se utilizaron a 100 nM: para PORCN, SIP7; para WLS, siW5; de β-catenina, siβC11. B. IWP-1 inhibe la secreción de Wnt3a. El medio acondicionado a partir de células STF3A se evaluó para Wnt3a como se describe después las células se incubaron durante 16 horas en presencia de la concentración indicada de IWP-1. C. IWP-1 inhibe la señalización Wnt3a impulsada en células MDA-MB-231. MDA-MB-231 células fueron co-transfectadas con Wnt3a y STF, y se trataron durante la noche con vehículo (DMSO) o dosis indicadas de IWP-1. D. El indicado líneas celulares fueron transfectadas con siRNAs ya sea como arriba, o tratados con IWP-1 o vehículo control. Recuento total de células en el día 6 se evaluó como se describe y se compara con las células no tratadas. IWP-1 se utilizó a 2 M y actualiza cada 24 h. E. Western blot de WLS en MDA-MB-231 células que expresan de forma estable SHC, shW1, y shW5 shRNAs. F. WLS caída no hace más lento el crecimiento del tumor. MDA-MB-231 células que expresan de forma estable SHC, shW1, y shW5 shRNAs se inyectaron ortotópicamente en ratones desnudos BALB /C y el crecimiento del tumor monitorizados como se describe. G. WLS niveles de mensajes en los tumores extraídos de (E), evaluados por QRT-PCR y normalizado a la actina.

Sorprendentemente, a diferencia de PORCN desmontables, desmontables de WLS tenía poco o ningún efecto sobre la proliferación de cualquier línea celular de cáncer probado, incluyendo MDA-MB-231, MCF7, DLD-1, SK-BR-3, T47D, y las células HeLa (Figura 3D y los datos no se muestra). Del mismo modo, desmontables β-catenina no afectó el crecimiento celular en células MDA-MB-231 o MCF7. Confirmación de la eficacia de la precipitación, la pérdida de β-catenina disminuyó significativamente la proliferación de células DLD-1, que se han estabilizado β-catenina debido a una mutación en la poliposis adenomatosa coli (APC) de genes (Figura 3D). El pequeño efecto de la caída β-catenina en la proliferación de células MDA-MB-231 en este experimento no se observó en experimentos repetidos. Además, la adición de IWP-1 a dosis que dan & gt; 80% de reducción de la señalización /β-catenina Wnt no tuvo efecto sobre el crecimiento celular o la viabilidad de MDA-MB-231, MCF7, y las células DLD-1, líneas que eran sensible tanto a PORCN siRNA y shRNA (Figura 3D). Nos extendió este resultado a un grupo de otras líneas celulares de cáncer y también se encontraron efectos de IWP-1 o la molécula relacionada IWP-2 sobre el crecimiento celular y la viabilidad (Figura S2). Estos resultados demuestran que el bloqueo de la secreción de Wnt por WLS knockdown o tratamiento IWP no alteró la proliferación de células de cáncer y la supervivencia, lo que implica que estas células no dependen de la señalización de Wnt autocrina. Es importante destacar que estos datos sugieren que la pérdida de PORCN puede, por tanto, afectar el crecimiento de una manera independiente de Wnt.

Pérdida de WLS no afecta tumor o crecimiento tome

Debido a la sorprendente falta de efecto de WLS caída en el cultivo celular, se buscó extender este resultado a un modelo de tumor. Las células MDA-MB-231 fueron transducidas de forma estable con uno de dos WLS shRNA orientación (shW1 y shW5) o un control de shRNA, (SHC). Ambos WLS de orientación shRNA dieron una caída efectiva en el mRNA (& gt; 80%) y a nivel de proteína (Figura 3E). Se inyectaron Estas células ortotópicamente en ratones BALB /c ratones desnudos y se monitorizó la progresión tumoral. Los tumores de las tres líneas crecieron a una tasa muy similar (Figura 3F). Cuando los tumores alcanzaron ~ 1 cm de diámetro, que se retiraron y se evaluaron para la persistencia de WLS caída. Tanto shW1 y shW5 mantuvieron a & gt; 60% desmontables de WLS en los tumores (Figura 3G). Así, mientras que WLS caída es eficaz, persistente, y disminuye la señalización de β-catenina, no tiene ningún efecto sobre el crecimiento celular o de xenoinjerto de tumores MDA-MB-231. Tomados en conjunto con el efecto de PORCN caída en el crecimiento del tumor (Figura 2E), estos datos también apoya la idea de un papel de Wnt-independiente de PORCN en el crecimiento celular del cáncer
in vivo

Tipo Salvaje y mutante PORCN ambos efectos sobre el crecimiento de rescate

PORCN caída redujo la proliferación del cáncer, a diferencia de la inhibición de la actividad enzimática PORCN con la pequeña molécula de IWP-1. Esta paradoja sugiere que la proteína PORCN podría desempeñar un papel estructural requerida en las células. Para confirmar que la pérdida de la proteína PORCN es responsable de los efectos observados de crecimiento, hemos tratado de rescatar a este fenotipo mediante el uso de una versión siRNA-inmune del ratón PORCN-D. El uso de un etiquetado-MSCV-3XHA constructo mPORCN-D [4], se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para dar inmunidad a SIP7 siRNA. Para hacer PORCN catalíticamente inactiva, la mutación de H341, un catalizador de residuos invariantes MBOAT predijo para participar en la actividad catalítica PORCN. Los experimentos en varias líneas celulares PORCN nulos confirmaron que mPORCN (H341A) es completamente catalíticamente inactiva (Figura 4E y datos no presentados). Además, PORCN (H341L) recientemente se ha demostrado que es catalíticamente inactivo en las células PORCN nula ES [13]. En transfecciones transitorias, la proteína mutante PORCN se expresó en niveles similares a los de tipo salvaje PORCN y actúa de una manera negativa dominante, la inhibición de la secreción de manera efectiva, tanto Wnt y la expresión de luciferasa impulsado por el TCF en células STF3A (Figura S3, A-C). El uso de versiones siRNA-inmunológico de estas construcciones, cotransfected células MDA-MB-231 con SIP7 siRNA y mostró que no tuvo efecto sobre la abundancia de la proteína PORCN ectópico (Figura 4A, panel superior), lo que confirma la inmunidad a la SIP7 siRNA. MDA-MB-231 células que expresan mPORCN de tipo salvaje han aumentado la actividad STF Wnt3a guiado (Figura 4B). Notablemente, MDA-MB-231 células que expresan H341A mPORCN han reducido la actividad de señalización β-catenina Wnt3a impulsado, de acuerdo con una función dominante negativo en células MDA-MB-231 también. Tanto de tipo salvaje y H341A PORCN co-localizar con calnexina (Figura 4C), un marcador ER [30], en consonancia con los informes anteriores que muestran la localización PORCN a la sala de emergencia [4].

A. Western blot de MDA-MB-231 células transfectadas con construcciones P7 inmunes de HA-etiquetados WT y H341A PORCN. El constructo PORCN contiene 2 mutaciones silenciosas adicionales que la hacen inmune a P7 siRNA desmontables. EV, vector vacío; WT, de tipo salvaje PORCN-HA; MT, H341A-PORCN-HA. B. Wildtype pero no PORCN mutante estimula la señalización /β-catenina Wnt. Las células MDA-MB-231 fueron co-transfectadas con plásmidos que codifican para WT y H341A-PORCN, Wnt3a, y el reportero SuperTOPflash. H341A-PORCN tiene un efecto dominante negativo significativo en la señalización /β-catenina Wnt. C. Wildtype y PORCN mutante se localizan de manera apropiada. microscopía de inmunofluorescencia indirecta se realizó con anticuerpo anti-HA y el endoplásmico calnexina marcador retículo. D. Wildtype y PORCN H341A dominante negativo son igualmente efectivos para rescatar el defecto de crecimiento causada por PORCN caída. MDA-MB-231 fueron co-transfectadas con siRNA P7 y expresión PORCN construye como se indica. El número de células se midieron tal como se describe.

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