Extracto
La expresión de la proteína fosfatasa 32 (PP32, ANP32A) es baja en los cánceres de páncreas pobremente diferenciados y está vinculada a los niveles de Hur (ELAV1), un marcador predictivo de respuesta gemcitabina. En las células de cáncer de páncreas, la sobreexpresión exógena de PP32 inhibió el crecimiento celular, apoyando su papel-reconocido desde hace tiempo como un supresor de tumores en el cáncer de páncreas. En ensayos de sensibilidad de detección quimioterapéuticos, las células que sobreexpresan PP32 fueron resistentes selectivamente al nucleósido análogos de gemcitabina y citarabina (Ara-C), pero se sensibilizó a 5-fluorouracilo; por el contrario, silenciando PP32 en las células de cáncer de páncreas sensibilidad mejorada gemcitabina. Los niveles citoplasmáticos de PP32 aumentaron después de las células de cáncer se tratan con ciertos factores de estrés, incluyendo gemcitabina. sobreexpresión PP32 reduce la asociación de Hur con el ARNm que codifica la desoxicitidina enzima quinasa gemcitabina metabolizadoras (dCK), causando una reducción significativa en los niveles de proteína dCK. Del mismo modo, la expresión ectópica PP32 causó una reducción en Hur unión de mRNAs que codifican las proteínas promotoras de tumores (por ejemplo, VEGF y Hur), mientras PP32 silenciamiento mejorado drásticamente la unión de estos objetivos de mRNA. Bajo la expresión nuclear PP32 correlaciona con tumores de alto grado y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos, en comparación con los tumores de los pacientes con alta expresión de PP32 nuclear. A pesar de que los niveles de expresión PP32 no mejoraron el poder predictivo del estado de Hur citoplasmática, PP32 niveles nucleares y citoplasmáticos niveles Hur asociados significativamente en muestras de pacientes. Por lo tanto, proporcionar nuevas pruebas de que la función supresora de tumores de PP32 se puede atribuir a su capacidad para interrumpir Hur unión a orientar los ARNm que codifican proteínas esenciales para la supervivencia de células de cáncer y la eficacia del fármaco
Visto:. Williams conocimientos tradicionales, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards GN, Rittenhouse DW, Einstein L, et al. (2010) PP32 (ANP32A) Expresión inhibe el crecimiento celular del cáncer pancreático y gemcitabina induce resistencia mediante la interrupción de Hur La unión a ARNm. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10.1371 /journal.pone.0015455
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2010; Aceptado: September 26, 2010; Publicado: 29 Noviembre 2010
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Financiación:. JRB fue apoyado por un premio de desarrollo de la carrera de PanCAN, la Asociación Americana de Investigación del cáncer; fondos de la Sociedad Americana del Cáncer (GRI-08-060-01), y el Fondo para la cura, Newtown, Pensilvania. MG fue apoyada por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento Programa de Investigación Intramural-, Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma pancreático (PDA) es una neoplasia agresiva con un mal pronóstico, incluso después de la resección quirúrgica [1], [2]. Mientras que el 5-fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (GEM) con o sin radioterapia constituyen el tratamiento estándar en el tratamiento adyuvante, que ofrecen poca mejoría en la supervivencia a largo plazo [3], [4], [5]. Por lo tanto, una mejor comprensión de la adquirida y
de novo
mecanismos de resistencia a quimioterápicos es necesario para nosotros para mejorar las estrategias de tratamiento actuales. Aunque se ha aprendido mucho acerca de los cambios moleculares que intervienen en el proceso de tumorigénesis pancreática, ha habido poco éxito en nuestra comprensión de por qué las células de cáncer de páncreas son resistentes a la quimioterapia [6], [7].
PP32 ( ANP32A) tiene un patrón único de expresión en muchos cánceres humanos [8], [9], [10], [11]. PP32 funciones como una proteína supresora de tumores [12], como se demuestra por su capacidad para inhibir
k-ras
transformación mediada maligna [13], [14]. Anteriormente puso de manifiesto que la expresión de PP32 se correlaciona con el estado de diferenciación de PDA, con los niveles de expresión normales detectaron tumores en bien diferenciados pero redujo a ausentes los niveles de expresión en los tumores pobremente diferenciados [14]. Estos hallazgos son importantes porque las formas pobremente diferenciados de PDA son una práctica frecuente y agresivo, sin embargo, poco se sabe acerca de las características moleculares específicas de esta forma de PDA [15]. En un estudio anterior, la introducción de PP32 en una línea de células pancreáticas pobremente diferenciado provocó la detención del ciclo celular y la inhibe el crecimiento celular [14].
PP32 se ha demostrado que es un compañero de unión de múltiples proteínas importantes [14], [16], [17], [18], [19]. Trabajos anteriores demostraron que PP32 está involucrado en: 1) la estabilización de ciertos ARNm que llevan elementos ricos en AU (Ares) en las regiones no traducidas 5 'y 3' (UTRs) a través de la interacción de PP32 con la proteína de unión al ARN Hur (Elavl1) [18]; 2) la modificación de la acetilación de histonas a través de su papel en el inhibidor de la acetil transferasa complejo (denominado INHAT) [17]; y 3) la modulación del ciclo celular a través de su interacción con la forma fosforilada de Rb [18], [19], [20], [21].
Recientemente, se descubrió también que una pareja de unión de PP32, Hur [18], [22], es fundamental para la eficacia GEM contra las células de cáncer de páncreas [23]. Hemos demostrado que Hur puede asociarse con desoxicitidina quinasa mRNA (dCK) y por lo tanto regular dCK expresión de la proteína [23]. Esta asociación es mayor cuando las células de cáncer de páncreas están expuestos a GEM. Tras la exposición GEM, los niveles de dCK aumentan para metabolizar GEM (un análogo de nucleósido) de un profármaco en sus metabolitos activos. En consecuencia, los pacientes tratados con GEM cuyos tumores resecados expresa niveles elevados Hur citoplasmáticos tenido a & gt; aumento de 7 veces en la supervivencia en comparación con los pacientes con tumores resecados expresando baja citoplasmática Hur [23]. Este trabajo previo proporciona el marco para explorar Hur y proteínas relacionadas (PP32) en el contexto de la eficacia de la quimioterapia [24].
El papel exacto de PP32 como un gen supresor de tumores y en su papel en la Hur post-transcripcional regulación del ARNm diana es en gran parte desconocida. Anteriormente, PP32 co-inmunoprecipitó con Hur en modelos de cultivo celular y se ha demostrado que los motivos de ARN de reconocimiento de PP32 fueron críticos para esta interacción [18]. Además, diferentes investigadores han afirmado que PP32 es estrictamente nuclear o citoplásmica. Brennan
et al.
Descrita por primera vez PP32 como una proteína que puede lanzadera entre el núcleo y el citoplasma junto con Hur [18]. Sobre la base de este trabajo, hemos tratado de explorar los vínculos funcionales entre PP32 y Hur en lo que respecta a la supervivencia de células de cáncer de páncreas (es decir, el crecimiento de las células cancerosas y la eficacia GEM).
Métodos
Establecimiento de PP32 isogénica overexpressing y líneas celulares de control
MiaPaca2 células fueron transfectadas utilizando Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA PP32 de longitud completa se subclonó en el plásmido pc3.1 Zeo (Invitrogen), que posee un gen de resistencia a zeocina ™ para la selección como se describe anteriormente [14], [23].
Para cada muestra, 5 uL VERIFICAR del lisado sobreexpresión de antígeno estándar Origene (1 ug /1 ul) fueron colocados con 5 l de 2x tampón de muestra SDS (OriGene Rockville, Maryland). La sobreexpresión de PP32, Hur, o vector vacío fue conducido por un plásmido pCMV6-Entrada del vector que añade una etiqueta Myc /DDK C-terminal para cada gen (OriGene). Las muestras se prepararon y luego cargados en una NuPage 10% Bis-Tris gel y separados a 200 voltios durante 60 minutos. Las proteínas se transfirieron a una membrana PDVF a 30 voltios durante 90 minutos. La membrana se bloqueó durante 1 hora. Las membranas se probaron con anticuerpos primarios (timidilato sintasa, dCK, PP32, Hur, y alfa-tubulina; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche. Las concentraciones de anticuerpos primarios fueron los siguientes: Hur 1:1000, dCK 1:500, TS y alfa tubulina 1:200. a continuación, los anticuerpos SONDADO se lavaron con solución de TBST y anticuerpo secundario se aplicó con el anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP Santa Cruz de cabra a una concentración de 1:10,000. a continuación, las membranas se lavaron y se desarrollaron usando el sistema de detección quimioluminiscente Western Immobilon HRP Sustrato (Millipore, Billerica, MA).
transfección transitoria del vector de expresión PP32 y siRNA para ensayos (RNP-IP) de unión inmunoprecipitación ribonucleoproteína.
La transfección transitoria se realizó como se ha descrito anteriormente. siRNA desmontables se realizó mediante el uso de un PP32 diseñado interferente pequeño siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) con el uso de oligofectamine (Invitrogen) como se describe anteriormente [9], [23]. En líneas celulares de cáncer de páncreas breves, se sembraron células PL5 y MiaPaca2 a 60% de confluencia y se transfectaron en Oligofectamine y Optimem (Invitrogen) utilizando siRNA PP32 y una secuencia de scramble control negativo (Dharmacon). Las células se recogieron después de 48 horas de inmunotransferencia, ensayos de sensibilidad, y los ensayos de RNP-IP.
El aislamiento de ARN y ADN genómico de detección de plásmidos
Para confirmar la sobreexpresión y la reducción del ARNm PP32 en la celda líneas, se llevó a cabo semi-cuantitativos de RT-PCR. MiaPaca2 PP32-transfectadas (Mia.pp32) y el vector vacío se tripsinizaron las células (Mia.EV) y se recogieron como se describe anteriormente [25] y nuestra genera do novo usando la línea celular de cáncer de páncreas parental previamente generado y adquirido (ATCC, Manassas, VA ). Se aisló ADN genómico de líneas celulares Mia.pp32 y Mia.EV y la integración del plásmido fue confirmada mediante la realización de PCR con un cebador directo específico para la secuencia de T7 del plásmido y un cebador inverso específico para PP32: FWD 5 'TAATACGACTCACTATAGGG-3' , 5'-REV CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 '.
El ARN total se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN RNeasy (Qiagen) y luego se trató con Turbo-ADN
libre gratis (Ambion, Austin, TX) para eliminar las trazas de ADNg [25].
inmunoprecipitación ribonucleoproteína (RNP-IP) y PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR).
Las células se sembraron a 65% de confluencia y se tratan como se indica. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando ya sea anti-Hur o anticuerpos de control anti-IgG como se describe previamente (MBL International, Woburn, MA) [23], [26]. a continuación, RT-PCR se realizó, después de la normalización de masas de muestras de ARN, para generar cDNA. Densidad óptica de cDNA se midió y RT-PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en un ABI 7500 instrumento; 75 ng de molde de cDNA se utilizó por reacción para determinar la abundancia relativa de dCK, VEGF, y Hur mRNAs; Las muestras se normalizaron a los niveles de ARNm de GAPDH.
SDS-PAGE /transferencia Western
células
Mia.pp32 y Mia.EV se trataron con tripsina y se obtuvieron lisados de células enteras usando tampón de lisis RIPA. la cuantificación de proteínas se realizó utilizando un ensayo de Bradford (BioRad, Hercules, CA). concentraciones de la muestra se igualaron mediante RIPA. Las muestras se mezclaron a continuación 1:01 con tampón de Laemmli 2X y se separan usando un gel de poliacrilamida Bis-Tris 10% en 1x MOPS funcionamiento de amortiguación y las proteínas se transfirieron y se transfirieron con los anticuerpos indicados como se describe previamente anteriormente [13].
células de inmunofluorescencia
Mia.pp32 y Mia.EV se sembraron en portaobjetos de cámara y tratados con los fármacos indicados. Después del tratamiento, las células se lavaron en PBS, se incubaron con el anticuerpo indicado y se procesan como se describe anteriormente [23]. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI y cámara de diapositivas fueron montadas para su análisis con un microscopio láser confocal Zeiss LSM-510.
citoplasmáticos Extractos
MiaPaca2 células se sembraron a 60% de confluencia. Seis horas después del tratamiento con gemcitabina 1 M (Eli Lilly) o ningún tratamiento, los extractos citoplasmáticos se prepararon como se describe [23], [26], y el análisis de inmunotransferencia realiza [23] utilizando anticuerpos primarios que reconocían Hur (3A2, 1:1000, Santa Cruz), hnRNP o PP32 (1:500) [13].
Crecimiento ensayo
Utilizando el mismo protocolo de transfección descrito anteriormente, las células parentales MiaPaca2 fueron transfectadas con cantidades iguales de PP32-codificación y pcDNA vector vacío en frascos T-75. El medio se cambió y selección zeocina ™ se realizó como se ha descrito anteriormente. Al final del período de dos semanas, se aspiró el medio y los matraces se tiñeron con una solución de cristal violeta durante 20 minutos, seguido de lavados exhaustivos o células se contaron como se describe en la leyenda de la figura.
Ensayos de sensibilidad de drogas
ensayos de sensibilidad se realizaron utilizando PicoGreen ™ (Invitrogen), un colorante fluorescente que se une selectivamente ADN de doble cadena. La intensidad de la señal fluorescente se correlaciona con el número de células viables. En resumen, las células 2000 se sembraron por pocillo de una placa de 96 pocillos y se trataron 24 horas más tarde [23]. Los agentes quimioterapéuticos se adquirieron de Sigma a menos que se indique lo contrario.
unión de ARN ensayos
Para la inmunoprecipitación ribonucleoprotein (RNP-IP) el análisis, las células MiaPaca2 se sembraron a una confluencia del 65%, tratadas 24 h más tarde con 1 M gemcitabina durante 3 h y IP realizarse ya sea con anticuerpos de control IgG anti-Hur o como se describe [23], [26]. Después de aislamiento de ARN, los niveles de ARNm de dCK se midieron por análisis de PCR usando cebadores TCTCTGAATGGCAAGCTCAA y CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].
inmunohistoquímica y muestras de pacientes
fijados con formalina, los bloques incluidos en parafina se procesaron tal como se describe [ ,,,0],23] utilizando antígenos de recuperación de calor y la detección del complejo avidina-biotina. La inmunotinción se realizó en 37 muestras de PDA resecado de los archivos de patología de la Universidad Thomas Jefferson después de la Junta de la Universidad Thomas Jefferson de Revisión Institucional (IRB). Nos adherimos a todas las consideraciones éticas en el presente documento. Todas las muestras de los pacientes eran utilizados en el marco del Consejo de la Universidad Thomas Jefferson de Revisión Institucional (IRB) aprobó el protocolo. Así, este estudio se realizó con el consentimiento del paciente 100%. No hay nuevas líneas celulares generadas directamente a partir de tejido humano se utilizaron para este estudio. Consentimiento escrito. Título de la aprobación del IRB es "Colección, Banca, y la evaluación de los tejidos, la sangre, el jugo pancreático y la bilis de pacientes con carcinomas de páncreas y relacionados sometidos a resección quirúrgica." De acuerdo con el Departamento de Salud y Servicios Humanos (IRB aprobado). La mayoría de los pacientes recibió GEM solo, o en combinación con Xeloda o radioterapia. Los anticuerpos que reconocen PP32 [14] o Hur [23] se utilizaron anteriormente [23]. localización celular (nuclear frente al citoplasma) y la intensidad de la tinción (fuerte frente al débil) fueron anotados. Basándose en el porcentaje de células teñidas (& gt; 50% frente a 5 a 50%) la expresión se puntuó como difusa o focal, respectivamente. Las curvas de supervivencia se generaron utilizando GraphPad Prism (versión 4.0) y los valores de p calculados utilizando un log-rank test (Mantel-Cox).
Resultados
Caracterización de líneas celulares con sobreexpresión PP32
integración del plásmido en células MiaPaca2 se confirmó mediante amplificación por PCR de ADN genómico (datos no mostrados). La figura 1 representa la confirmación de la sobreexpresión de la proteína PP32 en la línea celular Mia.pp32 en relación con Mia.EV. La igualdad de carga de proteína fue confirmada por tinción de la membrana utilizando Fast Green (Figura 1A). La fuerte presencia nuclear de PP32 en células Mia.pp32 se detectó por inmunofluorescencia (Figura 1B). Se realizó un análisis de inmunotransferencia periódica para validar continuo sobreexpresión de la proteína PP32 en las células Mia.pp32 (Figura 1). El análisis por inmunotransferencia
(A) de los lisados de proteínas a partir de células y controles Mia.pp32. Mia.pp32 células expresan niveles incrementados de PP32 que las células Mia.EV. (B) La inmunofluorescencia con células Mia.pp32 y Mia.EV (
Top of). La inmunofluorescencia se realizó también con el etiquetado de Hur, PP32, y DAPI, con un aumento mayor (
parte inferior). Las células se analizaron entonces mediante microscopía confocal láser. células (C) Mia.pp32 han reducido significativamente el potencial de crecimiento en relación con las células Mia.EV. (
Izquierda
) Las células se sembraron por igual y se recogieron en los días 3 y 5 y contados. Cinco veces menos células Mia.pp32 se contaron a las 5 día en comparación con las células Mia.EV. (
derecha) MiaPaca2 células fueron transfectadas con cantidades iguales de PP32 y vacío vector pcDNA 3.1 (Zeo). Los matraces se trataron de manera similar durante un período de dos semanas y posteriormente se tiñeron con violeta de cristal para cuantificar el número de células viables (véase métodos). Cada frasco es representativa de 3 frascos.
cáncer de páncreas células han reducido significativamente el potencial de crecimiento en comparación con las células control.
Los numerosos intentos para generar células Hs766T y PL5 PP32 sobreexpresan no tuvieron éxito, mientras el vector plásmido vacío colonias generadas de forma rutinaria (datos no publicados, ver Métodos) [14]. Resultados similares fueron descritos en estudios previos [8], [14].
células Mia.pp32 requiere rutinariamente pases menos frecuentes que las células Mia.EV. Los ensayos de crecimiento (Figura 1 C,
izquierda) llevadas a cabo como se ha descrito (ver Métodos) revelaron que el día 5, hubo 5 veces menor número de células que las células Mia.pp32 Mia.EV. Tenga en cuenta el crecimiento típico logartihmic del Mia.EV en comparación con la tasa de crecimiento romo, lineal de Mia.pp32. No se observó muerte celular significativa en ninguna de las líneas de células en el estado sub-confluentes, el apoyo a la conclusión de que reduce el crecimiento celular, en lugar de la apoptosis, representaron la dramática diferencia en los recuentos de células, tal como se describe anteriormente [14].
Estamos transfectadas los plásmidos vectores PP32 y desembocan en la misma cantidad de células MiaPaca2 parentales. Se detectó una reducción dramática en el crecimiento en las células transfectadas con MiaPaca2 PP32 en comparación con las células transfectadas con el vector vacío. Hemos señalado una disminución marcada tinción en el matraz PP32-transfectadas (Figura 1C,
derecho), lo que demuestra la disminución del potencial de crecimiento de estas células en comparación con el control. Juntos, estos experimentos descartaron la posibilidad de que PP32 reduce la proliferación de células debido a la "posición de efecto variegación 'resultante de la integración aleatoria de un gen en una región no deseada en el genoma.
ensayos de sensibilidad de drogas revelaron Mia.pp32 las células que son resistentes a los análogos de nucleósidos
Una vez que se establecieron líneas celulares Mia.pp32 y Mia.EV transfectadas de forma estable, las células fueron tratadas con varios agentes quimioterapéuticos de diferentes clases de fármacos (Tabla 1). Para la mayoría de las drogas tales como etopósido, cisplatino, oxaliplatino (Figura 2A), ciclofosfamida y paclitaxel (Figura 2B, véase la Tabla 1 para las descripciones de clase de drogas) sólo cambios insignificantes en la quimiosensibilidad se observaron entre las células y Mia.pp32 Mia.EV (Tabla 1 y Figura 2A y B). Un sub-línea adicional de células transfectadas PP32 (Mia.pp32-2) se incluyó como un control experimental, y no se encontraron diferencias entre todos PP32 sobreexpresión de líneas celulares y las células de control de vector vacío, lo que excluye un artefacto de clonación (Figura 2 ). Ambas líneas Mia.pp32 y Mia.EV proliferaron a la misma velocidad, como se indica por las diferencias insignificantes observados en células porcentajes surivival entre las líneas de células a dosis bajas extremas y la concentración de cada fármaco ensayado (Figuras 2A-C).
supervivencia de líneas Mia.pp32 y Mia.EV se midió por el ensayo PicoGreen después de 5-7 días de incubación con las dosis de los fármacos indicados. (A) Las drogas que causan ninguna sensibilidad PP32-dependiente; (B), fármacos que muestran diferencias modestas en la sensibilidad; medicamentos (C) para los que confieren una mayor resistencia PP32. Los gráficos representan experimentos individuales (S.E.M.); cada experimento es representativo de & gt; tres experimentos individuales. Mia.pp32 líneas se indican como ▴▪ y las células de control del vector vacío se indican como ♦.
Hubo un modesto incremento en la sensibilidad de las líneas Mia.pp32 al inhibidor de la proteína quinasa C estaurosporina (STS) en comparación con Mia.EV (Figura 2B,
derecha). Mia.pp32 células fueron dos veces más sensible a 5-FU en comparación con las células Mia.EV (Figura 2C,
la izquierda). Sin embargo, el cambio más dramático se observó con fármacos de la misma clase que utilizan dCK para el metabolismo celular: GEM y citarabina (Ara-C) (Tabla 1 y Figura 2C,
centro y la derecha
). Mia.pp32 células muestran una resistencia diez veces al GEM en comparación con Mia.EV, y una resistencia de 2 veces a ARA-C (Tabla 1 y representativos de datos, la figura 2C,
centro
).
siRNA desmontables de expresión endógena PP32 sensibiliza a las células de la gemcitabina
La línea celular de cáncer de páncreas PL5, con la expresión PP32 abundantes, se transfectaron transitoriamente utilizando ya sea PP32 siRNA o una secuencia de control mezclado. Desmontables de expresión PP32 (Figura 3A) células prestados aproximadamente 3 veces más sensible a GEM en comparación con las células control (Figura 3B). knockdown PP32 no afectó la viabilidad celular después de etopósido (un control negativo) de tratamiento (Figura 3C). No se observó ningún cambio en los parámetros de crecimiento celular o fenotipo celular en las células PP32 siRNA.
Análisis
(A) por inmunotransferencia de la abundancia PP32 en lisados de células PL5 48 h después de la transfección. En las células transfectadas como se explica en (A), la sensibilidad a GEM (B) o etopósido (C) se ensayó mediante el ensayo de supervivencia de las células PicoGreen.
sobreexpresión y la reducción de PP32 interrumpe VEGF, Hur y dCK transcrito de ARNm de unión a Hur y reduce la expresión de la proteína dCK
hemos demostrado anteriormente que dCK ARNm se une a Hur y por lo tanto mejora la dCK traducción de la proteína [23]. Manipulamos PP32 niveles de expresión (Figura 4A) en las células cancerosas isogénicas y luego se evaluó cuantitativamente la asociación de conocida Hur ARNm se dirige a dCK [23], el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [27], y Hur [28] ARNm con Hur por ribonucleoproteína inmunoprecipitación de ensayo (RNP-IP) como se describe anteriormente [23]. Después de un tratamiento breve GEM, se detectó la asociación entre Hur y mRNA dCK en células MiaPaca2 (Figura 4B). Sin embargo, se detectó una reducción significativa de la dCK, VEGF, y Hur mRNAs en Hur anticuerpo-inmunoprecipitado-ARN a partir de células que sobreexpresan PP32 (Figura S1 y la Figura 4A y B); mientras que en las células transfectadas siRNA-PP32 a, mejora significativa consistente (& gt; 4 veces) en dCK, VEGF, y Hur mRNAs obligados a Hur (Figura 4A y B). Plegables cambios se determinaron mediante la comparación de Hur-anticuerpo-ARN inmunoprecipitado a partir de células transfectadas para vaciar en vectores células transfectadas, con niveles de expresión endógenos, PP32 normales. Para especificidad, evaluamos y no encontramos ninguna unión de GAPDH y PP32 ARNm (Figura 4B y datos no mostrados). Figura S1 muestra el dramático efecto de la sobreexpresión estable de PP32 (células Mia.pp32) tiene en dCK ARNm unión a Hur.
(A) PP32 niveles de ARNm normalizado a los niveles de ARNm de GAPDH en células transfectadas vacío vector, PP32 siRNA células transfectadas, y el plásmido PP32 células transfectadas. Número indica el cambio veces de la expresión del ARNm de la etiqueta PP32 líneas celulares generadas en comparación con las células control de vector vacío. (B) Hur unión a VEGF y dCK mRNAs se detectó por análisis de RNP-IP en células MiaPaca2 transfectadas con siRNA PP32, PP32 plásmido, o el control de vector vacío (A). los niveles de mRNA en Hur y las muestras de IgG IP se normalizaron primero en los niveles de ARNm de GAPDH en las mismas reacciones IP y, a continuación representan como veces enriquecimiento relativo de VEGF, dCK, y Hur ARNm en Hur IP vs IgG IP. Los datos muestran la media de 3 puntos de datos independientes. Dos experimentos independientes se realizaron con el fin de confirmar los resultados. Los números indican los cambios veces en comparación con el control de IgG. (C) Análisis de transferencia Western de los niveles de expresión PP32 y dCK en lisados de proteínas a partir de células Mia.pp32 y Mia.EV. (D) Tres carriles representan lisados de células HEK293T que, o bien generan izquierda a derecha: sobreexpresan Hur, vector vacío, o PP32 etiquetados con myc /DCK. Western blot incluye anticuerpos que reconocen PP32, Hur, dCK, alfa-tubulina, y timidilato sintasa (TS) proteínas.
Además, se halló que los niveles de proteína dCK se redujeron en las células comparado con Mia.pp32 las células de control (Figura 4C). Por último, se utilizó un modelo de cultivo celular diferente para validar estos hallazgos. Proteína lisados de células HEK293T Humanos (véase métodos) que sobreexpresan Hur, PP32 y un vector de control. Validación de Hur y PP32 sobreexpresión se confirmó mediante inmunotransferencia (Figura 4D). Como era de esperar, se detectó la expresión mejorada de proteínas dCK en los Hur sobreexpresión lisados [23] en comparación con el control y la disminución de la expresión de la proteína en los lisados dCK sobreexpresión PP32 en comparación con el control (Figura 4D). Alfa-tubulina y timidilato sintasa se utilizaron para mostrar la carga igual de proteínas. Estos datos confirman que dCK es aumentada en un ajuste cuando se sobreexpresa Hur y downregulated en un ajuste cuando se sobreexpresa PP32. Tomados en conjunto, estos datos indican que puede afectar tanto a PP32 ARNm dCK unión a Hur y dCK expresión de la proteína (Figura 4).
STS y GEM mayor abundancia citoplasmática PP32
Nos confirmó los informes anteriores [29 ] que STS pueden aumentar los niveles citoplasmáticos de tanto Hur y PP32 en células de cáncer (Figura 5A). Del mismo modo, el tratamiento GEM aumentó PP32 abundancia citoplásmica, pero en un grado menor que Hur (Figura 5A). El aumento en los niveles citoplásmicos PP32 y Hur después del tratamiento GEM se evaluó mediante análisis de transferencia Western (Figura 5B). No se detectó ningún cambio en la expresión PP32 y Hur en lisados de células enteras de células tratadas con GEM (Figura 5B), de acuerdo con nuestros resultados anteriores [23]. El seguimiento de los niveles de hnRNP (C1 /C2) confirmó la pureza de los lisados citoplasmáticos (Figura 5B).
(A) Inmunofluorescencia demuestra un aumento Hur y PP32 expresión citoplasmática en las células tratadas con STS (1 M durante 3 h ) y GEM (1 M durante 3 h), como se indica por las flechas blancas. (B) Análisis de inmunotransferencia de los niveles Hur y PP32 en lisados citoplásmicos y su conjunto de células preparados a partir de células que fueron tratadas como se explica en la (Figura 5).
intensidad PP32 nuclear es un biomarcador de mal pronóstico en PDA, pero no mejora el valor predictivo de Hur para el tratamiento GEM
Hemos detectado separado tanto nucleares fuerte y débil y la expresión citoplasmática de ambos Hur y PP32 en especímenes PDA [14], [23] (Tabla 2 y Figura 6A, Hur,
panel de la izquierda Opiniones y PP32,
panel de la derecha
). Para todos los pacientes tratados con GEM (n = 31) [23], la intensidad nuclear PP32 no se correlacionó significativamente con la respuesta GEM en lo que respecta a la supervivencia global (Figura 6B). PP32 niveles de expresión nuclear en combinación con Hur estado citoplásmica (figuras 6C y D) no se incrementan el valor predictivo de Hur solo como un marcador para una respuesta GEM (p = 0,0009, los datos ahora muestra [23]). Se encontró una asociación modesta entre PP32 y Hur localización subcelular niveles de expresión (Tabla 3). La Tabla 2 describe la asociación entre los niveles bajos y PP32 nucleares tumores más agresivos (de grado superior, p = 0,0002, y positivo para metástasis en los ganglios linfáticos, p = 0,0069, véase la Tabla 2). Esta evidencia apoya nuestros resultados anteriores, en un conjunto de datos clínicos separados, lo que demuestra que la baja expresión de PP32 correlacionada con PDAs pobremente diferenciado [14], [15].
(A) La abundancia y localización subcelular de Hur (
izquierda) y baja en ausencia de expresión PP32 nuclear (
derecha) en muestras de pacientes con cáncer de páncreas se evaluaron por inmunohistoquímica; magnificación de 200X. Las muestras son representativas de la cohorte analizada en B-D. (B) Correlación entre la expresión nuclear PP32 y respuesta al tratamiento GEM (p = 0,3, test de rangos logarítmicos). (C) La correlación entre las altas muestras de tumores que expresan PP32 nucleares estratificada en estado alto o bajo Hur en lo que respecta a la respuesta GEM (p = 0,88, prueba de log rank). (D) La correlación entre las altas muestras de tumores que expresan Hur-citoplasmáticos estratificada en la expresión nuclear PP32 alta y baja correlación con la respuesta GEM (p = 0,25, prueba de log rank).
Discusión
Numerosos investigadores han caracterizado de forma independiente PP32 como una proteína supresora de tumores en una variedad de modelos experimentales [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Los primeros estudios mostraron que PP32, a través de un dominio específico compuesto de ~ 25 aminoácidos, actuaron como un supresor de tumores mediante la inhibición de K-ras, un mutante p53, c-jun, E1A, E6, E7 y [12], [13]. Se encontró una fuerte correlación entre ambos tumores de alto grado y metástasis en los ganglios linfáticos con expresión nuclear débil PP32 (Tabla 2), apoyando a nuestros hallazgos previos de que PP32 funciona como una proteína supresora de tumores en PDA [14]. Nuestros resultados sugieren que los niveles de expresión PP32 perturban directa o facilitan la capacidad de Hur para apoyar la viabilidad y la proliferación de células cancerosas mediante la interrupción de la estabilización de los transcritos de ARNm que codifican las proteínas necesarias para la supervivencia de las células tumorales, tales como dCK, VEGF, o Hur (Figura 7). Postulamos que la presencia de PP32 puede interrumpir el papel de Hur en el apoyo a la tumorigénesis y la supervivencia de células de cáncer, mientras que la ausencia de PP32 facilita la tumorigénesis. Nuestros soportes de trabajo y se expande más de una década de investigación que ha demostrado que PP32 actúa como un gen supresor de tumores en varios modelos y sistemas tumorales [8], [9], [11], [12], [13], [30] , [31], [32] (Figura 7).
En la parte izquierda muestra un escenario en el que se reduce PP32 o ausente (tumorigénesis) y Hur se encuentra disponible para asociar y estabilizar los ARNm que apoyan la supervivencia de las células cancerosas y viabilidad. En el lado derecho es un escenario en el que está presente PP32 (supresión tumoral) y Hur no puede unirse al ARNm importantes para la supervivencia de las células cancerosas. Nota: GEM es más probable para ser metabolizado a partir de su forma de profármaco a sus metabolitos activos por dCK en el escenario de la izquierda
modulación de la expresión PP32 través de la sobreexpresión o el silenciamiento alterado la sensibilidad de las células cancerosas a. los análogos de nucleósidos GEM y ARA-C (Figuras 2C y 3). Además, los niveles de expresión PP32 mejoradas o reducidas alterados directamente la interacción de Hur con dCK mRNA (figuras 4) y redujo significativamente la expresión de proteínas dCK (Figuras 4C y D). Estos datos indican que PP32 juega un papel en la regulación post-transcripcional de Hur de dCK. Verificamos informes anteriores de que los niveles citoplasmáticos PP32 puede aumentar en presencia de factores de estrés específicos [22], [33]. Quizás diferentes factores de estrés transportan diferentes miembros de la familia de genes PP32 conjuntamente con Hur. Por ejemplo, Fries B
et al.
Demostró que
Abril
y actos no PP32 como un ligando y puede ayudar Hur en su regulación transcripcional de CD83 [33]. Los miembros de la familia de proteínas PP32 (por ejemplo, ABRIL, pp32r1, PP32) probablemente proporcionan nuevos mecanismos de regulación para Hur y sus ARNm diana [31].
Aunque nuestros datos proporcionan una fuerte evidencia de que PP32 modula la función de Hur, nuestra clínica datos muestran que, antes del tratamiento, la expresión de PP32 endógeno y localización subcelular no altera el valor predictivo de Hur de respuesta GEM (Figura 6). Por otra parte, mientras que se encontró una asociación entre PP32 y Hur localización subcelular en las muestras de tumor (Tabla 3), parece que cada proteína no regula completamente la localización subcelular de la otra
in vivo
.