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PLOS ONE: Papel diferencial de colina quinasa humana α y ß Las enzimas en el metabolismo de los lípidos: implicaciones en cáncer de debut y el uso

2015/5/7


Extracto

Antecedentes

La ruta de Kennedy genera phosphocoline y fosfoetanolamina través de sus dos ramas. Colina Quinasa (ChoK) es la primera enzima de la rama Kennedy de la síntesis de fosfocolina, el componente principal de la membrana plasmática. familia ChoK de proteínas se compone de ChoKα y ChoKβ isoformas, la primera una con dos variantes diferentes de corte y empalme. Recientemente ChoKα se ha implicado en el proceso carcinogénico, ya que se expresa sobre-en una variedad de cánceres humanos. Sin embargo, no se ha reportado evidencia de un papel de ChoKβ en la carcinogénesis.

Metodología /Principales conclusiones

A continuación se compara el
in vitro
y
in vivo
propiedades de ChoKα1 y ChoKβ en el metabolismo de lípidos, y su posible papel en la carcinogénesis. Tanto ChoKα1 y ChoKβ mostraron actividades de colina y etanolamina quinasa cuando se ensaya en extractos de células, aunque con diferente afinidad por sus sustratos. Sin embargo, se comportan de forma diferente cuando se sobreexpresa en células enteras. Mientras que ChoKβ mostrar un papel etanolamina quinasa, ChoKα1 presentar un papel de colina quinasa /etanolamina doble, lo que sugiere la participación de cada isoforma Chok en vías bioquímicas distintas bajo
in vivo
condiciones. Además, mientras que la sobreexpresión de ChoKα1 es oncogénico cuando se sobreexpresa en células HEK293T o MDCK, ChoKβ sobreexpresión no es suficiente para inducir
vitro
transformación celular in ni
vivo
crecimiento tumoral en. Además, se encontró una regulación positiva significativa de los niveles de mRNA en ChoKα1 un panel de líneas celulares de cáncer de mama y de pulmón, pero no se observaron cambios en los niveles de ARNm de ChoKβ. Por último, MN58b, un descrito previamente potente inhibidor de la Chok con
in vivo
actividad antitumoral, muestra más de 20 veces mayor eficiencia hacia ChoKα1 de ChoKβ.

Conclusión /Importancia

Este estudio representa la primera evidencia de la función metabólica distinta de ChoKα y ChoKβ isoformas, lo que sugiere diferentes funciones fisiológicas e implicaciones en la carcinogénesis humana. Estos resultados constituyen un paso adelante en el diseño de una estrategia antitumoral basado en la inhibición Chok

Visto:.-Gallego Ortega D, Ramírez de Molina A, Ramos MA, Valdés-Mora M, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J, et al. (2009) El papel diferencial de Human colina quinasa α y ß Las enzimas en el metabolismo de los lípidos: implicaciones en cáncer de debut y el uso. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10.1371 /journal.pone.0007819

Editor: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Estados Unidos de América

Recibido: 22 Junio, 2009; Aceptado: 7 Octubre de 2009; Publicado: 12 Noviembre 2009

Derechos de Autor © 2009 Gallego-Ortega et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por becas a JCL de la Comunidad de Madrid (GR-SAL-0821 a 2.004), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación Mutua Madrileña, y con una donación de la Fundación a ARM Mutua Madrileña. DGO era un compañero de la Comunidad de Madrid. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

colina quinasa alfa humana (ChoKα) y beta (ChoKβ) son miembros de la familia de la colina quinasa. En los mamíferos esta familia es codificada por dos genes separados,
CHKA
y
CHKB
, resultando en tres diferentes proteínas con una colina /etanolamina quinasa (ChoK /EtnK) de dominio: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) y ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 difiere de ChoKα2 sólo en un tramo adicional de 18 aminoácidos, mientras que ChoKβ difiere de ChoKα1 y ChoKα2 en aproximadamente el 40%. La presencia del dominio ChoK /EtnK confiere la capacidad para catalizar la fosforilación de colina (Cho) para fosfocolina (PCho) [1]. Esto constituye la primera etapa en la ruta de biosíntesis de fosfatidilcolina (PC) [2]. PC es el principal fosfolípido en las membranas eucariotas y juega un papel fundamental en la estructura de la membrana y también en la señalización celular [2]. enzimas ChoK podrían estar implicados también en la síntesis de fosfatidiletanolamina (PE), utilizando como sustrato para hacer etanolamina fosfoetanolamina (PEtn) [1], [3] - [5]

Los estudios anteriores sugieren que actúa como Chok. una proteína dimérica [6], [7] y se ha propuesto la proporción de la población diferente dímero homo- o hetero- para ser específicos de tejido [8]. Además, la combinación entre la colina quinasa isoformas resultados en un nivel diferente de la actividad Chok
in vitro en condiciones
sistemas libres de células. Por lo tanto, el /homodímero α α es la forma más activa colina quinasa, la β /β homodímero los menos activos, y el /heterodímero β α tiene un fenotipo intermedio [8].

La fosfolipasa específica impulsada D- hidrólisis de PC genera colina y de transducción de señal de metabolitos tales como PA (ácido fosfatídico), y sus derivados de LPA (ácido lisofosfatídico) y DAG (diacilglicerol), que son importantes en la mitogénesis y la transformación celular [9] - [11]. La colina se convierte adicionalmente por ChoK en PCho, un metabolito estable capaz de inducir la mitogénesis en los fibroblastos murinos [12]. Además, varios oncogenes tales como
RAS
o
RHOA
actividad ChoKα incremento resultante en los niveles intracelulares más altos de PCho [13] - [16]. espectroscopia de resonancia magnética (MRS) los estudios han revelado el metabolismo de fosfolípidos anormal en las células del cáncer [17], [18]. Además, los altos niveles de PCho se han encontrado en las células tumorales así como en muestras de tumores de pacientes con cáncer en comparación con sus homólogos normales en mama, próstata, cerebro y cáncer de ovario [19] - [25]. El aumento de la fosfoetanolamina ha informado también en células transformadas o muestras tumorales utilizando MRS, aunque contribuye a un grado mucho menor, en comparación con el aumento de PCho, al pico fosfomonoéster [26].

La implicación de ChoKα en el crecimiento celular, la proliferación, la iniciación y progresión del cáncer está bien documentada. ChoKα se sobreexpresa en algunos de los cánceres más comunes, como el de mama, pulmón, colorrectal, de próstata [27] - [30] y de la vejiga (observaciones no publicadas). Además, tiene actividad oncogénica cuando se sobreexpresa en células humanas [15]. Aumento de los niveles de ARNm de ChoKα se han descrito recientemente como un marcador pronóstico independiente en pequeños pacientes con cáncer de pulmón de células no [30]. Además, las líneas celulares de cáncer de mama humano muestran regulación al alza de ChoKα pero no ChoKβ, en comparación con las células epiteliales mamarias normales [21]. En ese sentido, se ha informado recientemente de que en el modelo de ratón del tumor de próstata (TRAMP), utilizando IHQ inmunodetección de ChoKβ, un bajo nivel de expresión de ChoKβ se encontró en las muestras tumorales en comparación con los tejidos de tipo salvaje [31].

la implicación de los miembros de la familia Rho GTPasa en el inicio y progresión del cáncer ha sido ampliamente descrito [32] - [35]. La evidencia de que Chok está implicado en la transformación maligna junto con Ras y RhoA se ha proporcionado [14], [15], [36]. Por otra parte, la actividad de ChoKα es modulada por efectores conocidos tanto de Ras y RhoA [15], [29].

La inhibición farmacológica de ChoKα se ha propuesto como una nueva estrategia antitumoral [2]. Un fuerte apoyo a esta estrategia se basa en el uso de MN58b, un inhibidor de ChoKα bien caracterizado, que muestra un potente efecto antiproliferativo en varias líneas celulares tumorales in vitro, y una fuerte reducción del crecimiento tumoral en xenoinjertos de ratones desnudos [14], [37] - [40]

Hemos comparado las propiedades bioquímicas y biológicas de ChoKα y ChoKβ, y demostrar que además de su homología, este último no es capaz de inducir la transformación celular en las células HEK293T o MDCK.. Por otra parte, se sugiere un comportamiento diferencial entre alfa y beta isoformas en el metabolismo de los fosfolípidos. Por último, las propiedades antitumorales de MN58b se pueden atribuir a su inhibición específica de ChoKα. Se discuten las implicaciones de estos hallazgos.

Resultados

Caracterización de las propiedades enzimáticas de ChoKα1 y ChoKβ isoformas

La actividad de ambas isoformas de colina quinasa, ChoKα1 y ChoKβ, ha sido descritos anteriormente en diferentes tejidos de mamíferos, sin embargo su colina quinasa y /o etanolamina quinasa actividades no se caracterizan totalmente [1], [4], [41] - [43]. Por lo tanto, se llevó a cabo un primer análisis comparativo de la
in vitro
actividad de quinasa en una de las dos isoformas ChoKα1 y ChoKβ humanos, en cuanto a su capacidad de fosforilar colina y etanolamina. HEK293T células fueron transfectadas con vectores de expresión apropiados que llevan los CHKA o CHKB genes humanos o un vector vacío, y se ensayaron para la actividad Chok y EtnK. Los niveles de expresión obtenidos fueron verificados por Western Blot (Figura 1a), y la actividad enzimática relativa a partir de extractos de células estimados. Tanto ChoKα1 y ChoKβ muestran actividades de colina y etanolamina quinasa en estas condiciones experimentales, pero la tasa de conversión fue aparentemente diferentes (Figura 1b).

células HEK293T fueron transfectadas con vectores de expresión eucarióticos del gen ChoKα1 y ChoKβ1 humano. pCDNA3b vector vacío se utilizó como control. A) La sobreexpresión de ChoKα1 y ChoKβ1 en células HEK293T detectados por Western Blot. detección de GAPDH se utilizó como control del nivel de expresión. B, C) in vitro Chok (B) y EtnK (C) de la actividad colina quinasa α1 y isoformas beta 1 en extractos libres de células de las células HEK293T transfectadas. Porcentaje de conversión de
14C-colina o
14C-etanolamina al producto fosforilado se representa. El experimento se realizó en muestras duplicadas, repitió 4 veces, y los valores medios ± SEM de todos los experimentos estimados.

Analizamos más de ChoK y EtnK actividades cinéticas para ChoKα1 y ChoKβ isoformas utilizando las enzimas recombinantes. DH5a
Escherichia coli
fueron transformadas con el gen que codifica para ChoKα1 humano o ChoKβ y un enzimática
in vitro
ensayo, ya sea para actividades EtnK ChoK o realizado. constantes de Michaelis (Km) para cada isoforma para los diferentes sustratos se obtuvieron (Tabla 1). ChoKβ mostró una Km para la colina 2,8 veces más alta que ChoKα1. Por el contrario, la Km de ChoKβ etanolamina era menor que ChoKα1. Estos resultados sugieren que en los sistemas libres de células de colina es un mejor sustrato para ChoKα1 (2,85 veces) que ChoKβ, mientras que la etanolamina es un mejor sustrato para ChoKβ (5,83 veces) que ChoKα1.

isoformas de ChoK son diferencialmente regulada por Ras y Rho GTPasas

Desde Ras GTPasas RhoA y son reguladores de aguas arriba de ChoKα1 [15], [28], algunas de las proteínas más estudiadas de la familia pequeña GTPasa incluyendo H-Ras y Rho miembros -Familia RhoA y Cdc42 se ensayaron como moduladores potenciales de aguas arriba de ChoKβ. A tal fin, un
in vitro
ChoK y EtnK ensayo de actividad se llevó a cabo en las células HEK293T transfectadas con los mutantes activos constitutivos de cada GTPasa (Fig. 2A) y, o bien ChoKα1 y ChoKβ. Como se muestra en la Figura 2, ninguna de las GTPasas probados fueron capaces de aumentar significativamente la actividad de colina o etanolamina quinasa de ChoKβ. Por el contrario, en condiciones similares, Ras y RhoA fueron capaces de inducir un cambio estadísticamente significativo en la activación de ambas actividades de ChoK y EtnK de ChoKα1 (Fig. 2b y 2c).

de colina quinasa isoformas se expresaron solo o en combinación con los Ras indicados y Rho GTPasas y la actividad
in vitro
ChoK determinado. A) Análisis de la expresión ectópica mediante Western Blot en HEK293T transfectadas extractos celulares de ChoKα1 (52 KDa), ChoKβ1 (45 KDa), RhoA-QL (22 KDa), Cdc42-QL (25 KDa) y H-RasV12 (23 KDa) . vectores vacíos fueron utilizados como controles para los niveles endógenos, y GAPDH como control de carga. B) y C)
vitro
colina actividad de la quinasa En de ChoKα1 o ChoKβ1 en presencia de una mayor expresión de las formas activas constitutivas de RhoA, Cdc42 o H-Ras. D) y E)
in vitro
etanolamina actividad quinasa de ChoKα En ChoKβ o en presencia de cada indicaron forma activa constitutiva de GTPasa. Los resultados se representan como veces de inducción de la conversión en el metabolito fosforilada correspondiente determinado como cpm totales /g de extracto celular conjunto, y se normalizaron a las células transfectadas vector vacío como control. Los datos mostrados representan los valores medios ± SEM de 3 experimentos independientes, cada uno realizado con muestras duplicadas. La significación estadística (p = 0.05) está marcado por un asterisco en comparación con la actividad logra cuando ChoKα1 o ChoKβ1, en su caso, se transfectaron solo.

papel diferencial entre Chok isoformas en la transformación celular y tumorigénesis

La implicación de ChoKα1 en la transformación celular y la carcinogénesis humana se ha estudiado ampliamente, y se ha demostrado para mostrar la actividad oncogénica [15], [36]. Debido a su extensa homología, se investigó si ChoKβ podría inducir la transformación celular cuando se sobreexpresa en células no tumorigénicas. En primer lugar, se determinó la capacidad de las células transfectadas con ChoKβ para promover el crecimiento celular independiente del anclaje utilizando la línea celular HEK293T. Como se informó anteriormente, ChoKα1 indujo un aumento significativo en el número de colonias en agar blando [15]. Por el contrario, en condiciones similares, ChoKβ sobreexpresión no tuvo ningún efecto significativo en el número ni el tamaño de las colonias en comparación con los generados por control, vector vacío transfectadas HEK293T células (Fig. 3). Estos resultados se confirmaron usando otra línea de células no tumorigénicas de una especie diferente, tales como MDCK, obteniendo resultados similares a pesar del menor nivel de sobreexpresión de ChoK tanto isoformas comparación con las células HEK293T. La diferencia de nivel de expresión obtenido fue debido a la muy diferente eficiencia en la transfección para cada uno líneas de células (datos no presentados).

A) y B)
vitro
actividad En ChoK de libre de células los extractos de las células transfectadas en el momento de la siembra, determinadas como la conversión de
marcado con 14C colina a PCho. C) Fotografías de un experimento representativo del ensayo de agar blando. Un total de 10
5 células se sembraron por placa de 60 mm, y el número de colonias cuantificó después de 5-8 semanas de incubación. D) y E) del ordenador basado en la cuantificación automática del número de colonias, los valores medios ± SEM está representado. El ensayo se realizó 3 veces independientes con muestras triplicadas la obtención de resultados similares. La significación estadística (p = 0.05) está marcado por un asterisco.

La capacidad de ChoKβ para inducir el crecimiento del tumor también fue investigado. Tanto ChoKα1- y células HEK293T o MDCK transfectadas con ChoKβ se inocularon por vía subcutánea en ratones atímicos. Como se muestra en la Fig. 4, la sobreexpresión de ChoKα1 era suficiente para inducir el crecimiento del tumor en ratones inmunodeprimidos en los dos sistemas celulares analizadas. Por el contrario, las células que sobreexpresan ChoKβ no fueron capaces de inducir el crecimiento del tumor en condiciones similares. Como se indicó anteriormente, la comparación de las tasas de crecimiento del tumor entre las dos líneas celulares se relaciona con la diversa eficacia de la transfección, mucho mayor en HEK293T (aproxm. 80-90%) que MDCK (aproxm. 15-20%). Estos resultados están en consonancia con los obtenidos en los experimentos de agar blando, y fuertemente indican que la sobreexpresión de ChoKβ no es suficiente para inducir el crecimiento del tumor en condiciones en las ChoKα1 hace.

xenoinjertos fueron establecidos por s.c. inyección de células HEK293T o MDCK transfectadas en nu /nu atímicos ratones desnudos. A) y B) el análisis Western Blot de la expresión ectópica de las isoformas de quinasa de colina en las células HEK293T o MDCK transfectadas, respectivamente, antes de la inoculación de ratones. C) y D) Análisis de la actividad colina quinasa en ChoKα1 o β1 transfectadas HEK293T extractos o MDCK células libres Antes de la inoculación de ratones. E) y F) de volumen de los tumores generados por la inyección subcutánea de 10
6 células transfectadas. volumen tumoral se calculó según la fórmula:
Vol = [D * d
2] /2
, donde D y d son mayores y menores diámetros de los tumores, respectivamente. Los datos de HEK293T representa los valores medios ± SEM de dos experimentos independientes (n
1 = 12; n
2 = 16), el experimento MDCK corresponden a un experimento equivalente, con n = 12.

ChoKβ isoforma muestra la actividad EtnK preferencial
in vivo

a continuación se investigó si había alguna diferencia en la actividad enzimática de ambas isoformas Chok bajo
in vivo
condiciones que podría explicar su actividad biológica diferencial. Por lo tanto, se ensayó la actividad de ChoKα1 y ChoKβ como ChoK y /o EtnK en un sistema de células enteras. lípidos intracelulares de HEK293T humano que sobreexpresa ChoKα1, ChoKβ o transfectadas con un vector vacío, se extrajeron una analizaron. Tanto la fracción de lípidos insoluble que contiene los lípidos hidrófobos y contenido de proteína total se utilizaron como control de carga para obtener resultados similares. Como se muestra en la Figura 5A, los niveles intracelulares fosfoetanolamina se incrementaron en un grado similar en ChoKα1- o células transfectadas con ChoKβ. Sin embargo, los niveles de fosfocolina intracelulares de las células transfectadas con ChoKβ no fueron significativamente diferentes a la de las células de control, mientras que las células transfectadas con ChoKα1 mostró un aumento en los niveles intracelulares PCho (Figura 5B). Se obtuvieron resultados similares utilizando células epiteliales de orígenes diferentes: células de adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3 (Fig 5C, D.) o la de células no pequeñas humano cáncer de pulmón (NSCLC) línea celular H1299 (Fig 5E, F.). Además, en todas las líneas celulares analizadas, expresión de la proteína se determinó también mediante análisis de Western Blot (Fig. 5G).

HEK293T, SK-BR-3 o células H1299 se transfectaron con vectores de expresión eucariotas de ChoKα1 humana y ChoKβ1 gen o pCDNA3b vector vacío utilizados como control. A), C) y E) la actividad intracelular EtnK de las isoformas de quinasa y a1 ß1 de colina en las células enteras en HEK293T, H1299 y las células SK-BR-3, respectivamente. B), D) y F) la actividad intracelular de ChoK isoformas ChoKα y ChoKβ en células enteras en HEK293T, H1299 y las células SK-BR-3, respectivamente. La cantidad de
14C-PCho y
14C-PEtn se extrajeron y se cuantificó como se describe en Materiales y Métodos. El experimento se realizó en muestras por triplicado, que se repite 3 veces, y los valores medios ± SEM de todos los experimentos estimados. La significación estadística (p = 0.05) está marcado por un asterisco. Un típico resultados del experimento de radio-etiquetado en alrededor del 70% de la incorporación compuesto radiactivo en las células. G) Representante de Western Blot de ChoKα1 ectópico o expresión ChoKβ1 en cada línea celular. Los valores basales elegidos como 1 veces en los gráficos para cada línea celular representan: las células HEK293T (PCho: 1.153 cpm; PEtn: 1.231 cpm); células H1299 (PCho: 22821 cpm; PEtn: 13339 cpm)., y SK-BR-3 células (PCho: 18620 cpm, PEtn: 3151 cpm) guía empresas
Así, el diferencial de la actividad enzimática de ChoKα1 y ChoKβ se encuentra en HEK293T no es la línea celular específica. Estos resultados indican que ChoKα1 pero no ChoKβ, es capaz de inducir aumento de los niveles intracelulares de PCho bajo
in vivo
condiciones. Sin embargo, en las mismas condiciones ambas enzimas son capaces de generar phophorylethanolamine. Por lo tanto, a pesar de que la actividad ChoKβ muestra tanto Chok y EtnK en
in vitro
condiciones, se muestra la actividad EtnK preferencial
in vivo
.

Los niveles elevados de ChoKα ARNm pero no ChoKβ en líneas celulares derivadas de tumores

con el fin de investigar más a fondo la pertinencia de cada isoenzima Chok en la tumorogénesis, a fin de determinar los niveles de ARNm tanto ChoKα y ChoKβ en un panel de líneas celulares derivadas de tumores humanos mediante la tecnología de PCR cuantitativa . Un panel de líneas celulares de cáncer de mama y de pulmón fueron comparados con la línea primaria, senescentes, no tumoral de células (células humanas epiteliales mamarias) HMEC o los inmortalizadas, células MCF10A no tumorigénico como líneas celulares de control de mama y células epiteliales bronquiales primarias ( BEC) como línea de células de pulmón de control. Todas las líneas celulares tumorales ensayadas sobreexpresan significativamente ChoKα mRNA en comparación con las líneas de células normales, mientras que no se encontraron cambios en los niveles de ARNm de ChoKβ (Fig. 6). Estos resultados indican que ChoKβ no es upregulated específicamente en las células de mama o cáncer de pulmón, lo que sugiere que no se requieren altos niveles de ChoKβ para la promoción del cáncer.

Q-PCR se realizó para determinar el nivel de expresión de mRNA en líneas de células mamarias no tumorigénico (HMEC, MCF10A), líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB435, MDA-MB468, T47D, MCF7), las células no tumorigénico pulmonares (BEC) y líneas celulares de cáncer de pulmón (H510, H82). Los datos se normalizaron con el 18S ribosomal RNA endógenos. Para la comparación entre las líneas celulares tumorales y no tumorales, el 2
-ΔΔCt método se aplicó log
10 RQ está representado. Tenga en cuenta que los datos se refieren a las células humanas epiteliales mamarias niveles (HMEC) mRNA en líneas celulares de mama y no hubo diferencias significativas en el nivel de ARNm tanto Chok isoformas se encontró con la línea de células MCF10A normal. La petición de las células del cáncer de pulmón fue de los principales células epiteliales bronquiales (BEC).

MN58b es un inhibidor específico de la isoforma ChoKα

La implicación de ChoKα en la carcinogénesis humana se ha utilizado para el diseño de inhibidores específicos de esta enzima como una nueva estrategia contra el cáncer [2], [14], [37]. MN58b es el compuesto que lleva a apoyar esta estrategia novedosa ya que se ha demostrado una potente actividad antitumoral en
in vivo
condiciones frente a modelos de tumores de colon, pulmón, mama y vejiga humanos [15], [37].

La estructura primaria de los mamíferos ChoKβ muestra una homología global del 60% con la de ChoKα1 [1]. El grado más alto de homología se encuentra dentro del dominio de quinasa de colina /etanolamina. Esta homología podría hacerlo susceptible a una inhibición similar para ambos ChoKα1 y ChoKβ con los mismos inhibidores. Por lo tanto, hemos investigado la especificidad de MN58b hacia estos dos ChoK isoenzimas con el fin de verificar si su efecto antitumoral está específicamente relacionado con la inhibición de la isoforma alfa, que es la implicada en la progresión del tumor, o el fármaco afecta de manera similar las dos isoformas. El uso de los ChoKα1 y ChoKβ proteínas recombinantes humanos, se realizó un
in vitro
Chok ensayo de inhibición de la actividad en el uso de concentraciones crecientes MN58b, la determinación de la IC
50 para cada enzima. Como era de esperar, a pesar de la gran similitud que aparece entre las isoformas de ChoK, MN58b mostró una especificidad mucho mayor contra ChoKα1 (IC
50 = 5 M) que contra ChoKβ (IC
50 = 107,5 M). Por lo tanto, MN58b es 21.5 veces más potente contra ChoKα1 de ChoKβ isoforma.

Discusión

La familia de quinasas de colina /etanolamina Humanos está formado por dos genes,
CHKA
y
CHKB Windows que codifican para tres enzimas, ChoKα1 (52 kDa), ChoKα2 (50 kDa) y ChoKβ1 (45 kDa). ChoKα1 y ChoKα2 son casi idénticos, a excepción de un tramo de 18 aminoácidos adicionales en ChoKα1, tal como resultan de la división diferencial del mismo gen,
CHKA
. Si bien la implicación de ChoKα1 en la regulación del crecimiento celular y el cáncer se ha demostrado ampliamente [13], [15], [27], [28], [37], [38], [44], las pruebas preliminares sugieren que ChoKβ no puede estar implicado en la carcinogénesis, ya que no se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de mama [21] ni en el modelo de cáncer de próstata TRAMP de ratón [31].

Una familia de genes humanos distinta ha descrito que codifica para la actividad EtnK [45], lo que sugiere que EtnK1 es la principal enzima implicada en la homeostasis del PE. El dominio ChoK /EtnK confiere a ChoKα y ChoKβ la capacidad de funcionar como actividad ChoK y EtnK en condiciones libres de células [1], [3] - [5], pero todavía no se sabe si estas enzimas previamente caracterizados mostraron ninguna selectividad a cada rama de la ruta de Kennedy en el

de novo síntesis de PC o PE. Se ha descrito recientemente la diferente especificidad hacia Cho y Etn de las dos isoformas de Cho /EtnK de
Tripanosoma brucei
. Mientras que
Tb
Cho /Etn1 sólo muestra EtnK actividad,
Tb
actividades Cho /Etn2 muestra tanto ChoK y EtnK
in vitro
[46]. Estos resultados están en consonancia con los descritos para EtnK1 murino que es específico y Etn EtnK2 que muestra una doble función ChoK /EtnK [45], [47]. Por otra parte, mientras que murino Pcyt1α y Pcyt1β están implicados en la biosíntesis de PC, Pcyt2 está enfocada a PE sólo [48].

Sin embargo aún no, se entiende plenamente que la isoforma Chok, en su caso, contribuye
in vivo
en cada vía para mantener la homeostasis normal de PC y PE en las membranas biológicas. Los resultados mostrados aquí confirmar que ambas enzimas tienen la capacidad de fosforilar la colina y la etanolamina en condiciones libres de células, ya sea como proteínas recombinantes producidas en
E. coli
, o en extractos celulares a partir de células de mamíferos. Sin embargo, hemos encontrado que, en condiciones de células enteras ChoKα1 tiene la capacidad de funcionar como Chok y EtnK, pero ChoKβ sólo afecta a la producción de PEtn. Estos resultados de los diferentes roles para alfa y beta isoformas están de acuerdo con la información de la recién generados Knock Out (KO) los ratones de ChoKα y ChoKβ genes [49], [50]. Por lo tanto, los ratones KO ChoKβ (
rmd
ratones) son viables, pero desarrollan una distrofia muscular rostrocaudal, mientras que los niveles normales de lípidos PC se encuentran en la mayoría de los tejidos analizados, excepto en el músculo esquelético de las extremidades posteriores [49]. Por lo tanto, ChoKα es suficiente para mantener los niveles normales de PC en la mayoría de los tejidos. Por el contrario, la falta de ChoKα resulta en la letalidad embrionaria, y ChoKα
+/- ratones heterocigotos muestran una acumulación de Cho y una reducción de PCho en el hígado y los testículos, lo que sugiere que no hay compensación ChoKβ para la biosíntesis de PC

in vivo. Estos resultados sugieren diferentes roles
in vivo Opiniones de ambas isoformas ChoKβ y ChoKα. Además, los niveles atenuados en PE que se encuentran en ChoKα
+/- ratones heterocigotos sugieren la participación de ChoKα no sólo en la biosíntesis de PC, sino también en la vía de PE. Esto también es coherente con el hecho de que en los ratones KO ChoKβ, los niveles de educación física no se ven afectadas, lo que indica que la EP homeostasis se mantiene por completo con las proteínas intactas EtnK1 y ChoKα
.
El grupo de Ishidate ha proporcionado valiosa información acerca de la
in vitro
actividad de ChoK de diferentes tejidos de ratón, y se han postulado que la forma más activa para la actividad colina quinasa es el homodímero α /α seguido de heterodímeros α /beta, siendo el β /β homodímero de las menos activas forma [8]. Los
in vivo
resultados que se muestran aquí son parcialmente de acuerdo con esta hipótesis. El
in vivo
actividad de ChoKβ se centra en la biosíntesis de PE información y de alta Km para la colina de ChoKα, esto podría ser la razón por dímeros ß /β muestran una baja actividad Chok. Cuando se sobreexpresa ChoKβ se observó un aumento en los niveles intracelulares de PEtn pero no de PCho. Sin embargo no se encontraron diferencias entre las dos isoformas de la generación de PEtn, ya que ambos presentan actividad EtnK similar.
Se ha propuesto
PCho para promover la mitogénesis en células de mamífero [12]. De acuerdo con esto, las técnicas de espectroscopia de resonancia magnética han revelado niveles más altos de phosphomonoesthers en muestras tumorales en comparación con sus homólogos normales [19] - [24]. Por otra parte, la sobreexpresión de ChoKα1 es oncogénico [15], y la actividad ChoKα mejorado es una característica frecuente en muestras tumorales en comparación con tejidos normales [27], [28]. Tomados en conjunto estos resultados indican claramente que la actividad y los niveles ChoKα1 PCho tienen una fuerte implicación en el cáncer. Además, la sobreexpresión de ChoKα1 resulta en un aumento de la actividad y los niveles de EtnK PETN. Sin embargo, el último efecto por sí mismo no es suficiente para inducir la transformación celular, ya que la sobreexpresión de ChoKβ no induce la formación de colonias mejorada en agar blando o el crecimiento del tumor en ratones desnudos. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que es la producción de PCho lo que está vinculado a la proliferación celular y la transformación mediada por ChoK, y que la producción de PEtn puede no ser suficiente o relevante en este proceso.

Lo anterior resultados sugieren que las dos isoformas de ChoK investigados, además de su similitud en sus secuencias primarias, están implicados en las diferentes vías metabólicas. Así, mientras ChoKα1 incide tanto en la síntesis de PC y PE, ChoKβ afecta a la síntesis de PE solamente. Además, la capacidad de transformación parece ser exclusivo de la isoforma ChoKα. Sin embargo, ya que en el HEK293T humano, Sk-Br-3 y las líneas celulares H1299, ChoKα1 sobreexpresión produce niveles elevados de ambos PCho y PEtn, mientras similares ChoKβ sobreexpresión resultados sólo en los niveles más altos de PEtn pero niveles normales de PCho, no podemos descartar la posibilidad de que la transformación celular requiere que ambas actividades ChoK y EtnK.

de acuerdo con la idea que vincula la actividad oncogénica de la función de ChoKα, pero no ChoKβ, la actividad antiproliferativa y antitumoral del MN58b se halla asociada a la actividad de ChoKα. Además, como se informó anteriormente, la
in vivo
tratamiento con MN58b como resultado una disminución específica de los niveles de PCho en los tumores, pero no tiene efecto significativo sobre los niveles de PEtn [51]. Los resultados previos de nuestro grupo han demostrado que MN58b también inhibe el transporte de colina [38]. Sin embargo, este efecto tiene una pequeña influencia en la actividad antiproliferativa y antitumoral del fármaco desde HC-3, un inhibidor mucho más potente de los transportadores de colina, es mucho menos potente como un agente antiproliferativo que MN58b [2]. Además, MN58b tiene un efecto diferencial en cualquiera de las células normales o tumorales, una fuerte demostración de una actividad diferencial debido a la inhibición de ChoK [38] - [40]. Estos resultados son también de acuerdo con la observación de que ChoKα pero no ChoKβ es un objetivo corriente abajo de moléculas oncogénicas tales como Ras y RhoA. Por lo tanto, mientras que Ras se activa a través de ChoKα Ral-GDS y PI3K [29], y RhoA activa ChoKα través de la roca [15], ninguna de estas GTPasas oncogénicos afectar a la actividad ChoKβ en condiciones similares. Una vez más, estos resultados indican que aunque ambas enzimas ChoK son capaces de fosforilar tanto la colina y la etanolamina en condiciones de sistemas libres de células, que muestran diferentes afinidades para estos sustratos, y en condiciones de ensayos de células completas que se rigen por las vías de regulación distintas.

Finalmente, la participación de ChoKβ en el cáncer de mama y de pulmón se ha estudiado, ChoKα y ß niveles de ARNm se determinaron mediante Q-PCR. Todas las líneas celulares derivadas de tumores ensayados significativamente sobreexpresan ChoKα mRNA, mientras que no se encontraron cambios en la expresión de ChoKβ. Resultados similares han sido reportados recientemente, usando PCR semicuantitativa en líneas celulares de cáncer de mama [21].

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