Extracto
La hipertermia (HT) mejora la eficacia de la radioterapia contra el cáncer y la quimioterapia. Sin embargo, HT también evoca inevitablemente respuestas de estrés y aumenta la expresión de proteínas de choque térmico (HSPs) en las células cancerosas. Entre las HSPs, HSP70 se conoce como una proteína pro-supervivencia. En este estudio, se investigó el efecto sensibilizador de los pifithrin -μ (PFT), un inhibidor de molécula pequeña de HSP70, cuando tres líneas celulares de cáncer de próstata humano (LNCaP, PC-3 y DU-145) fueron tratados con HT (43 ° C durante 2 h). Todas las líneas celulares expresaron constitutivamente HSP70, y HT aumentó aún más su expresión en LNCaP y DU-145. Desmontables de HSP70 con interferencia de ARN disminuyó la viabilidad y la capacidad de formación de colonias de células cancerosas. PFT-μ disminuyó las viabilidades de todas las líneas celulares en una décima parte de la dosis de quercetina, un conocido inhibidor de la HSP. La terapia de combinación con dosis subóptimas de PFT-μ y HT disminuyó la viabilidad de las células cancerosas más eficazmente cuando se añadió PFT-μ inmediatamente antes de HT, y este efecto de la combinación fue abolida por pre-desmontables de HSP70, lo que sugiere que el efecto es mediado a través de la inhibición de HSP70. La muerte celular inducida por la terapia de combinación, parcialmente dependiente de caspasa, y la disminución de la proliferación de células cancerosas, con disminución de la expresión de c-Myc y ciclina D1 y aumento de la expresión de p21
WAF1 /Cip, lo que indica la detención del crecimiento celular. Además, la terapia de combinación redujo significativamente la capacidad de formación de colonias de células cancerosas en comparación con el tratamiento con cualquiera de los dos solo. Además, en un modelo de ratón con xenoinjerto, la terapia de combinación inhibió significativamente el crecimiento del tumor PC-3. Estos hallazgos sugieren que PFT-μ puede mejorar de manera efectiva los efectos antitumorales HT inducida a través de la inhibición de HSP70 mediante la inducción de la muerte celular y la detención del crecimiento celular, y que la PFT-μ es un agente prometedor para su uso en combinación con HT para tratar el cáncer de próstata.
Visto: Sekihara K, N Harashima, Tongu M, Tamaki Y, Uchida N, Inomata T, et al. (2013) Pifithrin-μ, un inhibidor de la proteína de choque térmico 70, puede aumentar los efectos antitumorales de células de cáncer de próstata La hipertermia Contra Humanos. PLoS ONE 8 (11): e78772. doi: 10.1371 /journal.pone.0078772
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 10 Junio, 2013; Aceptado: September 16, 2013; Publicado: 14 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sekihara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones-en-ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (n. ° 18.591.449 a M. Harada y no. 23701074 a N. Harashima), y de Shimane Universidad Proyecto "S-TAKUMI médica Nanotecnología" (a M. Harada). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más común y la tercera causa más común de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos [1]. Aunque el cáncer de próstata en etapa temprana se puede controlar bien mediante cirugía o radioterapia, pacientes con cáncer de próstata avanzado se tratan con terapia hormonal [2]. Sin embargo, después de una remisión a corto plazo, que sobreviven las células cancerosas a menudo regresan con una mayor malignidad [3]. Por lo tanto, para mejorar la supervivencia en hombres con cáncer de próstata, se deben desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
La hipertermia (HT) es una terapia eficaz que tiene baja toxicidad, efectos secundarios leves, y se ha demostrado que es sinérgico con otros tipos de terapias contra el cáncer. Numerosos
in vitro en
y
in vivo
estudios han revelado que la TH mejora notablemente la eficacia de la radioterapia y la quimioterapia contra diversos tipos de cáncer [4] - [6]. Además, muchos ensayos clínicos han demostrado que la adición de HT a la radioterapia o la quimioterapia puede producir una respuesta más completa [7] - [11]. Sin embargo, la TH se asocia inevitablemente con las proteínas de choque térmico (HSP) [12], [13]. HSPs son chaperones moleculares que actúan como la defensa celular primaria contra daños en el proteoma, iniciando replegamiento de proteínas desnaturalizadas y la regulación de la degradación después de daño severo proteína [14]. HSPs a proteger las células tanto por la limitación de los efectos de los agentes que dañan proteínas a través de chaperoning proteínas y replegamiento y bloqueando directamente vías de muerte celular [15] - [18]. Entre los HSPs, HSP70 es un HSP inducible por estrés que se ha informado a desempeñar un papel en la terapia de la resistencia [19]. En contraste con su muy bajo nivel en las células normales no acentuadas, la expresión de HSP70 aumenta rápidamente en respuesta a diferentes tipos de estrés [20], [21]. Es importante destacar que, se ha informado aumento de la expresión de HSP70 en células de cáncer que se asocia con características malignas y peor pronóstico de pacientes con cáncer [22]. Esta evidencia sugiere que HSP70 es un objetivo prometedor en el tratamiento del cáncer. Reducir los niveles de HSP70 en algunas células tumorales cultivadas se ha informado de inducir la muerte celular, y /o para sensibilizarlos a agentes citotóxicos, mientras que no tiene efectos obvios deletéreos sobre células no tumorales [23] - [28].
Pifithrin (PFT) -μ (2-phenylethynesulfonamide) se identificó inicialmente como un inhibidor de molécula pequeña de la unión de p53 a la mitocondria [29]. A partir de entonces, se descubrió que esta molécula de interactuar selectivamente con HSP70 y para inhibir sus funciones [30]. Esta información nos llevó a probar la hipótesis de que la PFT-μ podría aumentar los efectos antitumorales HT inducida contra las células de cáncer de próstata humanos. En el estudio actual, después de confirmar que la HSP70 se expresa constitutivamente y /o reforzado por HT y desempeña un papel pro-supervivencia en las células de cáncer de próstata humano, hemos demostrado que la combinación de dosis subóptimas de PFT-μ puede mejorar con eficacia antitumoral HT inducida efectos contra el cáncer de próstata humano
in vitro
, y que la terapia de combinación puede inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón.
Materiales y Métodos
cultivo de células y reactivos
tres líneas celulares de cáncer de próstata humano (LNCaP, PC-3 y DU-145) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.), y se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Sigma- Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) y 20 mg /ml de gentamicina (Sigma-Aldrich) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. PFT-μ y quercetina se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (SCB: Santa Cruz, CA, EE.UU.). Y el Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE.UU.), respectivamente
ensayo de viabilidad celular
la viabilidad celular se evaluó usando la (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2, 4-disulfofenil) -2H-tetrazolio sal monosódica (WST-8) de ensayo 2- (Nacalai tesque, Kyoto, Japón). Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano. Dos días más tarde, se añadió WST-8 a cada pocillo, y las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm después de 3 h.
La terapia de combinación con HT y PFT-μ
Para inducir HT, células cancerosas, que se sembraron 1 día antes, se incubaron a 43 ° C durante 2 h. Las células de cáncer siempre se cultivaron en presencia de PFT-μ durante 2 días. En algunos experimentos, HT se realizó en días 1, 2, o 3 después de comenzar el cultivo de células cancerosas.
Transfección de pequeños ARN de interferencia (siRNA)
Transfección de ARNsi se realizó utilizando Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. HSP70 siRNA (sc-29352) se adquirió de SCB. Control de siRNA (# 6568) fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (CCT), Danvers, MA, EE.UU.. Tres días después de siRNA transfección, se utilizaron las células de cáncer para los experimentos.
Colonia-ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de seis pocillos de fondo plano. Un día más tarde, se añadió PFT-μ y se trató con o sin HT. Dos días después de la adición de PFT-μ, el medio se reemplazó con medio nuevo que contiene no PFT-μ, y el cultivo se continuó durante un período adicional de 10-12 días. A partir de entonces, las colonias se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,05% de cristal violeta, contaron entonces
inmunotransferencia
Las células se lisaron con un reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (M-PER;. Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Nacalai Tesque). Igual cantidad de proteína se resolvieron en un gradiente de 4-12% o 12% en geles de SDS-PAGE, y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Después de bloquear las membranas, las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-HSP70 (Hsp72; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), anti-HSP90 (CST), anti-c-Myc (Epotomics, Burlingame, CA, EE.UU.), anti-cyclinD1 (CST), anti-β-actina (BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.) y anti-α-tubulina (SCB). Cabra anti-conejo o de cabra anti-ratón alcalinas anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa (Invitrogen) se utilizaron para detectar los anticuerpos primarios. Para evaluar el nivel de expresión de HSP70 después de HT, una proporción de la expresión de HSP70 /la expresión de β-actina se evaluó por densitometría usando el ImageJ (http://rsbwed.nih.gov/ij/).
análisis de citometría de flujo
la muerte celular se evaluó utilizando el Kit de Anexina V-FITC apoptosis Detección (Biovision, Mountain View, CA, EE.UU.), APC-conjugado de Anexina V (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), y yoduro de propidio (PI). Para la inhibición de las caspasas, z-VAD-fmk (R & amp; D Systems, Mineapolis, MN, EE.UU.), y se añadió DMSO se usó como un control del vehículo. Para examinar el ciclo celular y la proliferación de células cancerosas, se utilizó un kit de proliferación BrdU /7AAD (Becton Dickinson, Fullerton, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson).
En vivo
modelo de xenoinjerto
BALB
nu /nu
ratones machos, adquiridos de CLEA Japón (Tokio, Japón), se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shimane (Número de Permiso: IZ25-6). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones se inocularon en la almohadilla de la pata derecha con 1 × 10
6 PC 3-células con Matrigel (BD Biosciences Japón, Tokyo, Japón) en una relación 01:01 de volumen en un volumen de 50 l. En el día 15, los ratones se agruparon y se dividieron en cuatro grupos. En los días 0 y 4 después de la agrupación, estos ratones PC-3-cojinete se trataron con PFT-μ y /o HT. PFT-μ (100 mg en 50 l) se inyectó en el tumor. Como un vehículo de control, se inyectaron 50 l de DMSO. Para llevar a cabo la terapia HT, estos ratones PC-3 que soportan sólo sus almohadillas de las patas habían bañado en agua a 43 ° C durante 30 minutos después de la fijación de ellos en placas con cinta. Posteriormente, el tamaño del tumor, el producto de dos diámetros perpendiculares, y el espesor de la almohadilla plantar se midieron dos veces por semana.
análisis estadísticos
Los datos fueron evaluados estadísticamente usando un no apareado de Student de dos colas
t-test
o una prueba de Dunnett paramétrico. Un
se consideró el valor de p Red de menos de 0,05 para indicar la significación estadística.
Resultados
papel pro-supervivencia de HSP70 en células de cáncer de próstata humano
Se evaluó primero los niveles de proteína HSP70 en tres líneas celulares de cáncer de próstata humano antes y después del tratamiento con HT (43 ° C durante 2 h) (Fig. 1A). Estas líneas celulares expresaron constitutivamente HSP70. Aunque no cambio definitivo se observó en PC-3, los niveles de expresión en LNCaP y DU-145 se incrementaron después de HT. A continuación se determinó si HSP70 desempeña un papel pro-supervivencia en las células del cáncer de próstata. La expresión de HSP70 se redujo selectivamente por transfección de HSP70 siRNA (Fig. 1B), lo que disminuyó la viabilidad celular de las tres líneas celulares (Fig. 1C). También se encontró que desmontables de HSP70 disminuyó significativamente la capacidad de formación de colonias de PC-3 y DU-145 (Fig. 1D). Además, debido a la incapacidad de LNCaP de formar colonias en este ensayo (datos no mostrados), se evaluó su viabilidad después de un cultivo de 12 días. Como resultado, desmontables de HSP70 disminuyó la viabilidad de las células LNCaP después del cultivo de 12 días (Fig. 1E). Estos resultados indican que la HSP70 desempeña un papel pro-supervivencia en las células de cáncer de próstata humano.
líneas celulares de cáncer de próstata Tres (A) fueron tratados con HT (43 ° C durante 2 h). Antes y después de 4, 8, 12, y 24 h, se prepararon lisados y la expresión de HSP70 se evaluó mediante inmunotransferencia. ß-actina se utilizó como control. El número representa la relación de la expresión de HSP70 a la de la β-actina, que fue evaluado por densitometría usando ImageJ. (B) Tres días después de la transfección de ARNsi HSP70 o siRNA control, la expresión de HSP70 se evaluó mediante inmunotransferencia. ß-actina se utilizó como control. (C) Las líneas celulares de tres, que había sido pre-transfectadas con siRNA HSP70 o controlar siRNA tres días antes, se cultivaron. Después de 48 h, se determinó la viabilidad celular (%) usando el ensayo de WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) (D) PC-3 y DU-145, que había sido pre-transfectadas con siRNA HSP70 o controlar siRNA 2 días antes, se cultivaron durante el ensayo de colonias de formación durante 12 días. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) (E) LNCaP, que había sido pre-transfectadas con siRNA HSP70 o controlar siRNA 2 días antes, se cultivaron durante 12 días, y la viabilidad celular (%) se determinó usando el ensayo de WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) guía empresas
efectos antitumorales en células de cáncer de próstata humanas inducidas por la terapia de combinación con HT y PFT-. μ
Los datos anteriores sugieren que la inhibición de HSP70 podría facilitar el tratamiento del cáncer de próstata mediante HT. Por lo tanto, el próximo investigó el efecto del nuevo inhibidor de HSP70 PFT-μ de la actividad antitumoral HT inducida. Antes de evaluar el efecto antitumoral inducida por la combinación de la TH y PFT-μ, se comparó el efecto antitumoral de PFT-μ a la de quercetina, un factor de choque térmico (HSF) -1 inhibidor, que inhibe la sobre regulación de todos genes, incluyendo inducida por choque térmico
HSP70
de genes [31] (Fig. 2A). Tanto la quercetina y la PFT-μ disminuyeron la viabilidad de las líneas celulares de cáncer de próstata tres de una manera dependiente de la dosis, pero PFT-μ ejercen su efecto antitumoral en casi un décimo de la dosis de quercetina. También confirmó que desmontables de HSP70 no pudo influir en la expresión de HSP90, otro HSP clave de la vía de respuesta al estrés (Fig. 2B). PFT-μ no tuvo efecto sobre la expresión de la proteína HSP70, como se informó anteriormente [30].
(a) Tres líneas celulares fueron cultivadas con las dosis indicadas de quercetina o PFT-μ. Después de 48 h, se determinó la viabilidad celular (%) usando el ensayo de WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. (B) Dos días después de la transfección de ARNsi HSP70 o control siRNA, la expresión de HSP90 y HSP70 se evaluó mediante inmunotransferencia. La expresión de estos HSPs también se examinó después de que el tratamiento con PFT-μ (5 M). β-actina se utilizó como control.
A continuación, se evaluó los efectos antitumorales inducidos por la combinación de la TH y PFT-μ. Hemos explorado por primera vez para los protocolos óptimos para maximizar los efectos antitumorales inducidos por esta combinación. Como se muestra en la Fig. 3A, tres líneas celulares de cáncer de próstata humano fueron tratados con tres protocolos diferentes; en el protocolo-1 (P-1), HT se realizó 24 h antes de la adición de PFT-μ; en el protocolo-2 (P-2), se añadió PFT-μ inmediatamente antes HT; y en el protocolo-3 (P-3), HT se realizó 24 h después de la adición de PFT-μ. Se observó el efecto más destacado tras la aplicación del protocolo P-2 (Fig. 3B). datos representativos seleccionados se muestran en la Fig. 3C. La viabilidad de las células cancerosas se redujo significativamente cuando HT se combinó con una dosis subóptima (5 M) de PFT-μ. Nos determinó además si el efecto de combinación se puede observar en las células cancerosas que se han pre-transfectadas con siRNA HSP70 (Fig 3D.); la pre-desmontables de HSP70 abolió el efecto de la combinación contra el PC-3 y DU-145. Estos resultados indican que las dosis subóptimas de PFT-μ pueden aumentar los efectos antitumorales HT inducida en las células cancerosas de la próstata a través de la inhibición de HSP70, y que se consigue el efecto más prominente cuando se añade PFT-μ inmediatamente antes HT
.
( A) se muestran tres protocolos diferentes. (B) Tres líneas de células se cultivaron con las dosis indicadas de PFT-μ en base a tres protocolos diferentes con HT (barra rayada) o sin HT (barra de color negro). HT se realizó a 43 ° C durante 2 h. Después de 48 h, se determinó la viabilidad celular (%) usando el ensayo de WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. se muestran (C) Los resultados seleccionados. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) (D) PC-3 y DU-145, que había sido pre-transfectadas con siRNA HSP70 o controlar siRNA 2 días antes, fueron culured con PFT-μ (5 M) con /sin HT (43 ° C durante 2 h). Después de 48 h, se determinó la viabilidad celular (%) usando el ensayo de WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) NS: no significativo
muerte de las células del cáncer tras la terapia de combinación de HT y PFT-μ.
En los estudios descritos anteriormente, se evaluó principalmente los efectos antitumorales sobre las células de cáncer de próstata mediante la medición de la viabilidad de 2 días después del tratamiento con HT y PFT-μ. Sin embargo, tales efectos sobre la viabilidad pueden reflejar alteraciones en la muerte y /o el crecimiento celular. Por lo tanto, el próximo evaluó el mecanismo subyacente de la acción. Como se muestra en la Fig. 4A, HT solo no aumentó el porcentaje de Anexina-V
+ células, mientras que el tratamiento con PFT-μ aumentó ligeramente. Sin embargo, el tratamiento combinado aumentó drásticamente el porcentaje de Anexina V
+ células, tanto temprana de apoptosis Anexina-V
+ /PI
- y la apoptosis tardía y /o necrótico Anexina-V
+ /PI
+, especialmente en las células LNCaP. El aumento en el porcentaje de Anexina V
+ células parecía ser único aditivo en PC-3 y DU-145. Además, la adición de 20 mM z-VAD, un inhibidor de pan-caspasa, parcialmente reducido el porcentaje de Anexina V
+ células LNCaP después del tratamiento en combinación de HT y PFT-μ (Fig. 4B). Se detectó la recuperación inducida por z-VAD de Anexina V
+ células en el Anexina V
+ /PI
- (apoptosis temprana) subconjunto. Esta dosis de z-VAD era suficiente para inhibir la muerte celular inducida por TRAIL de células que expresan el receptor de la muerte pancreática humana del cáncer [32]. Estos resultados indican que, aunque la eficacia varía entre líneas celulares de cáncer, la terapia de combinación con HT y PFT-μ puede mejorar la muerte de las células de cáncer de próstata, y que la combinación de terapia inducida por la muerte celular de LNCaP es parcialmente dependiente de caspasa.
Tres líneas celulares (a) fueron tratados con HT (43 ° C durante 2 h) y /o PFT-μ. Después de 48 h, la citometría de flujo se llevó a cabo después de la tinción con anexina V y PI conjugado con FITC. Se muestra un resultado representativo. Los números representan los porcentajes de cada subconjunto. (B) las células LNCaP se trataron con ambos HT y PFT-μ (5 M) en presencia de z-VAD (20 M) o el control de DMSO. Después de 48 h, la citometría de flujo se llevó a cabo después de la tinción con APC conjugado con Anexina V y PI. Los números representan los porcentajes de cada subgrupo.
La terapia de combinación con HT y PFT-μ puede detener el crecimiento de células de cáncer de próstata
Además, investigó si la detención del crecimiento celular estaba involucrado en los efectos antitumorales inducidas por la terapia de combinación con HT y PFT-μ. Como se muestra en la Fig. 5A, se evaluó la proliferación y ciclo celular de las células de cáncer mediante la evaluación de la absorción de BrdU y la tinción 7AAD. Hemos encontrado que la terapia de combinación con HT y PFT-μ disminuyó el porcentaje de BrdU células cancerosas
+ S-fase y aumentó la de G2 /M células de cáncer de fase en las tres líneas celulares. También se evaluó la expresión de moléculas relacionadas con el ciclo celular y se encontró que la terapia de combinación produjo una disminución de la expresión de c-Myc en LNCaP y disminución de la expresión de la ciclina D1 en PC-3 y DU-145. Además, la expresión de p21
WAF1 /Cip se aumentó en las tres líneas celulares de cáncer. Estos datos sugieren que la detención del crecimiento celular contribuye a los efectos antitumorales inducidas por la terapia de combinación con HT y PFT-μ.
(a) tres líneas celulares se trataron con o sin HT (43 ° C durante 2 h) y PFT-μ (5 M) durante 2 días. Durante la última 5 h para LNCaP, 90 min para PC-3, y 3 h de DU-145, las células se cultivaron con BrdU (10 M). Luego, las células recolectadas se tiñeron con anticuerpo anti-BrdU conjugado con FITC y 7AAD, y citometría de flujo se llevó a cabo. Los números representan los porcentajes de cada subconjunto. (B) Tres líneas celulares fueron tratados con uno o ambos de HT y PFT-μ (5 M) durante 2 días, y los niveles de expresión de c-Myc, ciclina D1, y p21
proteína WAF1 /Cip se determinaron por inmunotransferencia. β-actina y la α-tubulina se utilizaron como controles.
La terapia de combinación con HT y PFT-μ puede disminuir la capacidad de formación de colonias de células cancerosas
A continuación se investigó el efecto de la terapia de combinación con HT y PFT-μ en la capacidad de formación de colonias de células de cáncer de próstata. La terapia de combinación redujo significativamente la capacidad de formación de colonias de PC-3 y las células DU-145 (Fig. 6A) y la disminución de la viabilidad de las células LNCaP en el cultivo a largo plazo (12 días) (Fig. 6B). Estos resultados indican que la terapia de combinación con HT y PFT-μ puede disminuir la capacidad de formación de colonias y la viabilidad, en un cultivo a largo plazo, de las células de cáncer de próstata.
(A) PC-3 y DU-145 las células se cultivaron durante 14 días y se determinaron sus capacidades de colonias de formación. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
) (B) Células LNCaP fueron cultivadas durante 12 días, y la viabilidad (%) se determinó usando el ensayo WST-8. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres pozos. *
P Hotel & lt; 0,05 (
t de Student
) guía empresas
En vivo
efecto antitumoral de la HTA y la PFT-μ combinación. terapia en un xenoinjerto en ratones modelo
Finalmente, se evalúa si la terapia de combinación con HT y PFT-μ ejerce un efecto antitumoral en cáncer de próstata humana establecida en un modelo de xenoinjerto de ratón (Fig. 7). Las almohadillas de las patas de ratones desnudos se inocularon con células PC-3 y los ratones fueron tratados con PFT-μ y /o HT. Teniendo en cuenta la anatomía de la almohadilla de la pata, el crecimiento del tumor se evaluó midiendo no sólo el producto de dos diámetros perpendiculares, sino también el espesor de la almohadilla plantar. Como resultado, a pesar de la administración local de PFT-μ no tuvo ningún efecto antitumoral, sino más bien promovió el crecimiento del tumor, y HT disminuyó el crecimiento del tumor ligeramente, pero no significativamente, la terapia de combinación con HT y PFT-μ suprimió de forma significativa el crecimiento del tumor en comparación con el grupo control.
BALB
nu /nu
ratones machos fueron inoculados en la almohadilla de la pata derecha con 1 × 10
6 PC-3 células con Matrigel. En el día 15, los ratones se agruparon y se dividieron en cuatro grupos. Cada grupo contenía seis ratones. En los días 0 y 4 después de la agrupación, los ratones PC-3-cojinete se inyectaron localmente con PFT-μ (100 mg en 50 l) y /o tratados con HT (43 ° C durante 30 min). Las flechas representan el día del tratamiento. Como un vehículo de control, se inyectaron 50 l de DMSO. HT se realizó 1 hora después de la inyección local de PFT-μ. A continuación, el tamaño del tumor, el producto de dos diámetros perpendiculares (A, B), y el espesor de la almohadilla plantar (C, D) se midieron dos veces por semana. Los resultados se muestran como la media ± SD de seis ratones. *
P Hotel & lt; 0,05 **
P
. & Lt; 0,01 (prueba de Dunnett) NS: no significativo
Discusión
Entre una variedad de tipos de cáncer, HT es aplicable especialmente para el cáncer de próstata [33]. Sin embargo, como se discutió en la introducción, HT evoca inevitablemente las respuestas de estrés en las células cancerosas. Hsp70 es una proteína pro-supervivencia-inducible por calor potente que confiere citoprotección contra diversos estímulos que inducen la muerte y aumenta la tumorigenicidad [25], [27], [34]. Por lo tanto, HSP70 se ha sugerido como un objetivo prometedor para el tratamiento del cáncer [19]. En el presente estudio, hemos demostrado que las líneas celulares de cáncer de próstata son tres constitutivamente positivo para HSP70, y que la TH puede aumentar su expresión en LNCaP y líneas de células DU-145. Inesperadamente, la expresión de HSP70 en PC-3 disminuyó ligeramente 8 h después de HT; no somos capaces de explicar esta observación en la actualidad. Sin embargo, es de notar que la precipitación selectiva de HSP70 en células de cáncer disminuyó significativamente su viabilidad y capacidad de formación de colonias. Nuestros resultados sugieren que HSP70 es una proteína pro-supervivencia en las células de cáncer de próstata, de acuerdo con informes anteriores [23] - [28]. Estos resultados nos llevaron a probar el efecto de la combinación de HT con PFT-μ, un inhibidor identificado recientemente HSP70 [30], sobre las células de cáncer de próstata humano.
terapia de combinación con HT y PFT-μ disminuyó significativamente la viabilidad de líneas celulares de cáncer de próstata tres comparación con el tratamiento, ya sea con terapia sola. En cuanto al mecanismo subyacente, hemos probado dos posibilidades;
es decir.
, La muerte celular y la detención del crecimiento celular. Anexina V /PI tinción reveló que la terapia de combinación aumentó el porcentaje de Anexina V
+ células (Fig. 4A). Aunque el efecto de la combinación fue leve en PC-3 y las células DU-145, un aumento drástico y sinérgica en el porcentaje de Anexina V se observó
+ células en las células LNCaP. HT sí solo no afecta el porcentaje de Anexina V células
+, y el efecto de PFT-μ solo también fue marginal. Anexina V
+ /PI
+ positividad no indica células apoptóticas porque las células necróticas-finales también son positivas tanto para anexina V y PI. Con respecto a la detención del crecimiento celular, la terapia de combinación redujo la fracción de la fase S y aumentó la fracción de la fase M G2 /en tres líneas celulares de cáncer (Fig. 5A). Estos resultados son consistentes con los de un informe reciente que muestra que la PFT-μ puede inducir G2 /M detención en las células del cáncer [35]. Además, la terapia de combinación redujo la expresión de c-Myc en LNCaP y ciclina D1 en PC-3 y DU-145, y el aumento de la expresión de p21
WAF1 /Cip en tres líneas celulares. Estos cambios en las moléculas relacionadas con el ciclo celular pueden explicar parcialmente por la detención del crecimiento de células de cáncer de próstata en respuesta a la terapia de combinación.
HSP90 y HSP70 se influyen entre sí [36]. Dado que la inhibición de HSP90 está asociada con la sobre regulación de HSP70 [37], varios grupos han informado de que co-inhibición de HSP70 aumenta notablemente la citotoxicidad de los inhibidores de HSP90 para varios tipos de tumores diferentes [38]. A la inversa, HSP70 es un co-chaperon crítico para HSP90 y está implicado en la entrega de proteínas cliente de HSP90 [39], y la inhibición de HSP70 puede inducir apoptosis específica de tumor a través de la función de HSP90 [28]. Estas líneas de información sugieren que desmontables de HSP70 y PFT-μ aumentó el efecto de la TH a través de la inhibición de HSP90. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de la caída de HSP70 o PFT-μ de la expresión de HSP90 en las células cancerosas, mientras que no se observó ningún cambio en la expresión de HSP90 (Fig. 2B). Sin embargo, este resultado no puede excluir la posibilidad de que la inhibición de HSP70 o PFT-μ influyó en el secuestro de proteínas cliente de HSP90, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico, HER2 /ErbB2 y AKT, en una fracción insoluble y promovió su agregación e inactivación, según ha informado [ ,,,0],40].
se determinó si la combinación de terapia inducida por la muerte celular de las células LNCaP fue dependiente de la caspasa (Fig. 4B). La adición del inhibidor de pan-caspasa z-VAD disminuyó el porcentaje de Anexina V
+ /PI
- células LNCaP temprana de apoptosis, lo que implica que la apoptosis dependiente de caspasa fue parcialmente responsable de la muerte combinación de células inducida por el tratamiento de LNCaP. Dado que solo HT no inducir la muerte celular, este efecto parece reflejar principalmente el efecto de la PFT-μ. Recientemente hemos informado de que la PFT-μ hace que la caspasa-dependiente y la muerte celular -independiente de las células de cáncer de páncreas humanos [32]. En cuanto a la muerte celular independiente de caspasas, HSP70 se ha informado que se unen a factor inductor de apoptosis (AIF), que induce la apoptosis independiente de caspasas por la translocación en el núcleo [41]. Sin embargo, la interferencia de ARN de AIF no tuvo ningún efecto sobre la muerte celular PFT-μ-inducida de células de cáncer de próstata (datos no mostrados). Por lo tanto, es probable FIA no participa en la muerte inducida por la terapia de combinación de células LNCaP. Alternativamente, HSP70 se ha informado de localizar a las membranas de los lisosomas, promover la viabilidad de células de cáncer, e inhibir la muerte celular inducida por TNF mediante la inhibición de la permeabilidad de la membrana lisosomal [42]. Por lo tanto, HSP70 aumenta la supervivencia mediante la estabilización de los lisosomas en las células cancerosas. Desde PFT-μ une HSP70, es posible que PFT-μ inhibe la estabilización HSP70 inducida de permeabilidad de la membrana lisosomal, lo que resulta en un aumento de la muerte celular. Sin embargo, se necesitan más estudios para dilucidar el mecanismo exacto de la muerte celular después de la terapia de combinación con HT y PFT-μ.
Cuando HT se combina con medicamentos contra el cáncer, el calendario de administración del fármaco es crítica [ ,,,0],13]. Por lo tanto, en este estudio, se compararon los efectos antitumorales inducidas por tres protocolos diferentes, y encontramos que la TH que inmediatamente después de la adición de PFT-μ produjo los mayores efectos antitumorales (Fig. 3). Esto indirectamente sugiere que HSP70 desempeña un papel protector inmediatamente después del estrés por calor
.
Se evaluaron los efectos antitumorales de la terapia de combinación de la formación de colonias de ensayo. Este ensayo se realizó durante 12 días, y el resultado puede reflejar el efecto de tanto la muerte celular y la detención del crecimiento celular. La combinación con HT y PFT-μ disminuyó significativamente la capacidad de formación de colonias de PC-3 y DU-145 células. En el caso de LNCaP, la terapia de combinación provocó un efecto antitumoral en LNCaP en un ensayo de viabilidad celular a largo plazo (12 días). En estos ensayos, PFT-μ se retiró después del cultivo inicial de 2 días debido a que la presencia continua de PFT-μ, incluso a la dosis relativamente baja utilizada para el ensayo de viabilidad celular a corto plazo, era demasiado alta para permitir que las colonias a la forma. Suponemos que el ensayo de colonias de la formación y el largo plazo (12 días) ensayo de viabilidad celular son útiles para probar los efectos a largo plazo sobre las células cancerosas después de la terapia contra el cáncer transitoria.
A pesar de que la quercetina es una conocido inhibidor de la HSP [31], este fármaco no se ha utilizado clínicamente ya que se necesitan dosis relativamente altas para provocar efectos antitumorales
in vivo
. Se compararon los efectos antitumorales de la quercetina y la PFT-μ y encontramos que PFT-μ puede inducir el efecto antitumoral incluso a una décima parte de la dosis de quercetina (Fig. 2A).