Extracto
Mientras que la inhibición farmacológica de la quinasa Akt ha sido considerada como una estrategia prometedora contra el cáncer, la mayoría de los inhibidores de Akt que se han desarrollado son inhibidores enzimáticos que se dirigen al sitio activo de la quinasa de Akt. Otro evento de regulación celular clave para la activación de Akt es la translocación de Akt quinasa a la membrana celular del citoplasma, que se logra a través del dominio de homología de pleckstrin (PH) de Akt. Sin embargo, los compuestos que interactúan específicamente con el dominio PH de Akt para inhibir la activación de Akt se limita en la actualidad. Aquí hemos identificado un compuesto, lancemaside A (LAN-A), que se une específicamente al dominio PH de Akt quinasa. En primer lugar, el análisis de espectros de masa de quinasa Akt celular aislado de células tratadas con LAN-A reveló que LAN-A se une específicamente al dominio PH de Akt quinasa celular. En segundo lugar, se observó que LAN-A inhibe la translocación de Akt quinasa a la membrana y la activación de Akt por lo tanto, como se examinó mediante la fosforilación de varios objetivos de abajo Akt como GSK3, mTOR y malo. En tercer lugar, en un modelo de células co-cultivado que contiene las células humanas de cáncer epitelial de pulmón (A549) y fibroblastos de pulmón primarios humanos normales, LAN-A restringe específicamente el crecimiento de las células A549. LAN-A también muestra efectos antiproliferativos en varias líneas celulares de cáncer humano. Finalmente, en el modelo de trasplante de ratón A549-luciferasa, LAN-A crecimiento de las células A549 inhibe eficazmente con poca citotoxicidad evidente. De hecho, el índice terapéutico de LAN-A en este modelo de ratón era & gt; 250, apoyando dicha LAN-A es un compuesto de plomo potencial de dominio PH focalización como un inhibidor de Akt contra el cáncer segura
Visto: Joh. EH, Hollenbaugh JA, Kim B, Kim DH (2012) Pleckstrin homología del dominio quinasa de Akt: una prueba de principio para no enzimática contra el cáncer objetivo muy específico y eficaz. PLoS ONE 7 (11): e50424. doi: 10.1371 /journal.pone.0050424
Editor: P. Jin Cheng, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Julio, 2012; Aceptado: 23 de octubre de 2012; Publicado: 26 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Joh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud A1077401 (BK), Institutos nacionales de Salud de subvención T32 DA07232 (JAH), y el Programa de la Universidad de clase mundial a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología ( R33-2008-000-10018-0). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar que Baek Kim es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE, sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Un fenotipo supervivencia celular a largo plazo se establece por la detección de diversos eventos celulares , y los mecanismos implicados en el reconocimiento y la entrega de las señales de estrés están muy conservadas entre las células de mamíferos. La vía PI3K /Akt es una red de regulación central que regula los acontecimientos celulares esenciales para la transcripción, la supervivencia celular [1], el crecimiento [2], la diferenciación [3], la migración [4], el metabolismo de [5], y la angiogénesis [6] . La desregulación de la vía PI3K /Akt se observa con frecuencia en muchos cánceres humanos, lo que permite la supervivencia y el crecimiento a largo plazo [7], [8], [9]. Por lo tanto, los inhibidores farmacológicos dirigidos esta vía pro-supervivencia han sido ampliamente investigados como potenciales agentes anti-cáncer [10]. Desde Akt es un regulador central que controla la actividad de numerosas objetivos de abajo a través de su actividad de quinasa, inhibidores de Akt han sido el foco de varios estudios [10], [11], [12]. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de Akt que se han probado están orientados principalmente a la zona activa la quinasa o sitio de unión del ATP de Akt [13], [14], [15], [16] y exhiben potenciales no deseados fuera de objetivo efectos de otros numerosos celular quinasas.
Es importante destacar que, para Akt quinasa se active, la proteína tiene que migrar desde el citoplasma a la membrana celular donde el NH
2-terminal de homología pleckstrin (PH) de dominio de Akt interactúa con PI3K. Una vez en la membrana plasmática, la quinasa 3-phosphoinositide dependiente constitutivamente activa 1 (PDK1), una quinasa aguas arriba, activa Akt por fosforilación en Thr
308 seguido de una fosforilación adicional en Ser
473, que puede ocurrir por mTOR -rictor complejo [17], proteína quinasa Cβ [18], la integrina ligada quinasa [19] y por la autofosforilación [20]. El dominio PH puede encontrarse en varias proteínas de señalización intracelular y es necesario para viajar a los distintos compartimentos de la membrana celular [21]. Este dominio también facilita la formación de dímero que permite la función de unión a lípidos que reconoce específicamente fosfoinosítidos fosforilados [22]. Durante la activación de PI3K /Akt, PIP2 se fosforila a PIP3 por PI3K, y entonces la concentración de membrana PIP3 elevada inicia la activación de PDK1 seguida de la translocación de membrana de Akt y la activación de la actividad quinasa Akt [22].
Varios modelos celulares de cáncer y las células que expresan oncogenes, que exhiben un fenotipo citoprotector través de la activación de la vía PI3K /Akt, se han usado como sistemas de cribado de posibles inhibidores de Akt [23], [24], [25]. Hemos establecido recientemente un sistema de cribado de inhibidores anti-PI3K /Akt basado en células única [26], que emplea la expresión del virus de la inmunodeficiencia humana no oncogénico (VIH-1) Tat. A diferencia de otros oncogenes virales tales como E1A de papilomavirus humano [27], Tax del virus de la leucemia de células T humano [28] y NS5A de virus de la hepatitis C [29], el VIH-1 Tat no activa directamente la ruta de Akt. En cambio, parece regular negativamente PTEN, que es una fosfatasa que controla negativamente PI3K mediante la reducción de la concentración de PIP3 en la membrana celular [30]. Debido a la actividad de regulación negativa PTEN, Tat expresión en una línea celular humana microglial (CHME5) confiere un fenotipo elevada protección celular durante el tratamiento citotóxico LPS [31]. Este fenotipo citoprotector del sistema CHME5 basada en Tat fue utilizado recientemente para la detección e identificó compuestos anti-PI3K /Akt que abolieron el fenotipo citoprotector inducida por Tat [26]. Más interesante, estos compuestos dirigidos diferentes etapas de la ruta PI3K /Akt, la validación de la capacidad de cribado Akt PI3K /inhibidor de la vía del sistema [26].
Aquí, hemos caracterizado lancemaside A (LAN-A), que compuestos no tóxicos preseleccionado fue uno de varios compuestos identificados previamente por el sistema CHME5 expresar Tat de las bibliotecas que albergan [26]. En este estudio, LAN-A se investigó por su mecanismo de acción anti-Akt, selectiva efecto anti-cáncer
in vitro
, y efecto anti-cáncer en un modelo de ratón. De hecho, LAN-A se une únicamente al dominio PH de la quinasa Akt celular, inhibe la translocación de Akt quinasa, que es esencial para la activación de Akt, y muestra anti-proliferación /efectos anti-cáncer en un modelo de ratón con un gran índice terapéutico que resultados de la naturaleza no tóxica de este compuesto
Materiales y Métodos
cultura línea celular de cáncer y la medición de la citotoxicidad
el A549 (carcinoma de pulmón humano; KCLB Nº. 10185), KATO III (carcinoma gástrico; KCLB Nº 30103), MCF-7, (carcinoma de mama; KCLB Nº 30022) fueron adquiridos de la orilla línea celular de Corea (Seúl, Corea) en 2010-11-25. La línea celular A549-luc-c8 se adquirió de Caliper Lifescience (Hopkinton, MA, EE.UU.) en 2011-04-20. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero inactivado por calor al 10% de ternera fetal, 2 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM en un humidificado 5% CO
2 atmósfera a 37 ° C. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo, 24 h antes de la adición de compuestos. Los compuestos se solubilizan en 100% de etanol y después se añadió a las concentraciones indicadas. Después de 24 h de incubación, se evaluaron las células muertas usando FACS citometría (flujo Accuri C6 citómetro, Accuri). Los estudios se realizaron por triplicado.
Co-cultivo de células tumorales primarias y
Para la cultura diferentes pares de tipos de células, la media del tipo de célula primaria, no la línea celular tumoral, fue usado. Para co-cultivo de fibroblastos de pulmón humano y el epitelial de pulmón línea de células tumorales A549-luc-c8, las células se cultivaron en medio esencial mínimo (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 10%. Las imágenes fueron tomadas a las 0, 6, 12 y 24 h post-tratamiento usando un microscopio de fluorescencia (Zeiss).
inmunotransferencia análisis
Los extractos de sobrenadante de células preparados a partir de los macrófagos fueron separados por SDS 10% -PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con 5% no grasos de proteínas de leche en polvo en PBST 0,05%, a continuación, se sondaron con anticuerpos. Después de lavar con PBST, se detectaron las proteínas con anticuerpos secundarios conjugados con HRP de 50 min. Las bandas se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia reactivo (ECL).
Análisis de Lancemaside A y Akt unión usando MS /MS
células A549-luc-c8 se cultivaron en placas de 6 pocillos en medio RPMI 1640 medio con o sin lancemaside a para 2 h. Las células se lisaron con 300 l de tampón de lisis por placa de cultivo de 100 mm. Los lisados (3 ml) se complementaron con 9 ml de tampón NET [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, y 0,05% NP-40] y se incubaron durante la noche a 4 ° C con 10 l de Akt o anticuerpo β-actina (200 g /ml). Para precipitar complejos inmunes, los lisados se incubaron con 50 l de proteína A /G PLUS-agarosa (Santa Cruz, L. A., EE.UU.) durante 1 hora a 4 ° C. complejos unidos-Bead se lavaron tres veces con tampón NET frío y se desnaturalizó durante 5 min a 100 ° C, se centrifugaron y se detectaron usando el sistema de MS /MS como se describe anteriormente [32]. Ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) y tándem MS /MS Se realizaron análisis en un LCQ DECA XP MS (Thermo Finnigan, CA, EE.UU.) equipado con una fuente de electropulverización de iones. Todos los parámetros del analizador de trampa de iones se optimizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En experimentos en masa, el voltaje de pulverización fue de 4,5 kV en modo positivo y 4 kV en modo negativo con el N flujo de gas
2 vaina en 50 unidades arbitrarias. La temperatura del capilar se mantuvo a 275 ° C. Dos microlitros de las muestras se inyectaron en la columna. Se obtuvieron cromatogramas de iones totales de los
m /z
150 a 2000, de modo negativo ESI. Para la espectrometría de masas en tándem, el tiempo máximo de inyección de iones, el tiempo de activación, y la anchura de iones aislados se establece en 500 ms, 30 ms y 2.0 J, respectivamente. La energía de colisión con helio se fijó a 30% de la frecuencia de radio (5 V) aplicada al analizador de trampa de iones.
La actividad anti-tumor en el modelo de xenoinjerto de tumor de ratón desnudo
A549- se recogieron las células luc-c8, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato, y se inyecta por vía subcutánea en la pierna izquierda (10
6 células /pierna) de 8 semanas de edad ratones desnudos femeninos como se informó anteriormente [33]. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50 mm
3, los animales fueron asignados al azar y oralmente dosificados con 5, 10 y 20 mg /kg /día lancemaside A o vehículo (0,2 ml de 10% de TWEEN 80) 6 días a la semana. Cada grupo constaba de 9 ratones. Lancemaside A se suspendió en 10% de TWEEN 80. Los tamaños de los tumores se midieron cada 3-4 días después de alcanzar 50 mm
3. Por último, se inyecta por vía intraperitoneal reactivo luciferina (150 mg /kg, Caliper Lifescience) después de la administración final de lancemaside A y tamaños de los tumores medidos por
in vivo
de imágenes de luminiscencia.
In vivo
de imágenes de luminiscencia se llevó a cabo mediante Maestro En Vivo sistema multiespectral de imágenes (Woburn, MA, EE.UU.). Los datos se cuantificaron con el software Maestro (versión 2.10.0, CRI Inc.) mediante el uso de recuentos de fotones absolutos.
células A549 humanas transfectadas con vectores GFP PH-GFP o
El A549-LUC- c8 células fueron transfectadas con GFP-PH o vector GFP y se cultivaron en placas de 6 pocillos en medio RPMI 1640 con o sin lancemaside Un (1 mM) durante 100 min. Las células se lisaron con 300 l de tampón de lisis por pocillo. Los lisados se complementaron con 5 ml de tampón NET [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, y 0,05% NP-40] y se incubaron durante la noche a 4 ° C con 10 l de anticuerpo GFP (200 g /ml). Para precipitar complejos inmunes, los lisados se incubaron con 50 l de proteína A /G PLUS-agarosa (Santa Cruz, L. A., EE.UU.) durante 1 hora a 4 ° C. complejos unidos-Bead se lavaron tres veces con tampón NET frío y se desnaturalizó durante 10 min a 100 ° C antes de ser centrifugada para eliminar los residuos. Los sobrenadantes se evaporaron a sequedad y se volvieron a suspender en 50 l de MeOH.
Resultados
previamente habían identificado LAN-A como una vía anti-PI3K /Akt inhibidor usando una línea celular que expresa Tat del VIH CHME5 [26]. Nosotros, en primer lugar, examinó la capacidad de LAN-A para inhibir esta vía en varias células tumorales diferentes. Como se muestra en la figura 1A, las concentraciones crecientes de LAN-A supervivencia celular reducida en A549 (células epiteliales adenocarcinoma), KATO III (células de carcinoma gástrico) y células de una manera dependiente de la dosis MCF-7 (células de carcinoma de mama), que conduce a diferencias significativas en comparación con las células control (no tratadas) con tan poco como 2 M de fármaco. En 20 mM LAN-A, la concentración más alta utilizada, no se detectó reducción de más del 60% en la viabilidad de las tres líneas celulares. Además, el análisis de transferencia Western confirmó la reducción de los niveles pAKT para las tres líneas celulares (Figura S1). También se utilizaron las células A549-Luc-c8 para este estudio y se confirmó que LAN-A tratamiento también causó una reducción comparable en la viabilidad celular (Figura 1B). células A549 tienen una morfología redonda como se muestra en los paneles inferiores Figura 1B, que es una consideración importante cuando el examen de los experimentos de co-cultivo (abajo).
fueron tratados A549, KATO III y células (A) MCF-7 durante 24 h en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de LAN-a. Después del tratamiento, se recogieron las células y las células vivas se determinó por análisis FACS. (B) células A549-luc-C8 fueron tratadas con 5 y 10 mM LAN-A durante 24 h. Las imágenes muestran menos monocapa confluente de células con LAN-Un tratamiento. Se determinó la viabilidad celular y valores relativos representa como comparación con la de las células de control (100%). El análisis ANOVA se realizó en conjuntos de datos, y las diferencias estadísticamente significativas con el grupo de control se indican con asteriscos (* =
p Hotel & lt; 0,05).
A fin de validar LAN-A como un inhibidor de PI3K Akt /ruta en células A549, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western para el estado de fosforilación de diversos objetivos de abajo: PDK1, Akt, PTEN, GSK3, IKK-alfa, mTOR y proteínas BAD. Como se muestra en la Figura 2A-E (y la Figura S2), la fosforilación de Akt y objetivos de abajo de Akt quinasa: p-GSK3, p-mTOR, p-BAD y p-IKK-α se redujeron significativamente en una manera dependiente de la dosis con LAN -Un tratamiento. Sin embargo, LAN-Un tratamiento no dio lugar a la reducción en los niveles celulares de PTEN (Figura 2F), p-PDK1 (Figura 2G) o PI3K (Figura 2H). Por otra parte, LAN-A reduce la actividad de PI3K en células A549 (Figura S3) y el tráfico de Akt inhibe a la membrana plasmática (Figura S4). Estos resultados son consistentes con nuestros hallazgos publicados [26] que LAN-A es un /Akt inhibidor de la vía PI3K.
células A549 (A) se dejaron sin tratar o tratados con 5, 10 o 20 mM LAN-A para 24 h. El análisis de transferencia Western se llevó a cabo sobre lisados de células (Figura 2) y se indica una reducción de la Akt fosforilada (Ser
473). se muestra (B-E) Análisis de Akt objetivos de abajo. Los niveles de fosforilación de GSK3, IKK-α, mTOR y malas fueron examinados y se reducen en los grupos tratados LAN-a. (F) PTEN celular se mantuvo constante con LAN-Un tratamiento. nivel (G) fosfo-PDK1 se mantuvo sin cambios en LAN-Un tratamiento. (H) Nivel de PI3K se mantuvo sin cambios en LAN-Un tratamiento. Los conjuntos de datos se realizaron por duplicado. El análisis ANOVA se realizó en los conjuntos de datos con * =
p Hotel & lt; 0,05, ** =
p Hotel & lt; 0,01 y *** =
p Hotel & lt; 0,001 .
a continuación, hemos probado si la LAN-a efecto citotóxico era específica para las células tumorales. Para esta prueba, co-cultivadas 1) MRC-5, un fibroblasto fetal primario de pulmón humano [34], y 2) A549-luc-C8, células epiteliales basales alveolares de adenocarcinoma humano transducidas para expresar luciferasa [35], en diferentes concentraciones de LAN-a durante 12 h (Figura 3A, arriba). Células MRC-5 se mantuvieron viables durante el intervalo de dosis de LAN-A de tratamiento (Figura 3A; gráfico inferior), mientras que las células A549-luc-c8 muestran la muerte significativa a las 10 y 20 mM. Un análisis cinético utilizando 10 mM LAN-A de tratamiento a las 0, 6, 12 y 24 h también se llevó a cabo (Figura 3B, la parte superior). Una vez más, las células A549-luc-c8 fueron significativamente más susceptibles a la muerte celular en comparación con células MRC-5 (Figura 3B, gráfico inferior). Incluso después de 24 h de LAN-Un tratamiento, células MRC-5 se mantuvieron viables, aunque la viabilidad celular A549-luc-c8 siguió disminuyendo. En conjunto, estos datos sugieren que LAN-A muestra un efecto anti-cáncer específico en el modelo de co-cultivo celular normal y el cáncer de pulmón humano.
(A) Imágenes representativas de los diferentes grupos de tratamiento fueron capturados 12 h post tratamiento. (B) Las imágenes de tres experimentos independientes se contaron manualmente para las células vivas /muertas para los diferentes grupos de tratamiento. Los datos se representaron gráficamente y muestra el porcentaje de células vivas. prueba de la t de Student se realizó sobre los conjuntos de datos para determinar diferencias significativas (* =
p Hotel & lt; 0,05). (C-D) células co-cultivadas se expusieron a 10 mM LAN-A y se controlará su muerte celular en diferentes momentos después del tratamiento. Se determinó la muerte de la célula como se describe anteriormente. Los datos proceden de tres experimentos independientes.
A continuación, se investigó el mecanismo de acción de LAN-A empleando una serie de tecnologías de espectros de masa. Para esto, las células A549 se pre-incubaron con LAN-A antes de la lisis de e inmunoprecipitación (IP) de Akt. Pull-downs se analizaron mediante análisis espectral de masas. La Figura 4A muestra el análisis ESI-MS de LAN-A (estándar). La estructura del compuesto se representa y se proporciona un perfil de rastreo con LAN-A en 1190 MW. Una muestra de Akt IP para las células A549 tratadas LAN-A fue analizado (Figura 4C), y mostró un pico de LAN-A. Es importante destacar que las muestras de control, sin LAN-Un tratamiento de células A549 (Figura 4B) e IP β-actina con LAN-Un tratamiento (Figura 4D), no mostraron picos de LAN-A interacción. A continuación, para validar aún más que LAN-A interactuó con Akt, se llevó a cabo conjuntamente el análisis MS /MS. Anteriormente desarrolló un análisis sensible HPLC-MS /MS para LAN-A (MW 1190) y sus derivados metabólicos, lancemaside X (MW 648) y ácido echinocystic (MW 472) [32]. El perfil de huella estándar de LAN-A sólo se muestra en la Figura 4E, mientras que la muestra IP Akt muestra claramente los dos fragmentos - MW 648 MW y 472 (Figura 4F). Estos datos muestran claramente que LAN-A interacciona físicamente con Akt dentro de la célula.
(A) de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) de LAN-A estándar que se muestra. LAN-A molecular se muestra a residir en el MW 1190. El análisis ESI-MS de las muestras sin tratar de IP Akt (B) LAN-A tratada se muestran las células (C) A549. se muestra (D) el análisis ESI-MS de IP β-actina de las células tratadas LAN-a. (E) Análisis de Tandem MS /MS de LAN-A muestra los dos fragmentos previamente identificados Lancemaside X (MW 648) y ácido echinocystic (MW 472) para LAN-A [32]. (F) Análisis tándem MS /MS para la muestra IP Akt de las células tratadas LAN-a.
Hemos descrito previamente que LAN-A inhibe la translocación de Akt desde el citosol a la membrana plasmática ([26 ]; la figura S4). Por lo tanto, postulamos que LAN-A interactúa directamente con el dominio PH de Akt. Para probar esto, vectores de fusión GFP y PH de dominio-GFP se transfectaron en células A549, seguida por IP de GFP. Las muestras se procesaron a continuación para y se analizaron usando HPLC-MS /MS [32]. La muestra IP GFP (Figura 5A) produjo muchos picos, pero ninguno fue específico para LAN-A (Figura 5B; estándar). Sin embargo, el análisis MS /MS de IP muestra PH-GFP producido los picos derivados correcta de metabolitos (MW 648 MW y 472) para LAN-A (véase también la Figura 4E y F). Por lo tanto, estos datos de los espectros de masas apoyan un modelo en el que LAN-A interactúa directamente con el dominio PH de Akt, que restringe la migración de Akt y posteriormente inhibe la activación de Akt.
GFP y PH vectores de dominio-GFP se transfectaron en A549- células luc-C8 y las células fueron tratadas con 100 mM LAN-a durante 1 h. IP frente a GFP estaba hecho y las muestras se analizaron mediante ESI-MS. muestra (A) GFP IP no mostró ningún pico prominente para LAN-A, (B), mientras que la muestra de dominio PH IP-GFP tenía el pico específico para LAN-A. (C) Para confirmar aún más esta era de LAN-A, el análisis tándem MS /MS de la muestra de dominio PH-GFP IP mostró dos fragmentos de LAN-A (véase también la Figura 4E y F).
por último, hemos probado el efecto de LAN-a sobre el crecimiento A549-luc-c8 en un modelo de ratón desnudo. Para esta prueba, se inyectaron células A549-luc-c8 en la pierna izquierda de ratones desnudos para establecer tumores. Una vez que el tumor alcanzó 50 mm
3, los ratones se asignaron al azar y se trataron por vía oral con 10 y 20 mg /kg /día lancemaside A o vehículo (10% de TWEEN 80) 6 días a la semana. LAN-A tiene un ED
50 = 4,09 mg /kg y LD
50 = & gt; 1 g /kg. Por lo tanto, el índice terapéutico es & gt; 250 (datos no mostrados). Los tumores se miden a partir de día 10 a 45. LAN-A reducida tasa de crecimiento del tumor de tratamiento tal como se representa por los volúmenes tumorales reducidos en comparación con el grupo de control (Figura 6A). En el día 45, los ratones fueron inyectados IP con el reactivo luciferina para
in vivo
de imágenes (Figura 6B).
In vivo
luminiscencia es mayor para el grupo de control en comparación con cualquiera de los grupos 10 o 20 mg /kg LAN-a. Se muestran las intensidades relativas de luminiscencia (
n
= 5). Los ratones se sacrificaron y los tumores eliminados. volúmenes relativos se determinaron y se representaron gráficamente (
n
= 9) para la masa tumoral (Figura 6C). Los tumores fueron teñidas con anti-pAkt y DAPI (Figura S5) y se muestran a-A LAN reducción dependiente de la concentración de pAkt dentro del tejido tumoral. En general, llegamos a la conclusión de que LAN-A tiene un efecto anti-tumoral
in vivo
.
Los volúmenes tumorales (A) se miden a partir de los días 10-45 en ratones desnudos tratados con control (CON) y 10 o 20 mg /kg /día LAN-A (9 ratones /grupo). (B) En el día 45, los ratones fueron inyectados con el reactivo luciferina de imágenes en vivo de luminiscencia. Las intensidades relativas para 5 ratones /grupo se muestran, y la intensidad relativa se indicó en comparación con la del control (control = 1). (C) los ratones fueron sacrificados y los tumores eliminado. Los tumores se midieron por el maestro
En Vivo
sistema multiespectral y volumen relativo trazan. El análisis ANOVA se realizó en conjuntos de datos, y las diferencias estadísticamente significativas del grupo de control se indican con asteriscos (* =
p Hotel & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
Anteriormente, hemos examinado potenciales agentes anti-cáncer, que presentaban citotoxicidad mínima y alta abundancia natural, mediante el empleo de la fuerte fenotipo citoprotector inducida por la expresión de la proteína Tat del VIH-1 [26], que se observó en ambos macrófagos humanos primarios y una línea humana de células microglia [30], [31]. Entre los compuestos seleccionados, el tratamiento con LAN-A abolió el fenotipo citoprotector inducida por Tat de las células después del tratamiento CHME5 LPS /CHX, mientras que LAN-A solo no indujo ninguna muerte celular en las células de control que no expresan CHME5 Tat [26]. LAN-A pertenece a la familia química llamada saponinas, que son conocidos por presentar propiedades anti-inflamatorias y anti-tumorales [33], [36], [37], [38]. LAN-A se ha demostrado que inhibe de forma potente la colitis través de la activación de NF-kB ligado por TLR en ratones sin citotoxicidad detectable [39], [40].
En este estudio caracterizamos aún más el efecto anticancerígeno de LAN-A. experimentos de co-cultivo utilizando A549 y células MRC-5 muestran que LAN-A inhibe específicamente la línea celular de tumor y no células primarias. Este fue un resultado muy emocionante y sugerido que LAN-A tuvo un efecto específico de las células cancerosas. Se demuestra que el tratamiento de células con LAN-A conduce a una reducción en la fosforilación de Akt, sin embargo, p-PDK1, que se requiere para Thr
308 fosforilación, y los niveles totales de PDK1 no fueron influenciados por LAN-A de tratamiento. Por otra parte, abajo objetivos, incluyendo p-GSK3, p-mTOR, p-BAD y p-IKK-α se redujeron, mientras que los niveles de PTEN y PI3K se mantuvo sin cambios (Figura 2). En conjunto, estos datos apoyan nuestros hallazgos previos de que LAN-A inhibe la activación de Akt [26].
Se han descrito varios mecanismos diferentes para la inhibición de Akt. En primer lugar, las drogas como la wortmanina, LY294002, PWT-458 [41] y PX-866 [42], [43], SF-1126 [44], IC87114 y TGX-115 [45] se dirigen el efector PI3K aguas arriba, la inhibición de la generación de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, que activa PDK1 que conduce a la fosforilación de Akt y de activación. Otros fármacos tienen doble orientación de PI3K y mTORC2, incluyendo NVP-BEZ235 [46]. Varios se han desarrollado medicamentos que la actividad de PDK1 objetivo. A diferencia de PI3K, que tiene varias isoformas, PDK1 tiene sólo una única isoforma en los seres humanos, por lo que es un objetivo atractivo para la inhibición. UCN-01 es uno de estos fármacos en desarrollo [47]. La segunda fosforilación de Akt en Ser
473 es catalizada por mTORC2 [48] y puede ser inhibida por la rapamicina, temsirolimus, everolimus y deforolimus [49].
Akt tiene tres isoformas diferentes y varios grupos diferentes de Akt inhibidores se han desarrollado. Un grupo de inhibidores de: GDC-0068 (Genetech; [50]) y Akt Inhibitor IV (Millipore) se orienta al sitio activo ATP de Akt [51]. Un segundo grupo de los inhibidores de la diana del dominio PH, lo que lleva a una alteración de dirección de membrana [52], [53]. Akt-I-1/2 son inhibidor alostérico reversible sintético, que tienen como objetivo el dominio PH de retención en un estado inactivo [54]. Perifosine es otra droga dominio PH de orientación e inhibe Akt, mTORC1 y mTORC2 [55].
Para determinar la especificidad de LAN-A, desarrollado previamente un análisis de HPLC-MS /MS específica para LAN-A [32 ]. Utilizando esta tecnología, se determinó que LAN-A interactúa directamente con Akt a través del dominio PH (Figura 5). Nosotros previamente hemos examinado la dosificación oral de ratones con LAN-A y se encontró que la flora intestinal convierte LAN-A en lancemaside X y luego en ácido echinocystic, que puede ser absorbido en la sangre [32]. Podemos postular a partir de nuestros datos que el ácido echinocystic puede ser el mínimo metabolito estructura de LAN-A se requiere para la unión de dominio PH y la inhibición de quinasa Akt. Tanto lancemaside X y ácido echinocystic se examinarán para su eficacia terapéutica en el futuro. Por otra parte, nuestro
in vivo
datos del ratón es consistente con los resultados de Jo
et al.
[53], lo que demuestra que la orientación del dominio PH de Akt quinasa es muy eficaz para reducir el crecimiento del tumor.
ha habido una amplia investigación para descubrir inhibidores de la vía PI3K /Akt /mTORC2 [56], [57]. Muchos de los nuevos fármacos tienen que hacer frente a la toxicidad al tiempo que proporciona eficacia terapéutica. LAN-A proporciona una baja toxicidad y la inhibición de crecimiento del tumor in vivo. En conjunto, nuestro estudio confirma mediante análisis espectral de masas que LAN-A se dirige al dominio PH de Akt y proporciona un enfoque válido para la investigación continúa en este fármaco contra el cáncer.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Western blot de A549, KATO III y células MCF-7. (A) Se muestran transferencias de Western representativos de sondeo para pAkt y Akt total, con y sin 10 mM de LAN-A. (B) Los datos de dos experimentos independientes se graficó. Se utilizó el análisis de ANOVA para determinar las diferencias significativas y se indican con asteriscos (*** =
p Hotel & lt; 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s001 gratis (TIF)
figura S2.
análisis de transferencia de Western. Este es un material compuesto por una o dos análisis de Western Blots utilizado para generar los datos para la Figura 2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0050424.s002
(TIF)
Figura S3.
ensayo PIP3. Las células A549 se trataron previamente con el lancemaside A (Lan, 20 mM) o wortmanina (W, 0,1 M) durante 20 minutos. Luego, las células se trataron con LPS para una adicionalmente 60 min. Los lisados se prepararon utilizando un kit de extracción de proteínas compartimental (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) a partir de un número igual de las células tratadas. Los lisados extracto de membrana se analizaron mediante análisis de transferencia puntual occidental (Echelon, San Jose, CA, EE.UU.) y se visualizaron con anticuerpos anti-PIP3
doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s003 gratis (TIF)
Figura S4.
Ensayo de Akt translocación de membrana. Hemos expresado una proteína GFP fusionada al dominio PH-de Akt, que es conocida por la migración de membrana, en las células A549-luc-C8. Cuando las células se transfectaron con un plásmido que expresa la proteína PH-Akt-GFP, se observó esta proteína de fusión a través de las células, pero localizada principalmente en la membrana plasmática. LAN-Un tratamiento muestra la señal de GFP se ha alejado de la membrana plasmática. de campo claro (BF), las imágenes están en la columna de la izquierda. Akt localización de la membrana de plasma se visualizó por el movimiento de Akt-PH-eGFP usando un microscopio de fluorescencia (Zeiss)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s004
(TIF)
Figura S5.
Inmunohistoquímica de pAKT dentro del tumor. Inmunolocalización de pAkt se analizó utilizando un procedimiento de tinción en dos etapas que consiste en la incubación secuencial con anticuerpos primarios y secundarios y con DAPI. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia (Zeiss)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s005 gratis (TIF)