Extracto
El papel de la proliferación de peroxisomas ratones desnudos - gen activado δ receptor-(PPAR δ) en carcinogénesis de colon sigue siendo muy controvertida. Aquí, establecimos ratones desnudos modelo de xenoinjerto de cáncer de colon usando un KM12C línea celular humana, ya sea con PPAR δ silenciada o normal. Los xenoinjertos en grupo silenciado-δ PPAR crecieron significativamente más grande y más pesado con menos diferenciación, promovido la proliferación celular, aumento de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el índice de apoptosis similar en comparación con los del grupo PPAR δ-normal. Después tratado con el inhibidor específico bevacizumab VEGF, las capacidades de crecimiento y proliferación de xenoinjertos se redujeron en ambos grupos mientras que todavía significativamente mayor en PPAR grupo δ silenciado-que en el grupo PPAR δ-normal. La administración de agonista de PPAR δ disminuyó significativamente la expresión de VEGF en las células KM12C PPAR δ-normales, pero no en las células silenciadas-δ PPAR. Estos hallazgos demuestran que, desmontables de PPAR δ promueve el crecimiento de cáncer de colon mediante la inducción de la diferenciación menos, la aceleración de la expresión proliferación y VEGF de las células tumorales in vivo, y reduce la sensibilidad del tumor a bevacizumab. Este estudio indica que PPAR δ atenúa la carcinogénesis de colon
Visto:. Yang L, Zhou J, Ma Q, C Wang, Chen K, Meng W, et al. (2013) Derribo de genes PPAR δ promueve el crecimiento de cáncer de colon y reduce la sensibilidad de Bevacizumab en ratones modelo desnuda. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10.1371 /journal.pone.0060715
Editor: Alan P. Campos, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2012; Aceptado: March 2, 2013; Publicado: 8 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo beca de la Fundación de Ciencias Naturales de China (N ° 30801332; http://www.nsfc.gov.cn/), Ph.D. Programas de la Fundación de Ministerio de Educación de China (Nº 200806100058; http://www.chinapostdoctor.org.cn/), y la Fundación de Cáncer de Suecia (http://www.cancerfonden.se/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proliferador de peroxisoma - receptor activado-δ (PPAR δ), un miembro de la familia del receptor nuclear activado por ligandos PPAR [1], se expresa de forma ubicua en la mayoría de los tejidos y altamente expresado en el epitelio, en particular la piel y el intestino [2], [3]. Similares a otros receptores de hormonas nucleares, PPAR δ heterodimerizes con receptor de retinoide X y ejerce sus efectos a través de la regulación de la transcripción de genes tras la unión del ligando [4]. El papel mejor caracterizado para PPAR δ hasta la fecha es la de regular el metabolismo de lípidos y la homeostasis de energía, tal como la inducción de transporte inverso del colesterol, elevación de lipoproteínas de alta densidad, el aumento de la oxidación de ácidos grasos y la energía desacoplamiento [5], [6]. Además, PPAR δ también está implicada en la implantación del embrión, la curación de heridas, respuesta inflamatoria, proliferación de células endoteliales, la angiogénesis, el cáncer de piel y la carcinogénesis colorrectal [7], [8].
En contraste con el bien caracterizado funciones de PPAR δ en metabólica y la homeostasis energética, el papel de PPAR δ en la carcinogénesis colorrectal sigue siendo incierto. Algunos estudios proporcionan evidencias de que PPAR δ promueve la tumorigénesis, mientras que otros dan resultados contradictorios, ya que hemos revisado anteriormente [9]. Estos resultados inconsistentes dictan la necesidad de examinar más a fondo la función de PPAR δ en la patogénesis del cáncer colorrectal. Recientemente, hemos establecido con éxito modelos de PPAR δ-desmontables de líneas celulares de cáncer de colon (KM12C etc.) por ARN lentivirus mediada por interferencia (ARNi) [10]. Se encontró que el PPAR δ knockdown indujo significativamente menos diferenciación y la proliferación de estas células promovido [9], [10]. Estos hallazgos indican que PPAR δ puede jugar un papel supresor de tumor, facilitando la diferenciación y la inhibición de la proliferación de cáncer de colon. Sin embargo, todavía carece de experimentos in vivo para atestiguar estos hallazgos in vitro. Para definir con mayor rigor el papel de PPAR δ de la carcinogénesis colorrectal, se analizó el efecto de la caída de PPAR δ en los xenoinjertos de ratones desnudos establecidos con células KM12C en el presente estudio.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares
El cáncer de colon línea celular humana KM12C (profesor de IJ Fidler, Anderson Cancer Center, TX), no tratada o tratada por la RNA lentivirus mediada por interferencia (RNAi) contra el gen PPAR δ de nuestro estudio anterior [10], fueron usados. Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) con sales de Earle, aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) l-glutamina y, suplementado con 1,5% de NaHCO3, 1 mm Na-piruvato (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 × solución de vitamina MEM (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), 1 mg /ml puromicina (sólo para las células tratadas para mantener la pureza) y suero bovino fetal al 10% (Invitrogen). La expresión de PPAR delta han sido establemente silenciado en las células tratadas por RNAi lentivirus mediada como se examinó en nuestro estudio anterior [10].
Establecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos
cuarenta y ocho ratones desnudos hembra de seis semanas de edad se obtuvieron de la Universidad Laboratorio Animal Center Sichuan (Chengdu, china). Los ratones se mantuvieron durante 7 días en una unidad de cuidado de los animales convencional antes del inicio del estudio.
Los ratones fueron anestesiados por inyección intra-peritoneal de pentobarbital (65 mg /kg, Catálogo No.p3636, Sigma-Aldrich, Suecia). Las células KM12C ya sea de forma estable con silenciado PPAR δ o sin tratar a continuación se inyectaron por vía subcutánea (2 × 10
6 células /ratón en 100 l de PBS) en el flanco derecho de cada ratón (24 ratones por grupo). Veinticuatro horas después de la inoculación, doce ratones seleccionados al azar de cada grupo fueron inyectados con bevacizumab (Avastin ™, Genentech, CA) a través de vena de la cola a 5 mg /kg de peso corporal. El crecimiento del tumor se controló a intervalos regulares mediante la medición de dos diámetros de los tumores utilizando calibradores electrónicos. El volumen del tumor se calculó con la siguiente fórmula: (longitud x anchura
2) /2. Los ratones se sacrificaron 25 días después de la inoculación, y los tumores se fijaron en 10% de formalina neutral. Los procedimientos fueron operados de forma ciega por un investigador (L. Yang) sin el conocimiento de agrupar la información
Declaración de Ética:. El manejo de los animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el aprobado por el Comité de Ética Animal Experimental de la Universidad de Sichuan. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
hematoxilina y eosina (HE) La tinción
Los xenoinjertos de ratones fueron incorporados regularmente en parafina y luego seccionaron a un espesor de 5 micras. Las secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en etanol, se enjuagaron en agua destilada, y después se fijaron con formaldehído al 4%, se tiñeron con hematoxilina y eosina Ehrlich (Sigma-Aldrich), seguido de la deshidratación en alcohol graduado. Los portaobjetos se montaron y se analizaron bajo microscopio de luz.
Ensayo inmunohistoquímica (IHC)
Los immunostaings se realizaron en 5 micras secciones incluidas en parafina como se informó anteriormente [9]. Los anticuerpos primarios fueron policlonal de conejo anti-PPAR δ IgG (ARP37889, Aviva Biología de Sistemas, CA), anti-Ki67 Ig G (ab15580, Abcam, MA) y mouse monoclonal anti-VEGF IgG (ab68334, Abcam, MA). El sistema Envision Labelled Polymer-HRP anti-conejo (DakoCytomation, CA) fue utilizado como anticuerpo secundario. Secciones conocidos para mostrar tinción positiva para PPAR δ, Ki67 o VEGF se incluyeron en cada ejecución, que recibieron el anticuerpo primario o PBS, como controles positivos o negativos. En todos los procedimientos de tinción, los controles positivos mostraron tinción clara, mientras que no hubo tinción en los controles negativos.
Las diapositivas IHC se examinaron de forma independiente de una manera ciega por dos investigadores (LY y JZ) sin el conocimiento de la agrupación información. Los investigadores se calificó cada sección por la intensidad de la tinción de las células tumorales de la siguiente manera: 0 (tinción negativa), 1 (tinción débil exhibida como de color amarillo claro), 2 (tinción moderada exhibida como marrón amarillo), y 3 (fuerte tinción exhibida como marrón) . Para evitar el efecto artificial, no se contaron las células en los márgenes de las secciones y de las zonas con mala morfología. En los casos en que la puntuación de tinción tuvo resultados discrepantes, se alcanzó una puntuación de consenso después de re-evaluación
apoptosis de las células Detección
El nivel de apoptosis se determinó por desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT). - ensayo mediada dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) utilizando el In Situ Cell Death Detection Kit (Catálogo No. 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las secciones se des-con parafina, rehidratada, permeabilizaron y se equilibraron. Después de la reacción de etiquetado, los resultados se evaluaron usando microscopio de fluorescencia Leica DM IL HC. Total de células se visualizaron a 330-380 nm para la tinción DAPI, y se visualizaron las células apoptóticas a 465-495 nm para la tinción con FITC. Secciones sin la adición de TDT o la recepción de DNasa I se incluyeron en cada ejecución como controles negativos o positivos, respectivamente. Para cada muestra, se seleccionaron al azar cinco campos de alta potencia (x 200), y se contó el número de células apoptóticas en cada campo. índice de apoptosis (AI) = número de células positivas /número de células totales.
en tiempo real con transcripción inversa (RT) PCR
ARN total fue extraído de los tumores utilizando TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Alemania), seguido de la transcripción inversa con alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, CA). Los ARNm que codifican la proteína, relacionada diferenciación de adipocitos-VEGF Ki67 (ADRP), proteína de unión a ácido graso hepático (L-FABP), y la fosfatasa alcalina intestinal (ALPI) se cuantificaron utilizando análisis en tiempo real RT-PCR por detección de verde SYBR. reacción de PCR se realizó en el Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System, utilizando el método comparativo ciclo umbral (Ct) (△△ Ct) como se describe antes [11]. Los cebadores utilizados para cuantificar mRNAs se enumeran en la Tabla 1. La expresión se normalizó a deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), y se utilizó el 1 × mezcla de cebadores GAPDH (Pre-desarrollado ensayo TaqMan Reactivos, Applied Biosystems) para la detección . Cada muestra se analizó por triplicado.
Medición de VEGF Producción de Células KM12C
producción de VEGF a partir de células KM12C se midió con un kit colorimétrico ELISA VEGF humano (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Brevemente, las células KM12C (1 × 10
6) con PPAR δ silenciado o sin tratar se cultivaron en medio libre de suero durante 18 h. A continuación, las células se trataron con vehículo o indicaron concentración de GW501516, el agonista específico de PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 M) durante 24 h. Los sobrenadantes se sometieron a ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La intensidad del color de cada pocillo se determinó en un lector de microplacas (Anthos htIII, Austria) a 450 nm. Las curvas de calibración se construyeron para cada ensayo representando el valor de absorbancia frente a la concentración de cada calibrador. Las concentraciones de VEGF de muestras se leen de la curva de calibración y normalizado a 10 nanogramos por
6 células.
Análisis estadístico
La significación estadística se determinó usando un t-test, o , en su caso, la prueba de suma de rangos, el análisis de la varianza (ANOVA) o la prueba de Chi-cuadrado utilizando el software SPSS 13.0. La expresión relativa de ARNm se analizó usando el software REST-XL
© (disponible en http://www.wzw.tum.de/gene-quantification/) con el método ΔΔCt [11].
P Hotel & lt; 0,05 se tomó como el nivel de significación. Los datos mostrados representan al menos tres repeticiones de cada experimento realizado por triplicado.
Resultados
Desmontables de PPAR δ crecimiento tumoral Promovido y la disminución de la sensibilidad a la Bevacizumab
Para examinar el efecto de la caída de PPAR δ en el crecimiento del tumor in vivo, se inocularon células KM12C ya sea con volúmenes tumorales silenciada o normales en ratones desnudos y medidos PPAR δ hasta 25 días. Como se muestra en la Figura 1A, la pendiente de la curva de crecimiento de xenoinjertos fue mayor a lo largo de grupo silenciado-δ PPAR, y esta diferencia en las tasas de crecimiento fue estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05). Al final del periodo de crecimiento, el volumen medio del tumor fue de 2,1 veces mayor para el grupo de caída que el grupo de control (2,8 cm
3 vs 1,3 cm
3,
P
= 0,015; figura 1A-C), con un peso promedio de 4,0 ± 1,4 g para el grupo desmontables y 2,5 ± 0,6 g para el control (
P = 0,021
, Figura 1D).
(a). Curva de crecimiento de xenoinjertos. En cada punto de tiempo, los xenoinjertos en PPAR grupo δ-silenciadas (n = 12) crecieron significativamente más grandes que los del grupo control (n = 12) (*
P
& lt; 0,05), incluso cuando se tratan con bevacizumab (**
P Hotel & lt; 0,05) (media ± DE, t-test). (SEGUNDO). fotografía representativa de los ratones en cada grupo fue tomada 25 días después de la inoculación. (DO). Los xenoinjertos de ratones desnudos cuando sacrificaron. el grupo (D) Los xenoinjertos en PPAR δ-silenciada eran significativamente más pesados que los del grupo de control de ratones desnudos cuando sacrificó (media ± DE; *
P = 0,021
; **
P = 0,02
;. t-test)
para evaluar la pertinencia de la combinación de PPAR δ caída con el tratamiento con bevacizumab, inyectamos bevacizumab a los ratones. Se encontró que, la administración de bevacizumab disminuyó significativamente el crecimiento tumoral de los dos grupos, mientras que los tumores en el grupo silenciado-δ PPAR crecieron significativamente más rápido que PPAR δ normal grupo (
P
& lt; 0,05; Figura 1A). El volumen promedio final de los tumores fue de 1,4 veces mayor en el grupo desmontables que el grupo control (0,9 ± 0,11 cm
3 frente a 0,6 ± 0,15 cm
3
P = 0,033
; Figura 1A- C), con un peso promedio de 1,2 ± 0,5 g para el grupo desmontables y 0,8 ± 0,2 g para el control (
P
= 0,02, Figura 1D).
Los xenoinjertos con PPAR δ derribo eran menos diferenciadas
Siguiendo el estándar unificado de cáncer colorrectal Nacional de Investigación de Patología en china, la diferenciación de los tumores se calificó con el porcentaje de componentes de estructura adenoides de la siguiente manera: bien diferenciado (& gt; 95%), moderada (50 % -95%), mal (5% -50%) y no diferenciadas (& lt; 5%). Por tinción HE, encontramos significativamente más diferenciado menos (+ pobremente diferenciado) xenoinjertos en grupo silenciado-δ PPAR que los del grupo control (85% frente a 17%,
P
= 0,025) (Figura 2A, SEGUNDO). Hemos cuantificado aún más los genes asociados con la diferenciación terminal, y se encontró que los ARNm que codifican ADRP, L-FABP o ALPI se redujeron significativamente en todo el grupo de PPAR δ-silenciada en relación con el grupo de control (
P Hotel & lt; 0,05 La figura 2C)
(A).. fotografías representativas de xenoinjertos de tinción HE. Los xenoinjertos en PPAR grupo δ-silenciadas (n = 12) eran obviamente menos diferenciado que los del grupo control (n = 12). × 400 aumentos. (SEGUNDO). grupo silenciado PPAR δ- tenía xenoinjertos significativamente más diferenciados menos que el grupo control (85% frente a 17%,
P = 0,025;
prueba Chi-cuadrado). (DO). Se muestra por RT-PCR cuantitativa, los ARNm que codifican ADRP, L-FABP o ALPI se redujeron significativamente en PPAR δ-silenciado grupo en relación con el grupo control (
P Hotel & lt; 0,05).
PPAR δ Derribo promovió la proliferación de células tumorales
Hemos demostrado previamente que las células silenciadas KM12C-δ PPAR tuvieron una tasa de crecimiento promovido in vitro [9]. A declarar en vivo, hemos examinado la expresión del marcador de proliferación Ki67 en los xenoinjertos. Como se muestra mediante el ensayo de IHC, grupo silenciado-δ PPAR tenía significativamente más alta expresión de Ki67 de PPAR δ-normal de grupo (puntuación media: 3,5 ± 0,4 vs. 2,0 ± 0,6,
P = 0,026
; Figura 3A, SEGUNDO). Después del tratamiento con bevacizumab, la expresión de Ki67 se redujo notablemente en ambos grupos, mientras que sigue siendo significativamente mayor en el grupo de PPAR δ-silenciada que en el grupo de control (puntuación media: 2,3 ± 0,5 vs. 1,2 ± 0,3,
P =
0,031; Figura 3A, B). La RT-PCR cuantitativa dio resultado concordante con el ensayo de IHC (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 3C).
(A). fotografías representativas de la expresión de Ki67 en xenoinjertos manchados por IHC. magnificación × 400. (SEGUNDO). grupo silenciado PPAR δ- (n = 12) tuvieron significativamente más alta puntuación de tinción Ki67 que el grupo control (n = 12) (*
P = 0,026
), incluso después de tratado por el bevacizumab (**
P
= 0,031) (media ± DE; prueba de t). (DO). El nivel de ARNm de Ki67 fue significativamente mayor en el grupo con silenciador-δ PPAR que en el grupo control (*
P = 0,018
), incluso después de tratado por el bevacizumab (**
P
= 0,025).
PPAR δ derribo no afectó a la apoptosis de las células tumorales
el efecto de la caída de PPAR δ sobre la apoptosis celular se examinó mediante ensayo de TUNEL. Como se muestra en la Figura 4, no se encontró diferencia significativa de AI entre PPAR δ-silenciado grupo y el grupo control (6,2 ± 4,7% frente a 7,0 ± 3,6%,
P
= 0,81), incluso después del tratamiento bevacizumab ( 10,8 ± 4,1% ± 2,9% vs.11.2,
P
= 0,75).
(A). imágenes representativas de cada grupo. Las células totales fueron identificadas por tinción DAPI, y las células de la apoptosis positivos fueron identificados por FITC mancha. × 200 aumentos. (SEGUNDO). Los datos cuantitativos de índice de apoptosis (AI). No hubo diferencia significativa entre los grupos de la IA, incluso después de tratados con bevacizumab (media ± DE, *
P
= 0,81, **
P
= 0,75; prueba t).
Desmontables de PPAR δ expresión inducida por VEGF en xenoinjertos
Para analizar la correlación de PPAR δ con VEGF, hemos examinado aún más la expresión de VEGF en los xenoinjertos. Por IHC, se encontró que el grupo silenciado-δ PPAR tuvo significativamente más casos con VEGF-alta expresado (puntuación ≥2.0) (77% vs. 33%,
P
= 0,03) y una mayor puntuación de intensidad que en el control grupo (3,1 ± 0,3 vs. 1,5 ± 0,2,
P
= 0,028; Figura 5A, B). Quantitative análisis RT-PCR mostró que, el ARNm de VEGF se incrementaron significativamente en el grupo silenciado-δ PPAR en comparación con el control. (
P =
0,032; Figura 5C)
(A). fotografías representativas de la expresión del VEGF en xenoinjertos manchados por IHC 400 × magnificación.; (SEGUNDO). PPAR δ- grupo silenciado (n = 12) tuvieron significativamente más alta puntuación de tinción de VEGF que en el grupo control (n = 12) (*
P = 0,028
; rango suma de prueba). (DO). resultado cuantitativo de RT-PCR (*
P = 0,032
).
La activación de PPAR δ disminución de la expresión de VEGF en las células KM 12C
Para confirmar la asociación entre PPAR δ y VEGF, se trataron las células con GW501516 KM12C (el agonista específico de PPAR δ) o vehículo, y se cuantificó el VEGF en el sobrenadante libre de células mediante el ensayo de ELISA. Como se muestra en la Figura 6, la secreción de VEGF fue mucho mayor en las células silenciadas-δ el PPAR que en aquellos con (células de control) normales de PPAR δ antes de la administración GW501516 (
P
= 0,035). Después del tratamiento con GW501516, la VEGF se redujo de una manera dependiente de la dosis en las células de control (
P
= 0,018), mientras que no hubo cambio significativo en las células silenciadas-δ el PPAR a lo largo de (
P
= 0,83).
las células KM12C fueron tratados con concentraciones seriadas de GW501516 o vehículo, y se recogieron los sobrenadantes libres de células para la cuantificación de VEGF por ELISA. Tratado por GW501516, las células de control mostraron una disminución dependiente de la dosis de la secreción de VEGF (*
P
= 0,018), mientras que las células silenciadas-δ el PPAR tuvieron ningún cambio significativo a lo largo de (**
P
= 0,83;. ANOVA) guía empresas
Discusión
en el presente estudio, se encontró que los xenoinjertos en PPAR δ-silenciados grupo creció significativamente más rápido con menos diferenciación, promueve la proliferación celular mientras que el índice de apoptosis similar y el aumento de VEGF en comparación con los del grupo PPAR δ normal, independientemente del tratamiento bevacizumab. La administración de agonista de PPAR δ disminuyó significativamente la expresión de VEGF en las células KM12C PPAR δ-normales, mientras que no afectó a la de las células silenciadas-δ PPAR. Estos hallazgos demuestran que, desmontables de PPAR δ promueve el crecimiento de cáncer de colon por la disminución de la diferenciación y la promoción de la proliferación, así como la expresión del VEGF de las células tumorales in vivo, y reduce la sensibilidad del tumor a bevacizumab. Estos resultados apoyan un papel supresor de PPAR δ en la patogénesis del cáncer de colon.
En el presente estudio, nuestro hallazgo de que los xenoinjertos en ratones crecieron significativamente más grande y más pesado después de caída de PPAR δ indica que PPAR δ puede atenuar tumoral crecimiento in vivo. De acuerdo con este hallazgo, estudios recientes muestran que la formación de pólipos de colon fue significativamente mayor en los ratones PPAR δ deficientes en comparación con los animales de tipo salvaje [12], [13]. En contraste con estas observaciones, Park et al. [14] informaron de que PPAR δ nulo HCT-116 células tenían una menor capacidad para formar xenoinjertos en ratones desnudos. Otro estudio concluyó que PPAR δ es prescindible para la formación de pólipos en el colon de APC
ratones Min [15]. Sin embargo, estas conclusiones se basaron en el análisis de menos de 6 ratones, con un poder estadístico limitado. El resultado de este estudio incluye datos de un total de 48 ratones, proporcionando evidencia más definitiva para un papel funcional para PPAR δ en la carcinogénesis de colon.
Para aclarar el mecanismo subyacente a la del crecimiento de los tumores después de promovido PPARd caída, nos analizado aún más la expresión de diferenciación, proliferación celular, apoptosis y VEGF en los xenoinjertos. Se encontró que los xenoinjertos mostraron histología significativamente diferenciada menos después de la caída de PPAR δ, con un aumento de la expresión de genes relacionados con la diferenciación ADRP, L-FABP y ALPI. Estos resultados proporcionan pruebas in vivo que PPAR δ puede facilitar la diferenciación de cáncer de colon. Este hallazgo es consistente con estudios recientes que implican PPAR δ en la regulación de la diferenciación epitelial: La activación de PPAR δ estimula la diferenciación terminal de los queratinocitos [16] - [18]; PPAR δ promueve la diferenciación de células de Paneth en criptas intestinales [19]. Recientemente, se muestra que PPAR δ knockdown induce menos diferenciación de líneas celulares de cáncer de colon, y de alta expresión de PPAR δ se relaciona con una mejor diferenciación de cáncer rectal [10]. Estos resultados son consistentes con las observaciones in vivo en el presente estudio. La regulación de la diferenciación puede ser la base del efecto promotor de la caída de PPAR δ sobre el crecimiento tumoral como se muestra en este estudio.
El saldo de la proliferación y la apoptosis juega un papel vital en el control del crecimiento tumoral. La progresión del crecimiento tumoral se caracteriza por el aumento de la proliferación y /o disminución de la apoptosis, o ambos. En el presente estudio, se encontró que la expresión de Ki67 se incrementó significativamente, mientras que la apoptosis de las células tumorales no se cambió después de caída de PPAR δ. Demuestra que PPAR δ caída puede promover la proliferación, mientras que no tienen ningún efecto sobre la apoptosis de células de cáncer de colon. Este resultado es consistente con nuestras observaciones anteriores in vitro, que muestran que PPAR δ knockdown promueve la proliferación de células HCT-116 sin efecto sobre la apoptosis [20]. El desequilibrio de la proliferación y la apoptosis es responsable del crecimiento del tumor después de la caída promovido PPAR δ.
La angiogénesis es uno de los principales determinantes del crecimiento del tumor, como tumor debe estimular el host para crear su propio sistema vascular para seguir creciendo cuando que crece más de 1-2 mm
3 [21]. VEGF es un factor desencadenante de la angiogénesis y esencial para el desarrollo de los vasos sanguíneos [22], [23]. Junto con VEGF, otros genes relacionados con el crecimiento están implicados en la angiogénesis. Un estudio reciente mostró que la activación de PPAR δ VEGF hasta reguladas en las células de cáncer de colon [24], lo que implica PPAR δ en la angiogénesis del cáncer de colon. En el presente estudio, mostramos que el VEGF fue significativamente mayor tanto en las células KM12C y los xenoinjertos después de caída de PPAR δ, y la disminución en las células KM12C PPAR δ-normales mientras que las células sin cambios en PPAR δ-silenciada tras el tratamiento de GW501516. Esto demuestra que la activación de PPAR δ inhibe la expresión de VEGF y por lo tanto puede atenuar la angiogénesis del cáncer de colon. Este resultado es consistente con los estudios recientes que demuestran que δ PPAR pueden inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares [7], [25], [26]. La promoción de la angiogénesis mediada por VEGF puede ser otro factor que subyace al crecimiento del tumor después de la caída promovido PPAR δ.
Para examinar la influencia de la caída de PPAR δ sobre la sensibilidad a la quimioterapia, se trataron los ratones desnudos con bevacizumab. Después del tratamiento, el crecimiento del tumor, así como la proliferación celular fue, obviamente, se desaceleró y la apoptosis se incrementó en ambos grupos, mientras que el grupo silenciado-δ PPAR todavía mostraba mayores capacidades de crecimiento del tumor y la proliferación de células que en el grupo de PPAR δ-normal. Este hallazgo demuestra que PPAR δ caída reduce la sensibilidad de cáncer de colon a bevacizumab, subyacente que puede ser el aumento de la proliferación y disminuir la diferenciación de los tumores. También implica que, vía mediada VEGF no es el único mecanismo por el cual PPAR δ regula el crecimiento del tumor. Para nuestro conocimiento, este es el primero en informar del efecto de PPAR δ en la quimiosensibilidad del cáncer de colon. Esto implica que, el cáncer de colon con la expresión normal o alto de PPAR δ puede tener una mejor respuesta a bevacizumab que aquellos con baja expresión de PPAR δ. Por lo tanto, el nivel de expresión de PPAR δ podría ser un potencial predictor de eficacia de bevacizumab, y el desarrollo y aplicación de agente de PPAR δ-agonista puede ser una manera prometedora para promover la eficacia de bevacizumab para el cáncer de colon.
conclusión, se muestra aquí que PPAR δ knockdown promueve el crecimiento del cáncer de colon, la inducción de la diferenciación y menos acelerar la proliferación celular así como la expresión de VEGF, mientras que no tiene efecto sobre la apoptosis, independientemente del tratamiento bevacizumab. la activación de ligando de PPAR δ disminuye la expresión de VEGF en células de cáncer de colon. Estos resultados indican que, PPAR δ puede inhibir el crecimiento tumoral mediante la inducción de la diferenciación, la atenuación de la proliferación celular y la angiogénesis mediada por VEGF en la patogénesis de cáncer de colon, y facilitar la sensibilidad del tumor a bevacizumab. Estos resultados apoyan la razón fundamental para el desarrollo de agonistas PPAR δ para la prevención y /o tratamiento de cáncer de colon.
Reconocimientos
Agradecemos al Prof. I.J. Fidler (Anderson Cancer Center, Houston, TX) para ofrecer la línea celular KM12C.