Extracto
-de células no pequeñas de cáncer de pulmón-(CPNM) representa aproximadamente el 85% de todos los cánceres de pulmón y sigue siendo poco conocida. Mientras que las vías de señalización operativas durante el desarrollo de órganos, incluyendo Sonic Hedgehog (Shh) y los factores de transcripción asociados Gli (Gli1-3), recientemente se ha encontrado que ser reactivado en NSCLC, su papel funcional sigue siendo poco clara. Aquí, la hipótesis de que Shh /Gli1-3 podría mediar NSCLC proliferación autónoma y la señalización epitelial /estroma en el tejido tumoral. En este contexto, hemos investigado la actividad de la señalización de Shh /Gli1-3 en CPNM en ambos, el cáncer y las células del estroma. Presentamos aquí que la inhibición de la señalización de Shh induce una disminución significativa en la proliferación de células de NSCLC. Este efecto es mediado por Gli1 y Gli2, pero no Gli3, a través de la regulación de la ciclina D1 y la expresión de ciclina D2. Mientras exógeno Shh era incapaz de inducir la señalización en cualquiera de adenocarcinoma de pulmón A549 o células de carcinoma escamoso de pulmón H520, se encontró que tanto las células para secretar ligando Shh, que induce la proliferación de fibroblastos, la supervivencia, migración, invasión, y la síntesis de colágeno. Además, Shh secretada por NSCLC media la producción de factores proangiogénicos y metastásicos en fibroblastos de pulmón. Nuestros resultados proporcionan pruebas de que Shh juega un papel importante en la mediación de la interferencia epitelial /mesenquimales en NSCLC. Mientras que la actividad Gli autónomo controla la proliferación NSCLC, el aumento de Shh expresión por NSCLC se asocia con la activación de fibroblastos en el estroma asociado al tumor. Nuestro estudio pone de manifiesto la relevancia del estudio de las células del estroma asociada en el contexto de NSCLC en relación con la nueva pronóstico y las opciones terapéuticas
Visto:. Bermudez O, Hennen E, I Koch, Lindner M, Eickelberg O (2013) Gli1 Mediatiza El cáncer de pulmón proliferación celular y la activación de la célula mesenquimal sonic Hedgehog-dependiente. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10.1371 /journal.pone.0063226
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptado: April 1, 2013; Publicado: May 7, 2013
Derechos de Autor © 2013 Bermúdez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Asociación Helmholtz. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el cáncer más mortal en todo el mundo. Actualmente, no existen opciones de tratamiento eficaz para el cáncer de pulmón y la tasa de supervivencia a 5 años es de sólo el 14% de los pacientes con el tratamiento [1] .La falta de tratamiento eficaz a largo plazo está relacionada con la complejidad del cáncer de pulmón y por lo tanto con la necesidad para entender mejor la biología de la carcinogénesis de pulmón. Poca atención ha sido hasta ahora dirigida al microambiente que rodea el tumor, lo que constituye el estroma asociado al tumor y actúa como participante activo en la tumorigénesis. En los últimos años, cada vez más pruebas ha señalado la importancia del estroma en la iniciación del tumor, progresión y el metabolismo de muchos tipos de cáncer [2] - [7]. Del mismo modo, la señalización en las células del estroma se ha demostrado ser esencial para la transformación maligna de las células epiteliales [2], [5], [6].
Vías involucradas en la organogénesis y pulmón morfogénesis de ramificación, incluyendo Hedgehog ( hh) de señalización, se han identificado recientemente como actores clave en los cánceres humanos [8]. Existen tres genes Hedgehog (Hh) en los mamíferos, con Sonic Hedgehog (Shh) como el gen más ampliamente expresado. Secretada Shh se une a los receptores de Patched (Ptch) presentes en la membrana citoplasmática de la célula receptora. La unión de Shh a Ptch libera la represión que Ptch ejerce sobre Smoothened, un receptor transmembrana de siete-lapso como proteína esencial para la transducción de la señalización de Hedgehog. Smoothened facilita la interacción de diferentes efectores erizo en los cilios primarios, lo que resulta en la activación de los factores de transcripción Gli [9]. En los seres humanos, las tres proteínas de dedos de zinc Gli (Gli1, Gli2 y Gli3) orquestan la respuesta Hedgehog-específica en la célula mediante la modulación de la expresión génica. Los genes de la vía de Hedgehog sí, incluidas Gli1 y Ptch1 son blanco de Gli, lo que representa un circuito de retroalimentación que sirven como lectura de la actividad de Hedgehog [10]. La activación de la vía canónica Hh humano depende de la expresión de los receptores de Ptch (Ptch1, PTCH2) y el receptor señuelo Hhip (Hedgehog-proteína de interacción) [11]. proteínas intracelulares que regulan la estabilidad Gli, como SUFU (supresor del fusible) y SPOP (de tipo moteado proteína POZ) juegan también un papel importante en la determinación de la actividad Gli y por lo tanto la activación de la vía Hedgehog canónica [12]. En los últimos años, los estudios han puesto de manifiesto la existencia de una vía Hedgehog no canónica que no requiere el eje completo Shh-Ptch-SMO-Gli. A no canónica de señalización dependiente de SMO pero independiente de Gli Hedgehog, que regulan tubulogenesis y la apoptosis, se ha descrito en las células endoteliales [13] .Con tiempo, factores de transcripción Gli aparecen como una plataforma de integración de numerosas entradas de señalización, el establecimiento de un segundo tipo de no canónica de señalización Hedgehog, dependiente de Gli pero independiente de SMO. Este es el caso de adenocarcinoma ductal pancreático, donde Gli transcripción está regulada por TGF-ß y K-ras [14].
La vía de señalización Hedgehog juega un papel crítico durante el desarrollo de los vertebrados el control del crecimiento celular, la supervivencia, el destino y el patrón de la estructura corporal. Las alteraciones en la vía de Shh durante el desarrollo pulmonar afectan las interacciones /mesenquimales epiteliales y dan lugar a defectos en la morfogénesis de ramificación, deteriorando la función pulmonar. Mientras que la señalización de Shh es esencial para el desarrollo de los pulmones, el papel que esta vía de señalización puede jugar en los pulmones de adultos sigue siendo poco clara y recién ahora está empezando a ser investigado. Estudios recientes han puesto de relieve la importancia de la señalización de Hedgehog en la fibrosis pulmonar idiopática, una enfermedad letal de etiología desconocida. Bolaños et al han descrito que los componentes de la vía Hedgehog se sobreexpresa en los pulmones con FPI y fibroblastos IPF. Por otra parte, se encontró que los fibroblastos de pulmones con FPI para responder a Shh y esta respuesta correlacionada con la activación de fibroblastos
en
in vitro
[15]. Un estudio independiente realizado por Cigna et al [16] mostró que los fibroblastos humanos primarios de pulmón normal y IPF expresan los principales componentes de la vía de señalización Hedgehog, asociados con la proliferación celular y la expresión de marcadores myofibroblastic en fibroblastos. Mientras que estos estudios poner de manifiesto la importancia de la señalización de Hedgehog en la fibrosis pulmonar, el papel de esta vía en diferentes formas de cáncer de pulmón sigue siendo poco clara. Los cánceres de pulmón se clasifican según el tipo histológico: los dos tipos más frecuentes de cáncer de pulmón son el carcinoma de células no pequeñas de pulmón (NSCLC) y de células-carcinoma pequeñas (SCLC). NSCLC y SCLC no sólo presentan diferencias en el tamaño y la apariencia de las células cancerosas, pero también diferente pronóstico y tratamiento clínico. Debido a la heterogeneidad de cada subtipo de cáncer de pulmón, se necesita caracterización histológica y molecular adicional para seleccionar un tratamiento más específico. Tradicionalmente, el CPNM fueron seleccionados y tratados para EGFR y K
ras
mutaciones. Sin embargo, la aparición de resistencia a estos tratamientos y la descripción de nuevas firmas moleculares han puesto de relieve la necesidad de una terapia mejor tumor molecular dirigida a perfil. Algunos estudios han descrito la asociación entre los nuevos patrones de expresión de genes en subconjuntos específicos de NSCLC [17], [18], y otros sugieren la aplicación de perfiles moleculares nuevo tumor en futuras terapias. Por ejemplo, la evaluación de MMP2 y b-catenina expresión se ha propuesto tener un potencial en el diagnóstico de NSCLC con diferentes características clínico [19]. En SCLC, un tumor con características neuroendocrinas primitivos, Shh se encontró para ser activado en las células progenitoras neuroendocrinos y en las células tumorales en ratones [20], [21]. Si bien estos estudios apoyan una yuxtacrina /activación autocrina de Hh en el CPCP, no está claro cómo esta vía se activa en el CPNM, el subtipo más frecuente de cáncer de pulmón. Dadas las diferencias clínicas y biológicas de NSCLC y SCLC, la hipótesis de que el mecanismo de activación de Shh en el CPNM es diferente de SCLC. El objetivo fue investigar la actividad de señalización de Shh en el CPNM tanto en las células cancerosas y del estroma. Con el fin de evaluar la importancia de la señalización de Shh en las células de NSCLC, hemos realizado desmontables de los tres factores de transcripción Gli (Gli1-3), que median la señalización de Shh intracelular, y estudiado el impacto de los mismos sobre la proliferación de NSCLC. Por otra parte, hemos evaluado cómo las células y fibroblastos de pulmón NSCLC respondió a exógeno Shh en términos de proliferación, la migración celular, invasión y remodelación de la matriz extracelular.
Resultados
ciclopamina, un inhibidor de erizo, Reduce CPNM proliferación y viabilidad
Una de las características más desfavorables de los cánceres es la desregulación de la proliferación celular. Por tanto, hemos estudiado el papel que podría tener Shh en la proliferación de NSCLC, el uso de células de adenocarcinoma y células de carcinoma escamoso, el primero y segundo tipo más frecuente de cáncer de pulmón, respectivamente. Inicialmente, se utilizó La ciclopamina, un alcaloide esteroide de origen vegetal que inhibe Smoothened (SMO), una proteína G-receptor acoplado que transduce la señal de Shh en la célula, para bloquear vía de Shh en células de NSCLC. Cuando se trata con ciclopamina, las células A549 de adenocarcinoma y escamosas carcinoma de pulmón de células H520 mostraron una disminución significativa del número de células especialmente en los puntos de tiempo más largos (Figuras 1A y B). La ciclopamina también redujo la supervivencia celular (actividad metabólica evaluado mediante el ensayo de MTT) (Figuras 1A y B) y este efecto fue más importante con el aumento de las dosis del inhibidor (Figura S1A y la Figura S3E). Para descartar que la ciclopamina no provocó un efecto citotóxico no específica en las células de NSCLC, se determinó la apoptosis tras el tratamiento con ciclopamina. Aunque ciclopamina indujeron un ligero aumento en la medida de las células apoptóticas, la proporción de células apoptóticas no fue estadísticamente diferente entre las células tratadas y las células no tratadas (Figura S1B y la Figura S3F). Con el fin de confirmar el efecto específico de la ciclopamina sobre la proliferación y viabilidad NSCLC, se realizó SMO silenciamiento. SMO knockdown indujo una disminución en A549 y H520 tanto la proliferación celular y la viabilidad (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados muestran que el bloqueo de la vía de Hedgehog través de la inhibición SMO, reduce la proliferación y la viabilidad NSCLC.
células pulmonares adenocarcinoma A549 (A) y células de pulmón de carcinoma escamoso H520 (B) se cultivaron en presencia o ausencia de 10 ciclopamina mu M durante 5 días. La proliferación se evaluó mediante el recuento de células y la supervivencia celular mediante el ensayo de MTT. * P & lt; 0,1; ** P & lt; 0,05. (C) La transcripción del erizo que responde a factores de Gli1, Gli2 o Gli3 fueron derribados con siRNA en células A549. RT-PCR cuantitativa se realizó para confirmar el silenciamiento específico de cada Gli y para evaluar la expresión del receptor de erizo Ptch1. Los resultados se presentan como diferencias de plegado de los niveles de mRNA (2
∧∧Ct) en comparación con las células transfectadas con un control negativo siRNA (siRNA NC) que no tiene homología en transcriptoma de vertebrados. ** P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,01. El impacto de silenciar Gli1, Gli2 o Gli3 en la proliferación de células A549 se evaluó por recuento de células (D) y en la supervivencia celular mediante el ensayo de MTT (E). Los resultados se presentan en porcentaje como la proliferación relativa y la supervivencia relativa en comparación con las células transfectadas con el ARNsi de control negativo (NC). * P & lt; 0,1. Se presentan (F) Representante de contraste de fase imágenes microscópicas después de 72 horas de siRNA. (G) RT-qPCR se realizó para evaluar el efecto de la siRNA de Gli1, Gli2 y Gli3 en la expresión de la transición G1 /S ciclinas de fase D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) y ciclina E (Cyc E1). Los resultados se presentan como veces de los niveles de mRNA (2
∧∧Ct) en comparación con las células transfectadas con un control negativo siRNA (siRNA NC) que no tiene homología en transcriptoma de vertebrados. * P & lt; 0,1; ** P & lt; 0,05. (H) de transferencia de Western de la ciclina D2 en las células A549 transfectadas con siRNA Gli o con un control negativo siRNA (NC). Blot de la ß-actina se utilizó como control de carga.
El silenciamiento de Gli1 Disminuciones NSCLC proliferación mediante la modulación de la expresión de ciclina D
A pesar de ciclopamina se ha encontrado para afectar la proliferación celular en otros tipos de las células del cáncer, el mecanismo específico por el que la señalización de Shh regula la proliferación de cáncer de células NSCLC sigue siendo difícil de alcanzar. Por ejemplo, no se sabe cómo cada uno de los 3 humana Shh-factores de transcripción Gli contribuye a la proliferación de NSCLC. Con el fin de abordar esta cuestión, hemos utilizado pequeños ARN de interferencia (siRNA) para silenciar Gli1, Gli2 y Gli3. Tras una reducción específica e importante en los niveles de mRNA de Gli1 que no afectó ni Gli2 o los niveles de ARNm de Gli3 (Figura 1C), la proliferación celular y la viabilidad celular se redujo en las células A549 de adenocarcinoma (Figura 1D-F). De la notificación, el silenciamiento de Gli1 provocó una reducción en los niveles de ARNm Ptch1 (Figura 1C). Debido a que la transcripción de Ptch1 depende de Gli1, la reducción de los niveles de ARNm de Ptch1 sirve como un control adicional que indica que el silenciamiento de Gli1 era biológicamente eficaz. El silenciamiento específico de Gli2, que reduce los niveles de ARNm Gli2 y no a disminuir, ya sea Gli1 o los niveles de mRNA Gli3 (Figura 1C), disminuyó ligeramente el número de células A549 y la viabilidad celular, aunque no de manera estadísticamente significativa (Figura 1 D y E). Por último, el siRNA de Gli3 que provocó una disminución importante en los niveles de Gli3 de ARNm pero no una disminución en Gli1 o niveles Gli2 de ARNm (Figura 1C), no redujo la proliferación celular de adenocarcinoma de A549 o la viabilidad celular (Figura 1D y E) y en su lugar causó una ligero aumento en el número de células de las células de adenocarcinoma de A549 (Figura 1D), junto con un aumento en los niveles de ARNm de Gli1 (Figura 1C). En H520 células de carcinoma escamoso de pulmón (Figura S3) y en grandes células de carcinoma de células (datos no mostrados), el silenciamiento específico de Gli1, Gli2 o Gli3 tuvo un efecto similar en la proliferación celular y la expresión de ciclina. Es importante destacar que la expresión de los genes y las ciclinas relacionados con Shh sobre Gli1, Gli2 y el silenciamiento Gli3 no se debió a HPRT1 expresión porque se ha encontrado un patrón similar de expresión cuando se utilizaron 3 genes de referencia independientes en A549 (Figura S2) y en las células H520 ( Figura S4).
con el fin de explorar cómo el silenciamiento de la proliferación de adenocarcinoma de pulmón impactos vía Shh, hemos evaluado los cambios en la expresión de las ciclinas D y e involucradas en transición G1 /S del ciclo celular, sobre Gli baja regulación. De interés, el siRNA de Gli1 y Gli2 provocó una importante disminución de la ciclina D2 y una ligera reducción en los niveles de ARNm de ciclina D1 (Figura 1G). Se observó la disminución de la expresión de ciclina D2 sobre Gli1 y Gli2 caída en el ARNm, sino también a nivel de proteínas (Figura 1H). Teniendo en cuenta que Gli2 podría afectar a la expresión de ciclina D, la hipótesis de que en combinación con Gli1, este factor de transcripción podrían regular la proliferación celular de una manera significativa. Para confirmar esta hipótesis, nos hemos dado cuenta de la doble silenciamiento de los factores de transcripción Gli. Mientras que el solo silenciamiento de Gli2 no disminuyó significativamente la viabilidad celular, la doble silenciamiento de Gli1 y Gli2 hizo (Figura S1C). En células de carcinoma escamoso de pulmón H520, se encontró el knockdown específico de Gli1 y Gli2 de siRNA para disminuir en una expresión de manera ciclina D1 y ciclina D2 similar (Figura S3A). Tomados en conjunto, estos resultados indican que el bloqueo de la vía de señalización de Shh, ya sea con ciclopamina o interferir con el factor de transcripción Gli1 disminuye la proliferación de NSCLC.
Las células de NSCLC no activan Shh Camino A exógena tratamiento Shh
Puesto que el bloqueo de la vía de Shh disminuye la proliferación NSCLC, se investigó si exógeno Shh produce un incremento en la proliferación celular en estas células. células de adenocarcinoma de pulmón A549 y células de carcinoma escamoso H520 tratados con recombinante humano Shh no mostraron un cambio ya sea en el número de células (Figuras 2A y D) o en la supervivencia celular (Figuras 2B y E). Además, las células no presentaron ningún cambio morfológico tras el tratamiento (Figuras 2C y F). Estos resultados sugieren que las células de NSCLC no responden a Shh. Con el fin de validar el tratamiento Shh, hemos utilizado células primarias de embrión de ratón a partir de los esbozos de los miembros, el tejido que se ha demostrado que son sensibles a Shh. Tras el tratamiento Shh, estas células exhiben un aumento considerable en los niveles de ARNm y Gli1 Ptch1 (60 veces y 9 veces aumento respectivamente, en comparación con células no tratadas; Figura S5). Cuando las células A549 se trataron con Shh, un aumento muy modesto (1,65 veces) en los niveles de ARNm de Gli1 a las 8 horas y de los niveles de proteína Gli1 a las 24 horas se detectó. Sin embargo, en los puntos de tiempo más largos no se hubo cambios significativos en ninguno de Gli1 o expresión Ptch1 (Figuras 3A y B). Para células H520, cualquier cambio significativo en cualquiera Gli1 o Ptch1 en el nivel de ARNm y proteína se observó (Figuras 3C y D). Estos resultados indican que,
in vitro
, ambos tipos de células de NSCLC, en comparación con las células que responden a Shh conocidos, no responden sobre todo a exógenos Shh.
células de adenocarcinoma de pulmón A549 (A-C ) y de pulmón de células de carcinoma escamoso H520 (D-F) fueron tratados o no con Shh recombinante (500 ng /ml). La proliferación celular se evaluó mediante el recuento de células (A, D) y la supervivencia celular mediante el ensayo de MTT (B, E) en los tiempos indicados. se muestran representante de contraste de fase imágenes microscópicas de células A549 (C) y de células H520 (F).
células de NSCLC fueron tratados o no con Shh recombinante (500 ng /ml) en los tiempos indicados . RT-qPCR se realizó para evaluar los niveles de ARNm y Gli1 Ptch1 tras el tratamiento en las células A549 (A) y células H520 (C). Los resultados se presentan como diferencias de plegado de los niveles de mRNA (2
∧∧Ct) en comparación con células no tratadas para cada punto de tiempo. Western blot se realizó para evaluar Gli1 y Ptch1 niveles de proteína en células A549 (B) y en las células H520 (D) tratados o no con Shh. ß-actina se utilizó como control de carga. La secreción de Shh humano se evaluó en los sobrenadantes de las células A549 y H520 por ELISA (E) y se confirmó por Western blot utilizando un anticuerpo que reconoce la forma activa secretada de Shh (recuadro E). El Western blot se realizó con H520 sobrenadante (H520 sup.) Y con Shh recombinante (Rec. Shh) utilizado como control positivo. (F) La caída del gen Shh de siRNA se realizó en células H520. Shh secreción se evaluó mediante ELISA y se expresa en porcentaje como la secreción relativa en comparación con las células transfectadas con un control negativo siRNA (NC) que no tiene homología en transcriptoma de vertebrados. ** P & lt; 0,05 (G) Después de silenciamiento de Shh, células de NSCLC se trataron o no con Shh recombinante (500 ng /ml). RT-qPCR se realizó para evaluar los niveles de ARNm de Gli y Ptch1. Los resultados se presentan como pliegue de las diferencias de ARNm (2
∧∧Ct) en las células tratadas en comparación con las células no tratadas.
Las células de NSCLC Secrete Shh ligando
El uso de un determinado prueba ELISA para Shh humana, encontramos que las células A549 de adenocarcinoma y más fuertemente H520 carcinoma escamoso productos Shh (170 y 2800 pg /ml, respectivamente, Figura 3E). Esta secreción puede estar asociada con la producción endógena Shh por estas células de NSCLC porque la concentración de Shh en el medio de cada tipo de células era muy baja, comparable a la de fondo (agua).
Con el fin de corroborar estos resultados y para investigar si estas células NSCLC también producen las otras formas de ligando Hedgehog, hemos evaluado la expresión de sonic, Desert (Dhh) e Indian Hedgehog (Ihh) en células A549 y H520. Aunque no hemos podido detectar por RT-qPCR Dhh y Ihh, encontramos que Sonic Hedgehog se expresó en células A549 y H520, siendo más expresa en estos últimos (datos no mostrados). Sobre la base de estos resultados, por lo que hemos concentrado en Shh largo de nuestro estudio. Además, porque las células H520 producen y secretan grandes cantidades de ligando Shh, decidimos centrarnos en estas células de NSCLC de hacer más estudios relacionados con la secreción Shh. Para evaluar con mayor precisión la presencia de la forma activa de Shh en H520 sobrenadante, Western blot se realizó con un anticuerpo que reconoce la forma activa procesada de Shh (N-Shh). La presencia de la N-terminal del péptido secretado Shh en el sobrenadante de las células H520 se confirmó de este modo (recuadro Figura 3E).
Dado que las células H520 secretan una cantidad considerable de Shh, pero no responden a Shh exógeno, que tuvo como objetivo para investigar si esta falta de respuesta se asoció con la saturación de la actividad Hedgehog endógena en estas células. Para ello, hemos realizado el silenciamiento del gen Shh en células H520. Tras la caída de Shh, que reduce en un 70% la secreción de Shh en H520 células (Figura 3F), Shh exógeno aumentó los niveles de mRNA Gli1 en estas células (Figura 3G). Este aumento, así como un ligero incremento en los niveles de Ptch1 ARNm (Figura 3G) indican que las células H520 pueden responder a Shh cuando se reducen sus niveles endógenos de Shh.
pulmonares fibroblastos responden muy bien a exógenos Shh
Dado que las células de NSCLC pueden secretar ligando Shh, pero no responden fuertemente a exógenos Shh, se investigó si Shh podría más bien activar las células del estroma adyacente. De hecho, los fibroblastos de pulmón de ratón tratados con Shh mostraron una fuerte activación de la vía Hedgehog tras el tratamiento: niveles de ARNm Gli1 incrementado hasta 800 veces y los niveles de ARNm Ptch1 tenido un aumento veces hasta 250, especialmente a las 48 y 72 horas (Figura 4A). Se obtuvieron resultados similares con Shh humano (Figura 4A). tratamiento Shh también aumentó Gli1 y Ptch1 a nivel de proteínas (Figura 4B). Con el fin de saber si pulmonares fibroblastos humanos desde el entorno de NSCLC también podrían responder a Shh exógeno, fibroblastos de pulmón humanas primarias se aislaron a partir de un carcinoma epidermoide de pulmón resecado. Curiosamente, los niveles de ARNm y Gli1 Ptch1 también se incrementaron tras el tratamiento Shh en estas células (Figura 4C). Estos resultados indican que,
in vitro
, fibroblastos de pulmón son células altamente sensibles Shh, en contraste con las células epiteliales de NSCLC.
fibroblastos de pulmón de ratón CCL206 fueron tratados o no con 500 ng /ml de de ratón recombinante Shh o 500 ng /ml de Shh humano durante 24, 48 y 72 horas. niveles (A) mRNA de Gli1, Gli2, Gli3 y Ptch1 por tratamiento fueron evaluados por RT-qPCR. Los resultados se presentan como pliegue de las diferencias en los niveles de mRNA (2
∧∧Ct) de las células tratadas en comparación con las células no tratadas para cada punto de tiempo. * P & lt; 0,1; *** P & lt; 0,01. (B) transferencia de Western se realizó para evaluar los cambios en los niveles de proteína Gli1 y PTCH1 en fibroblastos CCL206 tratadas o no con el ratón Shh (500 ng /ml). ß-actina se utilizó como control de carga. (C) los fibroblastos humanos primarios se trataron o no con recombinante humano Shh (500 ng /ml) durante 24, 48 y 72 horas. RT-PCR cuantitativa se realizó para evaluar los niveles de mRNA de Gli1, Gli2, Gli3 y Ptch1. Los resultados se presentan como pliegue de diferencias de ARNm (2
∧∧Ct) en células tratadas en comparación con las células no tratadas para cada punto de tiempo. * P & lt; 0,1; ** P & lt; 0,05; *** P & lt;.
0,01
Con el fin de investigar si la falta de respuesta a Shh exógeno en las células NSCLC se debió a una recepción inadecuada de ligando Shh en estas células, hemos evaluado la expresión de los receptores Ptch1, PTCH2 y de Hhip, consideradas como un receptor señuelo, en el A549, H520 y células de fibroblastos CLL206. Se encontró expresión Ptch1 a ser mayor que Hhip en ambos tipos de células de NSCLC (Figura S6). Además, la expresión relativa de Ptch1 fue mayor en A549 y en células H520 que en fibroblastos CCL206 mientras que la expresión relativa del receptor señuelo Hhip era más importante en fibroblastos de pulmón que en las células de NSCLC (Figura S6). Por lo tanto, no parece estar relacionada (en el ARNm), con la falta de respuesta del NSCLC a exógenos Shh el equilibrio entre Ptch y expresión Hhip. Como las proteínas intracelulares tales como Sufu y SPop regulan de una manera positiva y en una estabilidad de forma negativa Gli respectivamente, hemos evaluado a continuación, si un desequilibrio entre estos reguladores Gli podría explicar el que no responde de NSCLC a exógenos Shh. No hemos encontrado diferencias en la expresión relativa de Sufu en comparación con la expresión de SPop para un mismo tipo de célula (Figura S6). Por último, hemos evaluado si la expresión relativa de los receptores Hh y reguladores Gli fueron diferentes entre NSCLC y pulmonares fibroblastos por tratamiento Shh. No se encontraron diferencias en la expresión de Ptch1, Ptch2 de, Hhip, Sufu y SPop Shh tras el tratamiento, en un corto (1, 3, 8 h) o puntos de tiempo más largos (24, 48 h) (datos no mostrados).
Los fibroblastos pulmonares responden a Shh secretada por las células NSCLC H520
para probar si Shh secretada por las células escamosas H520 fue bioactivo, fibroblastos de pulmón fueron tratados con H520 sobrenadante. Esto resultó en el aumento de los niveles de ARNm y Gli1 Ptch1 en el recién nacido de ratón (Figura 5A) y en fibroblastos de pulmón humanos adultos (Figura 5B). Con el fin de evaluar si esta respuesta estaba mediada por Shh secretada por las células H520 y presente en el sobrenadante, siRNA de Shh se realizó en células H520. Esta importante disminución de cantidades Shh de ARNm y la presencia de N-Shh en el sobrenadante (Figura 5C) y, además, la reducción en un 90% los niveles de Gli1 y por 50% de los niveles de Ptch1 en los fibroblastos tratados con H520 sobrenadante (Figura 5D) .
. Fibroblastos de pulmón eran privaron de suero durante 24 horas y después se trata o no con el sobrenadante de las células H520 durante 24, 48 o 72 horas. (A) RT-qPCR se realizó para analizar Gli1, Gli2, Gli3 y los niveles de mRNA en Ptch1 CCL206 tratado con sobrenadante H520. Los resultados se presentan como veces de los niveles de ARN en las células tratadas en comparación con las células no tratadas para cada punto de tiempo. ** P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,01. (B) los fibroblastos humanos primarios de carcinoma escamoso de pulmón eran privaron de suero durante 24 horas y se trata o no con H520 sobrenadante durante los tiempos indicados. RT-PCR cuantitativa se realizó para evaluar los niveles de Gli1, gli2, Gli3 mRNA y Ptch1. Los resultados se presentan como veces de los niveles de ARNm en las células tratadas en comparación con las células no tratadas para cada punto de tiempo. * P & lt; 0,1, ** p & lt; 0,05. (C) La caída de Shh se realizó en H520 células con siRNA. La eficiencia de Shh caída en células H520 se confirmó por Western blot realizado con el sobrenadante de células H520 transfectadas con ARNsi de control negativo (NC) o con el siRNA de Shh. (D) los fibroblastos CCL206 fueron tratados durante 24, 48 y 72 horas con el sobrenadante de cualquiera de las células H520 transfectadas con un ARNsi de control negativo o con el sobrenadante de H520 células transfectadas con el ARNsi de Shh. RT-PCR cuantitativa se realizó para evaluar los cambios en los niveles de Gli1, gli2, Gli3 mRNA y Ptch1. Los resultados se presentan como veces de los niveles de mRNA (2
∧∧Ct) en células CCL206 tratado con el sobrenadante de H520 transfectadas con el ARNsi de Shh en comparación con fibroblastos tratados con el sobrenadante de H520 transfectadas con el control negativo siRNA. * P & lt; 0,1; ** P & lt; 0,05; *** P & lt;. 0,01
Shh Camino de pulmón mejora la proliferación de fibroblastos, la invasión y la deposición de colágeno
Hemos demostrado aquí que las células de NSCLC no responden marcadamente a exógenos pero Shh pueden secretar Shh bioactivo que induce la activación de la señalización de Hedgehog en fibroblastos de pulmón. Estos resultados revelan que Shh juega un papel importante en la mediación de cáncer epitelial-estromal diafonía en NSCLC. En este contexto, hemos investigado los posibles efectos biológicos de la activación de Shh en fibroblastos de pulmón. Nos hemos centrado en diferentes aspectos de relevancia en un contexto de cáncer, como la proliferación, la migración, la invasión y la remodelación de la matriz extracelular. Mientras que Shh recombinante aumenta la supervivencia celular y la proliferación celular de fibroblastos de pulmón (figuras 6A-C), la ciclopamina disminuyó él (Figuras 6D-F). Este efecto parece ser específicamente debido a la inhibición de la vía Hedgehog como tratamiento con ciclopamina correlacionado con una disminución de la expresión Gli1 y Ptch1 en CCL206 fibroblastos (Figura S7a). la proliferación de células de fibroblastos de pulmón Curiosamente, H520 sobrenadante también se ha mejorado (Figura S7B-D). Como fibroblastos han demostrado ser importante para facilitar la migración y la invasión del cáncer, fuimos en investigar el impacto de Shh en estos procesos. Los fibroblastos fueron tratados con Shh o con ciclopamina, y su migración se registró hasta 72 horas después del tratamiento. Considerando que Shh aumenta la distancia de migración de fibroblastos, la ciclopamina disminuyó significativamente (Figura 7A). Con el fin de explorar si Shh podría influir en la migración de fibroblastos después de una lesión de estímulo que puede representar mejor los cambios que se producen en el tejido tumoral, se realizaron ensayos de curación de heridas. En las células no tratadas, de fibroblastos migrado en el área de la herida de una manera progresiva, dando como resultado el cierre de heridas después de 30 horas. En las células tratadas con Shh, este proceso fue más rápido y condujo a cierre de la herida después de 26 horas (figuras 7B y C). Por el contrario, la ciclopamina disminuyó la migración de fibroblastos hacia el área de la herida y no dio como resultado el cierre de heridas (figuras 7B y C). a continuación, tratamos de investigar si Shh podría afectar a la invasión de fibroblastos. Para ello, se utilizó cultivos polarizados cubiertos con colágeno que imita mejor la matriz extracelular y por lo tanto el contexto de los tejidos. Las células se cargan en la parte superior de la transwell y medio con Shh o ciclopamina se colocó en la parte inferior, lo que permite la formación de un gradiente. El número de células transmigrando aumenta en presencia de Shh, mientras que la ciclopamina disminuyó invasión de fibroblastos a través de la membrana recubierta de colágeno (Figura 7D). Mientras que la señalización de Shh regula la migración de fibroblastos de pulmón y la invasión, se encontró ningún efecto, ya sea para Shh o ciclopamina en los ensayos de adhesión de fibroblastos (datos no mostrados). Debido a que la desorganización y los cambios en la arquitectura del microambiente del tumor son características críticas de cáncer, hemos investigado si la activación de la vía de Shh en fibroblastos de pulmón podría estar asociado con la remodelación de la matriz extracelular. Exógenos Shh aumenta la expresión de la MMP9 matriz metalopeptidasa (Figura 7E), una enzima proteolítica que juega un papel clave en la progresión del cáncer. Curiosamente, el tratamiento Shh también aumentó la síntesis de colágeno en la matriz extracelular formada por fibroblastos (Figura 7F). En conjunto, estos resultados indican que Shh provoca una respuesta en fibroblastos de pulmón que se puede correlacionar con la migración, invasión y remodelación de la matriz extracelular.
proliferación de fibroblastos de pulmón CCL206 se evaluó por recuento de células (A, D) y la supervivencia celular