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PLOS ONE: Reglamento de glucocorticoides de la ITSL /ROBO Tumor Genes Supresores en el epitelio superficial del ovario y células de cáncer ovárico


Extracto

Los tres ligandos de hendidura y sus cuatro receptores ROBO tienen papeles fundamentales en el desarrollo de mamíferos mediante la promoción de la apoptosis y rechazar la migración celular aberrante.
rendijas
y
Robos
han surgido como genes supresores de tumores candidato cuya expresión se inhibe en una variedad de tumores epiteliales. Hemos demostrado que su expresión puede ser regulada negativamente por cortisol en las células lútea ováricos normales. Tenemos la hipótesis de que después de la ovulación el cortisol producido localmente inhibiría
ITSL /ROBO
expresión en el epitelio superficial del ovario (OSE) para facilitar su reparación y que esta vía de reglamentación todavía estaba presente, y podría ser manipulado, en el ovario epitelial Células cancerígenas. Aquí hemos examinado la expresión y regulación de la vía sublingual /ROBO en OSE, las células epiteliales de cáncer de ovario y de líneas de células tumorales de ovario. Basal
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4
expresión fue menor en los cultivos primarios de cáncer ovárico epitelial las células en comparación con OSE normal (
P
& lt; 0,05) y en células SKOV-3 pobremente diferenciados en comparación con las células más diferenciadas PEO-14 (
P
& lt; 0,05). El cortisol reduce la expresión de ciertos
rendijas
y
Robos Hoteles en OSE células normales y PEO-14 (
P Hotel & lt; 0,05). Por otra parte el bloqueo de la actividad de la ITSL /ROBO reducción de la apoptosis en las células PEO-14 y Skov-3 tumorales (
P Hotel & lt; 0,05). Curiosamente
ITSL /ROBO
expresión podría incrementarse mediante la reducción de la expresión del receptor de glucocorticoides usando siRNA (
P Hotel & lt; 0,05). En general, nuestros resultados indican que en la fase post-ovulatoria un papel de cortisol puede ser para inhibir temporalmente la expresión ITSL /ROBO para facilitar la regeneración de la OSE. Por lo tanto esta vía puede ser un objetivo de desarrollar estrategias para manipular el sistema ITSL /ROBO en cáncer de ovario

Visto:. Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011) Reglamento de glucocorticoides de la ITSL /ROBO tumor genes Supresores en el epitelio superficial del ovario y células de cáncer ovárico. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10.1371 /journal.pone.0027792

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América

Recibido: 4 Abril 2011; Aceptado: 25 Octubre 2011; Publicado: 23 Noviembre 2011

Derechos de Autor © 2011 Dickinson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. WCD es apoyado por una beca de medicina clínica del escocés del Consejo de Financiación de Escocia y este trabajo fue financiado por el CSO (SCD /02). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la glicoproteína secretada de hendidura y su receptor Robo fueron identificados como importantes moléculas de guía axonal en el desarrollo de
Drosophila sistema nervioso
[1], [2]. Su papel es conservada como ITSL vertebrados (Slit1, SLIT2, SLIT3) y Robo (ROBO1, Robo2, ROBO3, Robo-4) evolutiva también inhibir la migración neuronal aberrante [3]. Sin embargo la mayoría de los miembros de los vertebrados de hendidura y ROBO familias también se expresan fuera del sistema nervioso y se han relacionado con el desarrollo de una variedad de órganos, incluyendo la glándula mamaria y de ovario [4], [5]. Durante la organogénesis la interacción SLIT /ROBO se piensa para regular numerosos procesos, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, la adhesión y migración de las células no neuronales [6], [7].

moléculas que tienen papeles importantes en el desarrollo son a menudo dysregulated en el cáncer [8]. De hecho, la
ranuras
y
Robos ¿Cuáles son candidatos genes supresores de tumores cuya expresión se reduce en numerosos tipos de células tumorales epiteliales, principalmente a través de la supresión, la pérdida de heterozigosidad y promotor de la región hipermetilación [9]. Esto incluye cánceres derivados de los tejidos reproductivos incluyendo cervical, de próstata y tumores de la línea germinal de ovario [10] - [13]. Recientes estudios funcionales también han apoyado la teoría de que las ranuras y tienen actividades Robos supresores de tumores. La vía de SLIT /ROBO promueve la muerte celular programada y /o la reducción de la proliferación de células de carcinoma de fibrosarcoma, esofágicas, hepatocelulares, colorrectal, de próstata y de mama [14] - [17]. SLIT2 también inhibió la invasión de numerosos tipos diferentes de células tumorales, incluyendo los de próstata, mama, endometrio y ovario [13], [18], [19].

La vía sublingual /ROBO ahora también ha sido demostrado tener papeles fisiológicos en los tejidos reproductivos normales [6]. señalización SLIT /ROBO parece regular la angiogénesis de la placenta y la función trofoblasto de una manera autocrina y /o paracrina [20]. Además, la mayoría de las rendijas y Robos están también regulados temporalmente durante el ciclo menstrual normal en el endometrio y se expresan en la trompa de Falopio [21]. Además hay un aumento de la expresión de la
rendijas
y
Robos Hoteles en el luteum de adultos corpus durante la fase tardía lútea del ciclo ovárico. En este momento la interacción SLIT /ROBO puede actuar para promover su desintegración mediante la estimulación de la apoptosis y la inhibición de la migración de las células lútea [22]. En el cuerpo lúteo y la expresión de endometrio rendijas y Robos están regulados por hormonas. Hubo una reducción de
ITSL /ROBO
expresión en el endometrio decidualizados del embarazo precoz [21]. Además, las moléculas luteotrófica gonadotropina coriónica humana [23] y el cortisol [24], que se incrementan en el embarazo temprano, reducen la expresión de
rendijas
y
Robos Hoteles en células lútea [22] .

Alrededor del 90% de los tumores malignos de ovario se clasifican como tumores epiteliales que se cree que se derivan de epitelio ovárico superficie (OSE) [25]. El riesgo de cáncer de ovario se correlaciona positivamente con el número de ovulaciones [26]. Así lesión recurrente y posterior reparación de la OSE durante la ovulación pueden predisponer a este tejido para neoplasia [27]. La ovulación es un evento inflamatorio interrumpir el OSE, pero que requiere resolución. Esta reparación se ve facilitada por un aumento de la producción local, el cortisol esteroide antiinflamatorio a través de la regulación de 11ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 [28].

Tenemos la hipótesis de que el OSE expresar rendijas y Robos y que el cortisol pudo temporalmente reducir la expresión de estos genes supresores de tumores para facilitar la supervivencia, proliferación y migración de estas células durante el proceso de reparación. Si este fue el caso de esta vía podría tener un papel en la progresión del cáncer de ovario y si permanece activa en las células malignas OSE puede ofrecer estrategias terapéuticas para manipular estos genes. Por lo tanto, se determinó la expresión, la localización y la regulación de la vía sublingual /ROBO en el OSE. También se examinó si las rendijas y ROBOS se expresaron de manera aberrante y hormonalmente reguladas en las células de cáncer de ovario. También se analizó la importancia funcional de una vía sublingual perturbado /ROBO en las células de cáncer de ovario.

Resultados

La vía sublingual /ROBO se expresa diferencialmente en OSE humano, las células de cáncer de ovario y de células tumorales de ovario líneas

SLIT2 y ROBO1 podrían immunolocalised a la superficie del epitelio de ovario humano normal (Fig. 1A-C). RT-PCR análisis confirmó la expresión de
SLIT2
y
ROBO1 Hoteles en cultivos primarios de OSE y demostró que había una cierta expresión de
SLIT3
,
Robo2
y
Robo-4
en estas células (Fig. 1D). a continuación, se determinó la expresión de estos genes en cultivos primarios de células malignas derivadas del fluido ascítico de las mujeres con cáncer de ovario epitelial.
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4
también se expresa en estas células, pero el análisis cuantitativo mostró que que se redujeron en un 25-82% en comparación con cultivos primarios de lo normal OSE (Fig. 2A) (
P Hotel & lt; 0,05).

a) microscopía de campo Luz de la muestra específica de ovario tinción para SLIT2 (marrón) en el OSE. B) ROBO1 Asimismo positiva (marrón) tinción también se observó en el OSE. C) No se observó tinción en los controles negativos. Las barras de escala representan 100 micras. D) RT-PCR para
rendijas
y
Robos Hoteles en MANGUERA cultivadas. Con la excepción de
Slit1
y
ROBO3
los miembros de la
ITSL
y
ROBO
familias se expresa en la manguera. FB = cerebro fetal control positivo; -RT = Control negativo negativo RT.

A) PCR en tiempo real cuantitativo muestra que aumentó
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
y
Robo4
en cultivos primarios de la manguera comparación con las células epiteliales malignas cultivadas a partir de la ascitis de pacientes con cáncer de ovario. B) RT-PCR que muestra que tanto las líneas celulares Skov-3 y PEO-14 expresaron
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
y
Robo2
. C) PCR en tiempo real cuantitativa mostrando
SLIT2
,
SLIT3
y
Robo2
transcripciones fueron más abundantes en las células bien diferenciadas PEO-14 en comparación con el SKOV- pobremente diferenciado 3 células. FB = cerebro fetal control positivo; -RT = Control negativo negativo RT; - = Control negativo de ADN negativo; * =
P Hotel & lt; 0,05; ** =
P Hotel & lt; 0,01; *** =
P Hotel & lt; 0,005

Con el fin de confirmar que las células malignas de OSE tenía una expresión reducida de
rendijas
y
Robos
examinamos su expresión en dos líneas de células tumorales de ovario diferentes. La línea celular de PEO-14 se deriva de un adenocarcinoma de ovario bien diferenciado y tiene similitudes con las células epiteliales de ovario más benignas y cáncer de ovario en estadio temprano. Por el contrario, la línea celular SKOV-3 se deriva de un adenocarcinoma de ovario pobremente diferenciados y es más característica de un tumor avanzado [29]. Ambas líneas celulares expresaron
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
y
Robo2 gratis (Fig. 2B). Sin embargo, en paralelo con nuestros resultados en el cultivo de células primarias,
SLIT2
,
SLIT3
y
Robo2
expresión se redujo entre el 58% y el 97% en el SKOV- pobremente diferenciado 3 células en comparación con los PEO-14 células bien diferenciadas (Fig 2C.) (
P
& lt; 0,05). Aunque PEO-14 y Skov-3 células pueden diferir en otros aspectos, así como su estado de diferenciación estos datos sugieren que la expresión de la
ITSL /ROBO
vía gen supresor de tumores puede reducirse durante el desarrollo o la progresión del tumor.

el bloqueo de la interacción SLIT /ROBO disminuye la apoptosis en células tumorales de ovario

el efecto de la vía de SLIT /ROBO sobre la supervivencia celular se investigó usando un ROBO1 recombinante /Fc quimera, que actúa como una trampa de ligando para inhibir la interacción ITSL /ROBO, y la inhibición directa de
SLIT2
utilizando siRNA. El tratamiento de PEO-14 y células SKOV-3 con el ROBO1 /Fc quimera no afectó a la proliferación celular (
P
& gt; 0,05, datos no mostrados). Sin embargo, tanto en las células de PEO-14 y SKOV-3 bloquea la acción de hendidura con el ROBO1 /Fc quimera reduce la apoptosis de 20 a 21%, medido por una caspasa-3 activada /7 de ensayo (
P
& lt; 0,05 ) (Fig. 3A). La transfección transitoria de
SLIT2
siRNA redujo únicamente
SLIT2
expresión tanto en las células PEO-14 y Skov-3. PEO-14 y SKOV 3-células con reducido
SLIT2
expresión tuvieron una disminución significativa 17-26% en exfoliados caspasa-3 y -7 actividades (
P Hotel & lt; 0,05, emparejados t- test) (Fig. 3B). Esto sugiere que una reducción en la vía gen SLIT /ROBO se asocia con aumento de la supervivencia celular.

A) El tratamiento con el ROBO1 /Fc quimera reduce la actividad de caspasa-3/7, en comparación con el tratamiento PBS /0,1% (w /v) BSA (control) tanto en las células PEO-14 y SKOV-3. B) La transfección con
SLIT2
siRNA redujo la actividad de caspasa-3/7, en comparación con el tratamiento con un control de siRNA revueltos. * =
P
. & Lt; 0,05

El cortisol regula negativamente la expresión de
rendijas
y
Robos Hoteles en OSE y bien diferenciado línea celular de cáncer de ovario

luego investigó si la expresión de la vía sublingual /ROBO en las células epiteliales de ovario estaba regulado. En las células de ovario humano lútea la vía de SLIT /ROBO podría fisiológicamente inhibida por cortisol [22]. A medida que el cortisol es producido localmente en el OSE, y tiene un papel antiinflamatorio después de la ovulación [30], se examinó si el cortisol podría regular la expresión ITSL /ROBO en el OSE.
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4
expresión se redujo en un 25-30% en el cortisol ( 1000 nM) tratados cultivos primarios de OSE normal (
P
. & lt; 0,05) (Fig 4A). Sin embargo, en cultivos primarios de células epiteliales malignos de cortisol no dio lugar a una reducción adicional en la expresión de estos genes (
P Hotel & gt; 0,05) (Fig. 4B)

A) real. -tiempo PCR cuantitativa que muestra que el cortisol (1000 nM), en comparación con el control de los transportistas etanol, redujo
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
y
Robo-4
expresión en cultivos primarios de manguera. B) El cortisol no alteró la expresión de
rendijas
y
Robos Hoteles en cultivos primarios de células de cáncer de ovario epitelial. C)
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
y
Robo2
expresión se redujo significativamente por el cortisol en las células más diferenciadas PEO-14. D) No obstante la expresión de éstos
rendijas
y
Robos
no estaba regulado por el cortisol en las células Skov-3 pobremente diferenciados. E) El cortisol reducido los niveles de proteína secretada SLIT2 en las células PEO-14 (secreción de control es 0,5 ng /ml). F) El cortisol no afectó a los niveles secretados de proteína SLIT2 en las células SKOV-3 (secreción de control es 0,5 ng /ml). * =
P Hotel & lt; 0,05; ** =
P
. & Lt; 0,01

Las líneas de células tumorales de ovario PEO-14 y Skov-3 también tienen el potencial de responder al tratamiento cortisol ya que expresan el receptor de glucocorticoides (GRAMO). Además expresan el receptor de mineralocorticoides (MR), pero no expresan el receptor de progesterona (PR) (Fig. 5A). En las células más diferenciadas PEO-14, el cortisol reduce la expresión de
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
y
Robo2 fotos: por: 13-31% (
P Hotel & lt; 0,05) (Fig. 4C). Además del tratamiento de cortisol reducido la concentración de proteína secretada SLIT2 en un 53% (
P Hotel & lt; 0,05) (Fig. 4E). Al igual que los cultivos celulares primarios, la regulación de estos
rendijas
y
Robos
, así como la proteína secretada SLIT2, se perdió en el Skov-3 células más malignas, y menos diferenciados, (
P Hotel & gt; 0,05) (figura 4D, F).. Esto sugiere que el cortisol puede tener un papel fisiológico en la reducción de la interacción SLIT /ROBO durante la reparación de la OSE y que esta vía puede ser todavía activo en algunos tipos de cáncer de ovario en estadio temprano.

A) RT-PCR que muestra que PEO -14 células y Skov-3 expresan
GR
y
MR
pero no
PR
. La línea celular de tumor de mama HTB-19 se usó como un control positivo y -RT se utilizó como control negativo. B) PCR en tiempo real cuantitativa que demuestra que la transfección con el
GR
siRNA reducida
GR
expresión en ambas líneas celulares en comparación con el control de siRNA sc revueltos (). C) La confirmación de que
GR
siRNA no afectó a
MR
expresión en PEO-14 y células Skov-3. D) Cuantitativo PCR en tiempo real que muestra un aumento de
SLIT2
,
ROBO1
y
Robo2
expresión después
GR
derribo por
GR
siRNA en PEO-14 células. E) Demostración de que
GR
siRNA transfectadas Skov-3 células también habían aumentado
SLIT2
y
ROBO1
expresión. * =
P Hotel & lt; 0,05

Manipulación de
rendijas
y
Robos Hoteles en células tumorales de ovario por diana es el receptor de glucocorticoides

Así, aunque los glucocorticoides tienen un efecto perjudicial teórico sobre las células de cáncer de ovario temprana, que significa que la manipulación de la GR, con el objetivo de aumentar
SLIT /ROBO
la expresión de genes, es una diana terapéutica potencial. Por lo tanto, "derribado"
GR
Uso
GR
siRNA en PEO-14 células de cortisol sensible. La transfección de la
GR
siRNA durante 48 horas causó una reducción significativa del 63% en
GR
expresión (
P Hotel & lt; 0,001) (Fig. 5B) sin influir en
MR
expresión (Fig. 5C). Esto aumentó la expresión de la
SLIT2
,
ROBO1
y
los genes supresores de tumores Robo2
(
P Hotel & lt; 0,05) (Fig. 5D). Además, la transfección de la
GR
siRNA dado lugar a una reducción similar en
GR
expresión en las células Skov-3-cortisol que no responde (
P Hotel & lt; 0,01) ( la Fig. 5B). Es importante destacar que la expresión de la
SLIT2
y
genes supresores tumorales ROBO1
también fue reforzada por
GR
siRNA transfección (
P Hotel & lt; 0,05) (Fig . 5E).

PEO-14 y SKOV-3 células fueron también tratados con mifepristona (RU486), que funciona como un antagonista de GR. RU486 tratamiento por sí solo no tuvo influencia sobre la expresión de
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
o
Robo2 Hoteles en cualquiera de las líneas de células (
P
& gt; 0,05, datos no mostrados). Sin embargo el tratamiento RU486 abolió el cortisol mediada por la regulación negativa de
ITSL /ROBO
expresión en PEO-14 células (datos no mostrados). Esto sugiere que puede haber efectos independientes de ligando de GR en la expresión de la ITSL /ROBO y confirma que incluso en pobremente diferenciado células cancerosas manipulación de GR puede regular la expresión de los genes supresores de tumores.

Discusión

en este estudio se estableció que el adulto humano normal OSE expresa, a nivel del ARN,
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2 Opiniones y
Robo-4
. El uso de inmunohistoquímica también mostramos que SLIT2 y ROBO1 también se expresan a nivel de proteínas. Como cada una de las ranuras es capaz de interactuar con cada uno de los Robos, con la posible excepción de Robo-4, es probable que la interacción SLIT /ROBO se está produciendo en el OSE. Esto no es sorprendente, ya que estas moléculas se expresan en otras células de ovario incluyendo la luteína granulosa, la luteína teca y fibroblastos células lútea del lúteo adulto corpus [22] y las células pre-granulosa y de los ovocitos de folículos primordiales en el ovario fetal en desarrollo [5 ]. Por consiguiente, el ovario normal es un sitio de la acción autocrina o paracrina fisiológicos del sistema ITSL /ROBO.

Se encontró que en OSE normal, el sistema de SLIT /ROBO puede ser regulada por el cortisol. El cortisol reduce la expresión de
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4 Hoteles en cultivos primarios de células de OSE . Hemos demostrado anteriormente que la misma concentración de cortisol puede inhibir la expresión de
SLIT2
y
SLIT3 Hoteles en cultivos primarios de células de la granulosa luteinizado y células similares a fibroblastos lútea [22]. Después de la ovulación se produce un aumento en la producción local de cortisol en el OSE que puede actuar para estimular la reparación de tejidos y la renovación [28]. En el rango de concentraciones fisiológicamente relevantes en las células de OSE cortisol se ha demostrado que tienen una acción anti-inflamatoria y puede bloquear la interleucina-1 estimula la expresión de MMP-9 [30], [31]. Además, hemos demostrado previamente que el cortisol, regulando negativamente la expresión de hendiduras y Robos, inhibe la apoptosis y facilita la migración de células [22]. Esto implica que después de la ovulación uno de los efectos de cortisol producida localmente puede ser reducir temporalmente la expresión de los genes supresores de tumores SLIT /ROBO para facilitar la reparación de la OSE dañado.

En muchos cánceres epiteliales existe una asociada pérdida de la expresión de miembros de la familia SLIT /ROBO [9]. Por ejemplo disminución de la expresión de
ITSL
y
ROBO
transcripciones se ha observado en esofágico de células escamosas, hepatocelular, de pulmón, de próstata y carcinoma de mama [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Esta reducción en la expresión sin embargo no es universal y algunos tipos de cáncer, tales como gliomas [34] y el cáncer endometrial recurrente [35] mantener o incrementar la vía de SLIT /ROBO. Sin embargo hasta ahora no se ha estudiado las alteraciones en la expresión de esta vía en las células epiteliales malignos de cáncer de ovario.

Hemos cultivado células epiteliales malignos del líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario epitelial avanzado y comparó la expresión ITSL /ROBO a que en OSE normal. Encontramos una expresión reducida de
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4 Hoteles en células malignas. Aunque creemos que estos cultivos son cultivos puros de células malignos de ovario [36], es posible que puede haber células contaminantes no malignas en algunas culturas. por lo tanto, también comparamos los PEO-14 células bien diferenciadas con las células Skov-3 pobremente diferenciados. En ambos casos, las células malignas más tuvieron una menor expresión de las ranuras y algunos de los Robos. Por tanto, es probable que el cáncer de ovario puede ser añadido a la lista de los tumores con expresión reducida ITSL /ROBO.

Nos fuimos a investigar los efectos que una vía menos activo ITSL /ROBO puede tener sobre la función de las células. Estudios recientes han implicado que SLIT2 puede inhibir la invasión de líneas celulares de tumor de endometrio y ovario [19]. También hemos demostrado que la inhibición de la señalización de la ITSL /ROBO en cultivos primarios de fibroblastos lútea promovido la migración celular [22]. Además el bloqueo de la acción SLIT en células lútea del ovario normal inhibe la apoptosis y reduce en la caspasa-3/7 actividad [22]. Hubo una reducción en la caspasa-3/7 apoptosis mediada en PEO-14 y células SKOV-3, cuando la señalización de SLIT /ROBO se inhibió mediante el bloqueo de la actividad de SLIT usando un ROBO1 /Fc quimera y síntesis SLIT2 utilizando la tecnología de siRNA. El aumento de la apoptosis, asociado con la expresión reducida de las moléculas anti-apoptóticas Bcl-XL Bcl-2 y, se observó en fibrosarcomas SLIT2 transfectadas y carcinomas de células escamosas esofágicas [16]. SLIT2 también podría inducir la apoptosis asociada con la activación de la caspasa 3 en líneas celulares de mama y tumor de pulmón [37]. En general, una reducción de la actividad ITSL /ROBO se asocia con un aumento de la supervivencia celular y la migración y esto es probable que sea relevante en el cáncer de ovario y su progresión.

Si la inhibición mediada por glucocorticoides de la vía sublingual /ROBO es todavía se manifiesta en células epiteliales malignas en cáncer de ovario a continuación, cortisol puede tener efectos sobre la supervivencia celular y la migración que serían perjudiciales para el paciente. En nuestros cultivos primarios de cáncer de ovario avanzado, así como la SKOV-3 línea celular de cáncer de ovario pobremente diferenciado, se perdió la regulación de ranuras y Robos por cortisol. Sin embargo, se mantiene en el PEO-14 línea celular de tumor más diferenciado. Esto implica que la vía puede estar todavía activa en las primeras etapas de cáncer de ovario o en fenotipos menos malignas. Es interesante que los glucocorticoides podrían inhibir la apoptosis durante el desarrollo de fibrosarcoma [38] y en líneas celulares tumorales de ovario y células del líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario [39]. La dexametasona también puede reducir la apoptosis inducida por la quimioterapia en una variedad de diferentes tipos de tumores como el de mama, próstata, células de carcinoma de cuello uterino y de ovario [40] - [42]. Por lo tanto la inhibición glucocorticoide de ranuras y Robos aún podría ser posible en algunas células malignas.

Como la sobre regulación de ranuras se ha demostrado que tienen efectos inhibidores sobre el crecimiento del tumor y la invasión es posible que la manipulación de la vía de glucocorticoides tiene utilidad terapéutica. RU486, un antagonista de GR y PR, puede inducir la apoptosis en células de próstata y cáncer de ovario [43], [44]. El bloqueo de la actividad de cortisol en PEO-14 y células Skov-3, que carecen de relaciones públicas, utilizando RU486 no influyó en la expresión de
rendijas
y
Robos Hoteles en cualquiera de las líneas de células. Sin embargo RU486 hizo abolir la regulación negativa de
ITSL /ROBO
expresión en PEO-14 células.

Más importante aún cuando inhibimos endógena de
GR
expresión, utilizando siRNA, no había un aumento en la expresión de ciertos
ranuras
y
Robos Hoteles en ambas células PEO-14 y SKOV-3. Esto implica que el
rendijas
y
Robos
podría ser regulada a nivel transcripcional, por GR y que un papel importante en el control de GR
ITSL /ROBO
expresión puede ser ligando independiente. Nuestro análisis bioinformático reveló varios elementos GR-respuesta y afines (Gres) en las regiones promotoras de
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
Robo2
y
Robo-4
. Curiosamente, en células de neuroblastoma, el GR activado interactúa directamente con p53 e inhibe p53 dependiente de la detención del ciclo celular y la apoptosis [45]. Sin embargo GR puede actuar como un supresor de tumores en otros tipos de tumores, incluyendo cáncer de piel [46]. Por lo tanto, la función exacta de los recursos genéticos en el cáncer podría depender del tipo de tumor.

En resumen, este estudio ha proporcionado una evidencia más de que la vía sublingual /ROBO tiene un papel en la fisiología ovárica normal y está regulada por hormonas, incluyendo glucocorticoides. También hemos demostrado que las ranuras y Robos parecen estar expresado de forma aberrante en el cáncer de ovario. Además la reducción de esta vía podría aumentar la génesis tumoral y la progresión a través de una desregulación de los procesos celulares, incluyendo la apoptosis y la repulsión de la migración celular. En general estos datos apoyan el concepto de que la reducción de la vía de SLIT /ROBO es importante en el desarrollo y progresión maligna. Esta investigación también sugiere que la orientación de su regulación fisiológica de esteroides puede tener utilidad en el cáncer de ovario.

Materiales y Métodos

colección de células y tejido

Todas las células y los tejidos se obtuvieron con consentimiento informado por escrito después de la aprobación del Comité de Ética de Investigación médica Lothian. Se obtuvieron células de OSE humanos de los ovarios de las mujeres premenopáusicas (n = 5) sometidos a cirugía electiva para las enfermedades ginecológicas no malignas como se describe anteriormente [29]. Se obtuvieron células epiteliales malignos del líquido ascítico de las mujeres (n = 8) que tiene la cirugía para el cáncer de ovario epitelial avanzado como se describe anteriormente [36]. tejido ovárico humano normal se había recogido para un estudio gratuito [47]. líneas celulares de la Skov-3 y PEO-14 fueron amablemente proporcionados por P. Pujol, INSERM, Montpellier, Francia y S. Langdon, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido.

Cultivo de células y tratamientos

OSE células primarias y células de cáncer de ovario primario se mantuvieron rutinariamente en medio de cultivo consiste en medio 199 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp., Gillingham, Reino Unido) (pH 7,3, 01:01 vv
-1) suplementado con 15% (v /v) de suero bovino fetal, 50 UI /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y 2 mM L-glutamina. células PEO-14 y SKOV-3 se cultivaron en el mismo medio sin embargo, se complementó con 10% (v /v) de FBS. Para las células de los estudios de tratamiento de cortisol fueron sembradas en placas de seis pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo. Después de 24 horas medio fresco que contenía 1,000 nM Cortisol [22], [30], [31] en etanol con o el volumen equivalente de etanol (0,001% v /v) se añadió a las células. En otros experimentos se utilizó 50 mM RU486 [24] (Sigma) con y sin cortisol. Cada tratamiento se realizó por triplicado técnica. Después de 24 horas se retiró 1 ml de medio de cada pocillo y se almacenaron a -20 ° C para la enzima de ensayo inmunoabsorbente ligado a experimento (ELISA) y el ARN se extrajo de las células como se describe a continuación.

Para el ROBO1 /células estudios de tratamiento Fc se sembraron a 2 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas medio fresco que contenía ya sea ROBO1 recombinante de rata /Fc quimera (amp I +; D Systems, Inc., Abingdon, Reino Unido; 1 mg /ml) o el volumen equivalente de PBS /0,1% (w /v) de BSA se añadió a la Células. Los tratamientos se llevaron a cabo por cuadruplicado técnica. Cuarenta y ocho horas más tarde las células se analizaron para la apoptosis mediante el ensayo de la caspasa 3/7-Glo como se describe a continuación.

interferencia corto tecnología de RNA

Veinticuatro horas antes de la transfección PEO-14 o células SKOV-3 se sembraron en medio libre de antibióticos para que las células eran 50% confluentes en el momento de la transfección. De interferencia corto oligonucleótidos de ARN contra GR y SLIT2 así como unos controles negativos, sin secuencia significativa similitud con las secuencias de genes humanos, se obtuvieron de Applied Biosystems (Warrington, UK). Ellos se transfectaron transitoriamente en las células utilizando el reactivo de transfección Oligofectamine de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). En resumen, los oligonucleótidos de ARNsi se diluyeron a una concentración final de 200 nM en Opti-MEM I con suero reducido Media (Invitrogen) y se combinan con Oligofectamine diluido para permitir que los complejos siRNA:Oligofectamine para formar a temperatura ambiente. Se añadió el complejo siRNA:Oligofectamine continuación gota a gota a cada pocillo y las células se incubaron entonces a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 48-72 horas. Para los experimentos de análisis de la expresión se cultivaron las células en placas de 6 pocillos y cada transfección se realizó por triplicado. Para los experimentos de ensayo de actividad de caspasa-3/7 se cultivaron las células en placas de 96 pocillos y cada transfección se realizó por cuadruplicado.

Análisis de la expresión

ARN fue extraído de cada pocillo de las células usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN Ltd., Crawley, Reino Unido) y se trató con desoxirribonucleasa I (QIAGEN). RNA se utilizó como molde para la síntesis de ADNc usando reactivos Taqman de la transcriptasa inversa (Applied Biosystems). Cebadores específicos para el
rendijas
y
Robos
se han descrito anteriormente en detalle [22]. PCR se realizó en un termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler autorizado (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA) utilizando ADN Flexi GoTaq polimerasa (Promega Ltd, Southampton, UK). El termociclo PCR consistió en una desnaturalización inicial de 5 min a 95 ° C seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, temperatura de hibridación durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 seg, y una extensión final de 10 min a 72 ° DO. Los productos de PCR se visualizaron en un 2% (w /v) en gel de agarosa con bromuro de etidio añadido.

se extrajo cuantitativa en tiempo real PCR

ARN y transcripción inversa como se describe anteriormente. Una curva estándar fue generado con diluciones seriadas de cDNA sintetizado a partir de cerebro fetal humano RNA total (Stratagene Europa, Amsterdam, Países Bajos). a continuación, la amplificación por PCR en tiempo real se realizó por duplicado reacciones de 10 l utilizando
Potencia
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando el ayuno en tiempo real instrumento sistema de PCR ABI 7500HT (Applied Biosystems) . Los cebadores usados ​​fueron los mismos que para el análisis de la expresión y se han descrito anteriormente [22]. ajustes por defecto del instrumento ABI se utilizaron para el programa de ciclismo y el análisis de la curva de fusión.

El software de análisis ABI calcula valores cuantitativos para cada muestra comparando el número de ciclo umbral de la muestra, donde el aumento de la señal asociada con exponencial

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