Extracto
Hemos informado anteriormente de que el aumento de la excitabilidad de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) contribuye al desarrollo de dolor por cáncer de hueso, lo que disminuye gravemente la calidad de vida de pacientes con cáncer. Nav1.8, un canal de sodio resistente a tetrodotoxina (TTX-R), contribuye la mayor parte de la corriente de sodio subyacente del potencial de acción carrera ascendente y representa la mayor parte de la corriente en los puntos posteriores en un tren. Especulamos que los canales de sodio Nav1.8 es un candidato potencial responsable de la excitabilidad aumentada de las neuronas DRG en ratas con dolor por cáncer de hueso. En este caso, el uso de electrofisiología, Western blot y ensayos de comportamiento, documentamos que la densidad de corriente de los canales de sodio TTX-R, especialmente el canal Nav1.8, aumentó significativamente en las neuronas DRG de ratas con dolor óseo inducida por el cáncer. Este aumento puede ser debido a un aumento de la expresión de Nav1.8 en la membrana de las neuronas DRG. Accordantly, el bloqueo de los canales de sodio Nav1.8 por su bloqueador selectivo A-803467 alivió significativamente la alodinia mecánica inducida por el cáncer y la hiperalgesia térmica en ratas. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la regulación al alza funcional de los canales Nav1.8 en la membrana de las neuronas DRG contribuye al desarrollo de dolor óseo inducida por el cáncer
Visto:. Liu XD, Yang JJ, Fang D, J Cai , Wan Y, Xing GG (2014) Regulación al alza funcional de los canales de sodio Nav1.8 en la membrana de los ganglios de la raíz dorsal neuronas contribuye al desarrollo del cáncer inducido por dolor óseo. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10.1371 /journal.pone.0114623
Editor: Charles Joseph Glorioso, Universidad de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Agosto, 2014; Aceptado: 11 de noviembre de 2014; Publicado: Diciembre 11, 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. El presente trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81371237, 31171063,81072951), la Fundación de Ciencias Naturales Pekín (7112079), el especial bases para el programa de investigación científica profesión bienestar público del Ministerio de Salud de la República Popular de China (201302013-01) y el programa "973" del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2013CB531905). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
dolor del cáncer de hueso resultante de tumores primarios o tumores que metastatizan a los huesos es uno de los tipos más graves y difíciles de dolor por cáncer, lo que disminuye la calidad de vida de los pacientes [1]. Los mecanismos que subyacen en el desarrollo del dolor del cáncer de hueso siguen siendo en gran parte desconocido.
Recientemente, nosotros y otros han encontrado que la hiperalgesia térmica y mecánica hipersensibilidad en modelos murinos de dolor del cáncer óseo se asocian con una mayor excitabilidad de las neuronas DRG nociceptivas primarias [ ,,,0],2], [3]. Las respuestas de los nociceptores a estímulos nocivos son codificadas por los potenciales de acción cuya génesis y propagación dependen de los canales de sodio dependientes de voltaje. Por lo tanto, los patrones de expresión aberrantes de estos canales y canalopatías de sodio heredados se han relacionado con el dolor neuropático e inflamatorio [4]. las neuronas DRG adultos pueden expresar tanto (TTX-S) y resistentes a la tetrodotoxina (TTX-R) canales de sodio tetrodotoxina sensibles. Entre estos últimos, el canal de sodio TTX-R Nav1.8 se expresa específicamente en las neuronas sensoriales [5], [6]. Por lo tanto, Nav1.8 es uno de los objetivos más atractivos para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos para tratar el dolor.
Nav1.8 produce una corriente de sodio TTX-R-recebado rápida inactivación lenta con la activación y despolarizada la inactivación de tensión-dependencia [6], [7]. Nav1.8 contribuye la mayor parte de la corriente de sodio subyacente del potencial de acción en las neuronas carrera ascendente que expresa el canal de [8], [9]. Las propiedades biofísicas de Nav1.8, su papel crítico en la descarga repetitiva, y su presencia en las terminaciones nerviosas libres, en los que se inicia la señalización de dolor, sugieren que Nav1.8 puede influir significativamente en los nociceptores excitabilidad, contribuyendo así al dolor. El papel de Nav1.8 en el dolor neuropático e inflamatorio está bien revisado por Dib-Hajj y col. [4]. Sin embargo, si Nav1.8 contribuye al desarrollo de dolor óseo inducida por el cáncer es en gran parte desconocida. Recientemente, Qiu et al [10] han observado un incremento en la expresión de Nav1.8 dentro de DRG en un modelo de rata de Walker 256 tumores dolor del cáncer de hueso inducida por células, lo que sugiere la posible participación de Nav1.8 en el desarrollo del hueso inducida por el cáncer dolor. En este estudio, el uso de electrofisiología, Western blot y métodos comportamiento farmacológico, aportar pruebas que muestran que la regulación positiva funcional de los canales Nav1.8 en la membrana de las neuronas DRG contribuye al desarrollo de dolor óseo inducida por el cáncer.
Materiales Métodos y
Animales
hembra adulta ratas Sprague-Dawley de 180-220 g al comienzo de los experimentos fueron proporcionados por el Departamento de Ciencias experimentales de animales, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud. Las ratas fueron alojadas en jaulas separadas con acceso libre a comida y agua. La temperatura ambiente se mantuvo a 24 ± 1 ° C bajo luz natural /oscuridad ciclo. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de conformidad con las directrices de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor [11] y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pekín.
La inoculación de células tumorales
MRMT-1 de rata células de carcinoma de glándula mamaria se cultivaron en medio que contenía RPMI 1640 (Hyclone, EE.UU.) y suero bovino fetal al 10%. Las células se liberan del plástico mediante breve exposición a 0,25% (peso /volumen) de tripsina (Gibco, EE.UU.), y luego prepararon para la inyección de la siguiente manera: las células fueron en primer lugar recogieron por centrifugación de 10 ml de medio durante 3 min a 1000 rpm . Después, el sedimento resultante se resuspendió en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las células se contaron usando un hemocitómetro. A continuación, se diluyeron las células para lograr la concentración final para la inyección y se mantienen en hielo hasta que se inyectan en animales. Un modelo de rata de dolor por cáncer de hueso fue establecido por la inyección de las células singénicas intratibial mrmt-1 como se ha descrito anteriormente [12]. En resumen, después anestesiados con hidrato de cloral (0,3 g /kg, i.p.), la tibia de la rata izquierda se expone cuidadosamente, y se insertó una aguja de calibre 23 en el canal intramedular del hueso. A continuación, se retira y se reemplaza con una aguja roma larga y delgada unida a una 10-l jeringa Hamilton que contiene el medio a inyectar. Un volumen de células de carcinoma de glándula mamaria MRMT-1 de rata 4 l (4 × 10
4) o vehículo (PBS) se inyectó en la cavidad del hueso tibial. Después de la inyección el sitio se selló con cera de hueso, y la herida se cerró. Ninguno de los animales mostró signos de disfunción motora después de la implantación de las células tumorales.
-células enteras patch clamp grabación
Las neuronas fueron aisladas de L4 y L5 DRG de ratas adultas utilizando métodos como se describe en nuestra estudios anteriores [3], [13]. Brevemente, los ganglios recién disecados se picaron y se lavan en frío, oxigenada Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma), y luego se sometieron a la colagenasa (ml, tipo IA, 3 mg /Sigma) de tratamiento durante 45 minutos, seguido por la tripsina (2 mg /ml, Tipo II-S, Sigma) durante 15 minutos a 37 ° C. La reacción enzimática se detuvo lavando las células con DMEM que contenía suero bovino fetal 10%, y las piezas restantes de los ganglios se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego y se pasa a través de un filtro de células de 40 micras. Después, la suspensión se centrifugó a 800 rpm durante 3 minutos, y el sedimento celular se resuspendió en DMEM fresco suplementado con suero bovino fetal 10%. Las células disociadas se colocaron en poli-D-lisina (0,1 mg /ml, Sigma) cubreobjetos de vidrio tratados con contenidos dentro de 4 pocillos placas de cultivo de tejidos estériles y se mantuvieron en 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C durante 2 a 3 horas antes de grabar.
grabaciones de patch clamp de células enteras de las neuronas DRG de forma aguda disociadas se realizaron usando un amplificador EPC-10 y software Patchmaster (HEKA, Freiburg, Alemania). Parche pipetas fueron sacados de capilares de vidrio de borosilicato con una resistencia punta de 5-8 mO cuando se llena con una solución interna que contiene lo siguiente (en mM): 135 CsF, 10 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA y 2 Na
2ATP. El pH se ajustó a 7,3 usando CsOH. La solución externa contenía lo siguiente (en mM): 30 NaCl, 20 TEA-Cl, 90 de colina-Cl, 3 KCl, 1 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 HEPES, 10 glucosa y 0,1 CdCl
2. El pH se ajustó a 7,3 usando Tris-base. Las corrientes de membrana se midieron con pipeta y capacitancia de la membrana de cancelación, filtrada a 2 kHz y se digitalizaron a 10 kHz.
En el modo de grabación de fijación de voltaje, las células se fijaron a -70 mV, y la resistencia en serie se compensó al 70 % -90%. La capacitancia de la membrana fue adquirido desde el amplificador por software Patchmaster para la determinación del tamaño de las células y el cálculo de la densidad de corriente. Todas las grabaciones se realizaron en pequeñas y medianas diámetro (20-35 micras), las neuronas DRG, que se sabe que expresan tanto las corrientes TTX-R de sodio [14], [15] TTX-S y. corrientes TTX-R fueron evocados desde un potencial de mantenimiento de -120 mV a los pulsos de prueba que van desde -80 a +45 mV en incrementos de 5 mV a una frecuencia de 0,2 Hz en presencia de TTX (300 nm) para bloquear todas las TTX -S canales. A la corriente de sodio Nav1.8 mediada se obtuvo con un protocolo de voltaje-clamp utilizado por Rush y Waxman [16] y Berta et al. [17] en presencia de 300 nM TTX. Impulsos de prueba que van desde -80 hasta 40 mV en incrementos de 5 mV a una frecuencia de 0,2 Hz, fueron precedidas por una etapa de pre-pulso de 500 ms a -40 mV, para inactivar TTX-R Nav1.9 actual mediada. Se utilizó la corriente de pico máxima a diversos voltajes para el análisis de la densidad de corriente. Las curvas de activación normalizada (I /I
0) se ajustaron utilizando la siguiente ecuación distribución de Boltzmann: I /I
0 = 1-1 /{1 + exp [(V
1/2-V
m) /k]}, donde I
0 es la corriente pico máximo a las diversas tensiones de prueba, V
m es el potencial de ensayo, V
1/2 es el potencial de membrana a la mitad del máximo I, y K es el factor de pendiente. La inactivación en estado estacionario dependiente de la tensión se calculó mediante la medición de la amplitud de corriente de pico provocada por un impulso de prueba de 100 ms a -10 mV después de un pre-pulso de 500 ms a potencial en el rango de -80 a 10 mV con una 20-s periodo entre pulsos. Las curvas de inactivación normalizados (I /I
0) se ajustaron utilizando la siguiente ecuación distribución de Boltzmann: I /I
0 = 1 /{1 + exp [(V
1/2-V
m) /k]}, donde I
0 es la corriente de sodio pico a pulso probado medida desde el potencial de pulso preacondicionamiento más negativo, V
m es el potencial de impulso de preacondicionamiento, V
es la media potencial de membrana en mitad de la máxima I, y k es el factor de pendiente. Análisis de los datos y la instalación se realizaron utilizando el software de Origen 8.5 (Origin Corporation, Northampton, MA).
Western blot
Las ratas fueron profundamente anestesiados con hidrato de cloral 10% (0,3 g /kg, ip) y, a continuación los GRD L4 y L5 se retiraron y se homogeneizaron inmediatamente de acuerdo con el protocolo descrito en nuestro informe anterior [18] para la extracción de proteína total y ensayo. Para citosol o membrana de extracción de proteínas y la separación, GRD tejidos se diseccionaron y se lisaron mediante homogeneización con Nucl-cito-Mem kit de preparación (Applygen, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego se ensayaron usando métodos descritos por Negro et al. [19]. Diez microgramos de proteína total se mezcló con tampón de carga 4 x y después se sometieron a SDS-PAGE. solución salina Después de bloquear con 5% de leche sin grasa en Tris tamponada con y Tween (TBST, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM y 0,05% de Tween-20) durante 60 minutos a temperatura ambiente, las membranas de PVDF se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche: anti-rata anticuerpo de conejo Nav1.8 (1:1000, Alomone Labs), ratón anti-β-actina (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), o anti-receptor de transferrina de ratón de rata (TGF) de anticuerpos (1:2000, Invitrogen). Las transferencias se lavaron en TBST y se incubaron en rábano picante de cabra anti-conejo /ratón IgG anticuerpo conjugado con peroxidasa secundaria (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce), seguido por autorradiografía usando Hyperfilm MP (Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias se escanearon con un escáner de cañón (Cannon, Inc., Japón), y las densidades de la banda se detectaron con un software Cantidad (Bio-Rad, EE.UU.). Los datos de cinco ratas fueron utilizadas para el análisis estadístico.
Implantación de catéter intratecal y la inyección de medicamentos
Para el bloqueo farmacológico de los canales de Nav1.8, se implantaron catéteres al mismo tiempo con MRMT- 1 en las células tumorales o la inoculación de PBS. Bajo hidrato de cloral (0,3 g /kg, i.p.) la anestesia, se realizó la implantación de la cánula intratecal como se describe en nuestro estudio anterior [20]. Brevemente, un catéter de polietileno PE-10 fue implantado entre la L5 y L6 vértebras para llegar a la ampliación de la madera de construcción de la médula espinal. La parte exterior del catéter estaba conectado y fijado sobre la piel en el cierre de la herida. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles. Las ratas que muestran déficits neurológicos después fueron excluidos de la implantación del catéter.
Para examinar los efectos de bloqueo farmacológico de Nav1.8 con un antagonista selectivo A-803467 (TOCRIS, Reino Unido) en ratas con cáncer de hueso, A-803.467 (50, 100 y 150 nmol) o su vehículo (DMSO al 1%) fue administrado por vía intratecal a MRMT-1 ratas en el día 14 después de la inoculación de las células tumorales cuando aparece hipersensibilidad dolor. Como control, dosis alta de A-803467 (150 nmol) o su vehículo (DMSO al 1%) también se administró por vía intratecal a PBS inoculado animales de simulación en día 14 después de la inoculación de PBS. Fármaco o vehículo se inyectaron por vía intratecal a través del catéter implantado en un volumen de 10 l de solución seguido de 10 l de solución salina normal (NS) para el lavado. Cada inyección duró al menos 5 min. Después de una inyección, la aguja se mantuvo in situ durante 2 min antes de ser retirado. Ambos comportamientos de dolor y función del aparato locomotor animales se evaluaron a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la aplicación del fármaco.
Evaluación de la alodinia mecánica
La alodinia mecánica, como un signo de comportamiento de los huesos dolor por cáncer, se evaluó midiendo 50% el umbral de retirada de la pata (PWT) como se describe en nuestros informes anteriores [3], [21]. El PWT 50% en respuesta a una serie de filamentos de von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL, EE.UU.) se determinó por el método de abajo hacia arriba y [22]. Las ratas se colocaron en un piso de malla de metal cubierta con una jaula de plástico transparente invertida (18 x 8 x 8 cm) y se dejó un período de 20 min para la habituación. Ocho filamentos de von Frey (0.224) con las fuerzas incrementales logarítmicas aproximadamente iguales de flexión se eligieron (0,41, 0,70, 1,20, 2,00, 3,63, 5,50, 8,50 y 15,10 g). Cada ensayo se inició con una fuerza de von Frey de 2,00 g entregado perpendicularmente a la superficie plantar de la pata trasera izquierda durante unos 2-3 segundos. Una retirada brusca de la pata durante la estimulación o inmediatamente después de la eliminación del pelo se registró como una respuesta positiva. Siempre que había una respuesta positiva o negativa, se aplicó el siguiente más débil o más fuerte filamento, respectivamente. Este procedimiento se realizó hasta que se habían observado seis estímulos después de la primera cambio en la respuesta. El PWT 50% se calculó utilizando la fórmula siguiente: 50% PWT = 10
(X
f
+ kδ), donde X
f es el valor del filamento final de von Frey utilizado (en unidades logarítmicas), k es un valor medido a partir del patrón de respuestas positivas /negativas, y δ = 0,224, que es el intervalo promedio (en unidades logarítmicas) entre los filamentos de von Frey [23]. Si un animal respondió al filamento más bajo von Frey, se le asignó un valor de 0,25 g. Si un animal no respondió a la más alta con filamentos de von Frey, el valor se registró como 15,0 g. sesiones de pruebas se realizaron a 0, 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la inyección de drogas.
Evaluación de la hiperalgesia térmica
hiperalgesia térmica de la pata trasera se ensayó como se describe por nuestra anterior informe [20]. Las ratas se les permitió aclimatarse durante un mínimo de 30 minutos dentro de los recintos de acrílico sobre una placa de vidrio transparente se mantuvo a 30 ° C. Una fuente de calor radiante se centró sobre la superficie plantar de la pata trasera. Las mediciones de la retirada de la pata de latencia (PWL) fueron tomadas por un temporizador que fue iniciado por la activación de la fuente de calor y se detuvo cuando se detectó la retirada de la pata con un fotodetector. Se utilizó un tiempo de corte máxima de 30 s para evitar daños en el tejido innecesario. Se tomaron tres mediciones de PWL para cada pata trasera y se promediaron como el resultado de cada sesión de pruebas. La pata trasera se puso a prueba alternativamente con más de intervalos de 5 minutos entre ensayos consecutivos.
Evaluación de la función locomotora
Se realizó prueba de la placa inclinada para la evaluación de la función locomotora de ratas recibieron A-803467 (150 nmol). La rata se colocó en sentido transversal al eje largo de una placa inclinada. El ángulo inicial de la placa inclinada fue de 50 °. entonces el ángulo se ajusta en incrementos de 5 grados. El ángulo máximo de la placa en la que la rata mantuvo su posición corporal durante 5 s sin caer se determinó según el método informado anteriormente [24].
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 5.0 paquete (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todos los datos se expresan como la media ± SEM. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) seguido de Dunnett múltiples prueba de comparación o de dos vías ANOVA seguido por el test de Bonferroni post-hoc se utilizó para comparaciones múltiples. Las diferencias con P & lt; 0,05. Se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Aumento de la corriente de sodio TTX-R en las neuronas DRG de ratas con dolor por cáncer óseo
Para explorar si TTX- los canales de sodio R contribuyen al desarrollo del dolor óseo inducida por el cáncer, que primero medimos las corrientes de sodio TTX-R grabados en aisladas de forma aguda neuronas DRG en un modelo de rata de dolor por cáncer de huesos, mediante la adición de TTX (300 nM) a la solución del baño para bloquear todos los canales TTX-sensible [25]. El protocolo de voltaje se utilizó se muestra en la Fig. 1A. Se encontró que la densidad de la corriente de sodio TTX-R aumentó gradualmente después de la inoculación de las células tumorales de una manera dependiente del tiempo. En el día 7 después de la inoculación, no se observó diferencia significativa en la densidad de la corriente de sodio TTX-R entre las neuronas de ratas tratadas con células MRMT-1 tumorales (96,67 ± 8,2 pA /pF, n = 14) y los de las ratas tratadas con PBS (97,08 ± 5,8 pA /pF, n = 15) (P & gt; 0,05, ANOVA de dos vías, figuras 1C, D y G.), lo cual es consistente con nuestros hallazgos de comportamiento previos que muestran que no había dolor de hipersensibilidad mecánica o térmica en ese tiempo [3]. Sin embargo, el día 14 después de la inoculación, la densidad de corriente de sodio TTX-R aumentó significativamente en las ratas tratadas con MRMT-1 (181,34 ± 17,2 pA /pF, n = 19) en comparación con las ratas tratadas con PBS (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (P & lt; 0,001, ANOVA de dos vías, las figuras 1E a G).. trazas representativas de la corriente de sodio TTX-R en ratas ingenuas, tratados con PBS y tratados con MRMT-1, grabadas en las neuronas DRG a los 7 y 14 días después de la inoculación de las células tumorales o PBS se muestran en las Figs. 1B a F.
(A): protocolo de voltaje que se utiliza para el registro de la corriente de sodio TTX-R con 300 nM TTX en la solución del baño. (B a F): trazas representativas de la corriente de sodio TTX-R en naïve (B), PBS-tratado (C y E) y ratas (D y F), grabadas en las neuronas DRG en 7 MRMT-1-tratado (C y D) y 14 (e y F) días después de la inoculación de las células tumorales o PBS. (G): El análisis estadístico de la densidad de corriente de pico. Tenga en cuenta que la densidad de la corriente de sodio TTX-R es significativamente mayor en las neuronas DRG de ratas con cáncer de hueso.
***
P
. & Lt; 0,001, en comparación con el grupo de PBS, ANOVA de dos vías, n = 19 (MRMT-1) y 15 (PBS) guía empresas
aumento de la corriente de sodio Nav1.8 en las neuronas DRG de ratas con dolor por cáncer óseo
Para aislar la corriente de sodio Nav1.8 de corriente total de sodio TTX-R, se utiliza otro protocolo de voltaje con un 500-ms pre-pulso a -40 mV para inactivar el canal Nav1.9 como se describe en el informe anterior [17] (Fig. 2G). Los resultados mostraron que la densidad de sodio Nav1.8 mediada actuales 14 días después de la inoculación aumentaron significativamente en las ratas tratadas con MRMT-1 (136,11 ± 10,4 pA /pF, n = 17) en comparación con las ratas tratadas con PBS (74,09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (P & lt; 0,001, ANOVA de dos vías, figuras 2D a F).. Similar a la densidad de la corriente de sodio TTX-R, la densidad de corriente Nav1.8 mediada mantuvo sin cambios en el día 7 después de la inoculación de las células tumorales (P & gt; 0,05, frente a PBS, de dos vías ANOVA, n = 11 MRMT- 1 y 12 PBS, Figs. 2B, C y F). Para investigar si las propiedades intrínsecas de los canales de sodio Nav1.8 se cambiaron después de la inoculación de las células tumorales, se examinaron tanto las curvas de activación e inactivación de las corrientes de sodio mediadas por Nav1.8 en ratas ingenuas, tratados con PBS y tratados con MRMT-1 . Como se muestra en las Figs. 2H y I, no se observó alteración significativa en cualquiera de la activación (Fig. 2H), o la inactivación (Fig. 2I) curvas entre los tres grupos, lo que indica que las propiedades intrínsecas de los canales de sodio Nav1.8 se mantuvo sin cambios después de la inoculación de tumor Células. trazas representativas de la corriente de sodio mediada por Nav1.8 en ratas ingenuas, tratados con MRMT-1 PBS y, grabadas en las neuronas DRG a los 7 y 14 días después de la inoculación de las células tumorales o PBS se muestran en las Figs. 2A a E.
(A a E): trazas representativas de la corriente de sodio mediada por Nav1.8 en naïve (A), PBS (B y D) y MRMT-1-tratadas (C y E) ratas, grabadas en las neuronas DRG en 7 días (B y C) y 14 (D y e) después de la inoculación de las células tumorales o PBS. (F): El análisis estadístico de la densidad de corriente de pico. Tenga en cuenta que la densidad de corriente de sodio mediada por Nav1.8 es significativamente mayor en las neuronas DRG de ratas con cáncer de hueso.
***
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con el grupo de PBS, ANOVA de dos vías, n = 17 (MRMT-1) y 16 (PBS). protocolo de voltaje se utiliza para el registro de las corrientes de sodio Nav1.8 mediada con 300 nM TTX en la solución del baño: (G). A 500 ms pre-pulso a -40 mV se utilizó para inactivar los canales de sodio Nav1.9. (H y I): activación e inactivación curvas de la corriente de sodio mediada por Nav1.8 en ratas ingenuas, tratados con PBS y tratados con MRMT-1 a los 14 días después de la inoculación de las células tumorales o PBS. Tenga en cuenta que ninguna alteración significativa se observa ya sea en la activación (H) o en las curvas de inactivación (I) entre los tres grupos. curvas de activación se ajustaron utilizando el mismo protocolo utilizado para la grabación de la corriente de sodio Nav1.8. Tenga en cuenta que las curvas en los grupos tratados previamente y PBS se superponen casi por completo. Las curvas de inactivación se ajustaron utilizando el protocolo descrito en los métodos.
Aumento de la expresión en la membrana de la proteína Nav1.8 en el DRG de ratas con dolor por cáncer óseo
Además, se examinaron expresión de la proteína Nav1.8 en el DRG de ratas con dolor óseo inducida por el cáncer, en particular, los canales de la membrana celular, que representan canales funcionales. Usando ensayo de transferencia Western, se encontró que la expresión de la proteína total en Nav1.8 L4 y L5 ipsilateral GRD se mantuvo sin cambios desde el día 7 al día 14 en las ratas tratadas con MRMT-1 en comparación con las ratas tratadas con PBS (P & gt; 0,05, dos ANOVA de una vía, n = 4 /grupo, Fig. 3A). Esto fue inesperado, ya que los experimentos de electrofisiología reveló un incremento de densidad de corriente de Nav1.8 en las ratas tratadas con MRMT-1 (ver Fig. 2). Especulamos que un aumento de la corriente de sodio Nav1.8 tal se debe probablemente al aumento de la expresión de Nav1.8 en la membrana celular debido a las propiedades intrínsecas de los canales de sodio Nav1.8 se mantuvo sin cambios después de la inoculación de las células tumorales (ver Figs. 2H y YO). Para aclarar esta hipótesis, se detectó aún más la expresión en la membrana de Nav1.8 utilizando un método de centrifugación a alta velocidad para aislar la fracción de membrana a partir de células DRG como se describe en el estudio anterior [19]. Como se esperaba, 14 días después de la inoculación de las células tumorales, la densidad de la banda de proteína de Nav1.8 expresada en la membrana celular aumentado notablemente en las ratas tratadas con MRMT-1 (1,45 ± 0,06, n = 6) en comparación con las ratas tratadas con PBS ( 0,87 ± 0,07, n = 6) (P & lt; 0,001, ANOVA de dos vías, la figura 3B).. Mientras tanto, la densidad de la banda de proteína de Nav1.8 se encuentra en el citosol disminuyó notablemente en las ratas tratadas con MRMT-1 (0,57 ± 0,04, n = 3) en comparación con las ratas tratadas con PBS (1,09 ± 0,02, n = 3) (P & lt; . 0,001, ANOVA de dos vías, la figura 3C)
(A):. La proteína total Nav1.8. Parte superior: representante de bandas de Western blot; Baja: el análisis estadístico de la expresión de proteínas totales Nav1.8. No hay diferencia significativa se observa en la expresión de la proteína total Nav1.8 entre los tres grupos.
P Hotel & gt; 0,05, ANOVA de dos vías, n = 4 /grupo. (B): proteína de membrana Nav1.8. Parte superior: representante de bandas de Western blot. receptor de transferrina (TfR) se utiliza como control interno. Baja: el análisis estadístico de Nav1.8 expresión de la proteína de membrana. Tenga en cuenta que la expresión de Nav1.8 en la membrana celular es significativamente mayor en las neuronas DRG de ratas tratadas con MRMT-1 en comparación con las ratas tratadas con PBS.
***
P Hotel & lt; 0,001, ANOVA de dos vías, n = 6 /grupo. (C): proteína de Nav1.8 en el citosol. Tenga en cuenta que la expresión de Nav1.8 en el citosol se reduce significativamente en las neuronas DRG de ratas tratadas con MRMT-1 en comparación con las ratas tratadas con PBS.
***
P
. & Lt; 0,001, ANOVA de dos vías, n = 3 /grupo
A-803467 alivia la alodinia mecánica y la hiperalgesia térmica de cáncer de hueso ratas
Finalmente, se investigó si a-803467, un bloqueador selectivo de Nav1.8 [26] podría aliviar el dolor de hueso inducida por el cáncer en ratas. Hemos probado PWT y PWL en el día 14 después de la inoculación de las células tumorales o PBS como la línea de base. Entonces, A-803467 o vehículo DMSO fue administrado por vía intratecal a MRMT-1 inoculados ratas de dolor del cáncer así como PBS inocularon ratas sham, y tanto el PWT y PWL se midieron a los 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la aplicación del fármaco. La raíz de dosificación e inyección de A-803467 fue de acuerdo con un informe anterior muestra que la administración intratecal de A-803 467 (50-150 nmol) reduce tanto las descargas evocados y espontánea de las neuronas de amplio rango dinámico (WDR) en el asta dorsal de la médula [27 ]. Como se muestra en la Fig. 4, la administración intratecal de A-803467 (tanto a 100 y 150 nmol) podría restaurar prominente la disminución inducida por el cáncer de hueso, tanto en PWT (P & lt; 0,05 a 0,001, vs. vehículo /grupo ratas con cáncer, de dos vías ANOVA, n = 7-8 /grupo, Fig 4A) y PWL (P & lt;. ,05-,001, vs. vehículo /cáncer ratas grupo, de dos vías ANOVA, n = 6-9 /grupo, Fig 4B) de las ratas con cáncer.. Por el contrario, incluso una alta dosis de A-803467 (150 nmol) no tuvo un efecto significativo sobre la PWL y PWT de inoculadas con PBS ratas sham (P & gt; 0,05, frente al vehículo /grupo de ratas sham, ANOVA de dos vías, n = 6 /grupo, Figs. 4A y B). Para excluir cualquier posible disfunción motora inducida por A-803467, que también examinó el efecto de la A-803 467 (a una dosis máxima de 150 nmol) en la función locomotora de ratas utilizando el test de la placa inclinada. A medida que nuestra expectativa, no se observó ninguna disfunción motora significativa en cualquier momento después de la inyección del fármaco (p & gt; 0,05, ANOVA de una vía, n = 7 /grupo, la figura 4C.). Estos datos sugieren que la inhibición de Nav1.8 por A-803467 puede rescatar la alodinia mecánica inducida por el tumor y la hiperalgesia térmica en ratas con cáncer de hueso
(A, B):. Efectos de la A-803 467 (a 50 , 100 y 150 nmol) en mecánica (a) y térmicas (comportamientos B) para el dolor en ratas evaluadas en el día 14 después de la inoculación de las células tumorales MRMT-1 o PBS. Tenga en cuenta que A-803467 restaura notablemente la reducción inducida por las células tumorales de PWT y PWL en ratas modelo de cáncer pero no tiene efecto significativo sobre la PWL y PWT en PBS inocularon ratas sham.
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P Hotel & lt; 0,05,
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P Hotel & lt; 0,01,
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P & lt
; 0,001, en comparación con el vehículo /cáncer (MRMT-1) grupo de ratas, ANOVA de dos vías, n = 6-9 /grupo. (C): Prueba inclinado de la placa. Tenga en cuenta que la administración intratecal de A-803 467 a la dosis máxima de 150 nmol no tiene ningún efecto significativo sobre la función locomotora de las ratas.
P Hotel & gt; 0,05, ANOVA de una vía, n = 7 /grupo
Discusión
regulación al alza funcional de los canales de sodio Nav1.8 en las neuronas DRG de. ratas con dolor por cáncer óseo
de acuerdo con resultados anteriores que la expresión de Nav1.8 mRNA y proteína se incrementan dentro de 4-5 lumbar DRG en un modelo animal de dolor por cáncer de hueso [10], nuestro presente estudio aportan información adicional prueba directa que demuestra una regulación al alza funcional del subtipo de los canales de sodio dependientes de voltaje Nav1.8 en la membrana de las neuronas DRG en un modelo de rata de dolor por cáncer, el cual se prueba que es necesaria para el desarrollo del dolor óseo inducida por el cáncer.
estudios biofísicos y farmacológicos han identificado que los cuatro canales de sodio periférica-específicas, incluido el NaV1.3 TTX-S y canales Nav1.7 y los canales NaV1.8 TTX-R y NaV1.9 se expresan preferentemente en las neuronas sensoriales primarias y DRG juego un papel importante en la fisiopatología de diferentes síndromes de dolor [18], [28], [29]. Entre ellos, el canal de sodio Nav1.8 se ha demostrado que es necesario para muchos tipos de dolor inflamatorio y neuropático crónico [26], [30], [31]. Sin embargo, el papel de los canales de sodio Nav1.8 en la patogénesis del dolor del cáncer de hueso es aún desconocido. Aunque Qiu et al. [10] han observado un aumento de la expresión de Nav1.8 dentro de DRG en un modelo de rata de dolor por cáncer de huesos, que no duda saca una conclusión de si o no el canal de sodio Nav1.8 aumentado contribuye al dolor óseo inducida por el cáncer. En otro estudio, Miao y colegas [32] han informado de una regulación a la baja significativa de la expresión de Nav1.8 en el DRG en un modelo de rata de dolor por cáncer. Sin embargo, el uso de oligodesoxinucleótidos antisentido (ODN) contra Nav1.8, encontraron que knock-down de expresión Nav1.8 en las neuronas DRG podría aliviar establecido comportamientos de dolor del cáncer en ratas portadoras de tumor, lo que implica un posible papel de Nav1.8 en el desarrollo y mantenimiento del dolor del cáncer de hueso. De manera inconsistente, un reciente estudio con ratones knock-out condicional ha demostrado que no se requiere ni Nav1.7 o Nav1.8 para el cáncer inducido por dolor óseo [33]. En nuestro estudio, se presentan pruebas electrofisiológicas y bioquímicas que muestra que la densidad de corriente de sodio mediada por Nav1.8 es significativamente mayor en las neuronas DRG de ratas con dolor por cáncer óseo y que este aumento es probablemente debido a un incremento en la expresión de Nav1 funcional .8 los canales de sodio en la membrana celular en lugar de cambios en las propiedades intrínsecas o expresión de la proteína total de los canales, debido a que, las corrientes de sodio junto con la densidad mejorada tanto de TTX-R y Nav1.8 mediadas por, la expresión de la proteína de membrana