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PLOS ONE: Repertorio de mejora con forma adoptiva transferidos Mujer linfocitos controla el crecimiento de pre-implantado murino de próstata Cancer


Extracto

Antecedentes

En el cáncer de próstata, los genes que codifican regulada por andrógenos, cromosoma Y antígenos codificados con y específicos de tejido pueden ser todos sobreexpresa. En el huésped adulto de sexo masculino, sin embargo, se eliminarán la mayoría de las células T de alta afinidad dirigidos a estos potenciales antígenos de rechazo tumoral durante la selección negativa. En contraste, el maduro repertorio de células T hembra debe contener abundantes precursores capaces de reconocer estas clases de antígenos de cáncer de próstata y la mediación de las respuestas inmunes anti-tumorales eficaces.

Metodología /Principales conclusiones

encuentra que las células de adenocarcinoma de próstata TRAMP-C2 singénicos se rechazan de manera espontánea en huéspedes femeninas. La transferencia adoptiva de linfocitos hembra ingenuo hosts machos irradiados que llevan células tumorales TRAMP-C2 pre-implantado ralentiza el crecimiento del tumor y media el rechazo del tumor en algunos animales. El éxito de esta transferencia adoptiva fue dependiente de la transferencia de células T CD4 y hembra independiente de la presencia de células T reguladoras que expresan CD25-en los linfocitos transferidos. Identificamos en las células T CD4 hembras estimuladas con TRAMP-C2 una respuesta dominante restringido de MHC-II a la DBY antígeno cromosoma. Por otra parte, las respuestas de células T CD8 en los linfocitos femeninos a los SPAS-1 antígeno restringida de MHC-I inmunodominantes están marcadamente aumentaron en comparación con los ratones machos. Por último, no encontramos ninguna exacerbación de la enfermedad de injerto contra huésped en los modelos adoptivos de linfocitos alogénicos no coincidentes ya sea singénicos o antígeno menor de transferencia mediante el uso de hembra en macho macho en comparación con las células masculinas.

Conclusiones /Importancia

Este estudio muestra que los linfocitos hembra adoptiva transferidos, particularmente las células T CD4, pueden controlar la derivación de células de adenocarcinoma prostático pre-implantado. Este enfoque no empeora significativamente las respuestas de injerto contra huésped que sugiere que puede ser viable en la clínica. Además, mejora el repertorio inmunológico disponibles con las células T derivadas por mujeres puede proporcionar una excelente reserva de células T reactivas con cáncer de próstata para más de aumento por combinación con estrategias de bloqueo de regulación inmune de la vacunación o

Visto:. Jenq RR, Curran MA, Goldberg GL, Liu C, Allison JP, van den Brink MRM (2012) Mejora del repertorio con forma adoptiva transferidos Mujer linfocitos controla el crecimiento de pre-implantado murino cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (4): e35222. doi: 10.1371 /journal.pone.0035222

Editor: Jonathan Powell, Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Estados Unidos de América

Recibido: 10 Enero, 2012; Aceptado: March 13, 2012; Publicado: 6 Abril 2012

Derechos de Autor © 2012 Jenq et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de los números de adjudicación R01-HL069929 (MVDB), R01-CA107096 (MVDB), R01-AI080455 (MVDB). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo también se recibió del Departamento de Defensa de los Estados Unidos: USAMRAA Premio W81XWH-09-1-0294 (MVDB), la Fundación de Investigación de Efectos de la Radiación (RERF-NIAID) (MVDB), El Centro de Terapias Experimentales del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center financiado por el Programa de Terapéutica en cáncer de próstata Sr. William H. Goodwin y la señora Alice Goodwin, La Fundación linfoma, soporte de limonada de Alex, el Centro de Investigación del cáncer Geoffrey Beene en el Centro de cáncer Memorial Sloan-Kettering, el Fondo Salomón Peter, Investigación y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a pesar de las mejoras en la detección y el tratamiento, el cáncer de próstata (CaP) sigue siendo la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos y el segundo cáncer más común en los hombres en todo el mundo. Cuando localizada, CaP suele ser curable a través de terapias de primera línea como la prostatectomía. Existen pocos tratamientos curativos, sin embargo, para el recurrente o metastásica CaP. Recientemente, sipuleucel-T, una vacuna diseñada para provocar una respuesta inmunitaria frente a la fosfatasa ácida prostática, ha demostrado mejorar la supervivencia media de los pacientes con metástasis CaP resistente a la castración [1]. El bloqueo de la molécula reguladora inmune CTLA-4 también ha mostrado promesa clínica para el cáncer de próstata [2], [3]. Desarrollo de las intervenciones inmunoterapéuticas que se dirigen a múltiples aspectos del sistema inmune en CaP puede ofrecer una mayor beneficio clínico y respuestas más duraderas. Desarrollo de intervenciones inmunoterapéuticas que se dirigen a múltiples antígenos en tapa puede ofrecer un mayor beneficio clínico y respuestas más duraderas.

Los cánceres de próstata probable que expresan una constelación de antígenos tumorales potenciales, incluyendo auto-proteínas mutadas [4], sensible a los andrógenos y sobreexpresa proteínas regulada por andrógenos [5], [6], y las proteínas específicas de tejido y masculinos y ligado expresados ​​diferencialmente [7]. Las células T en desarrollo en los hombres que reconocen cualquiera de estos antígenos relacionados con andrógenos o del cromosoma Y con alta afinidad es probable que eliminan durante la selección negativa en el timo. células T afinidad bajos que escapan a su eliminación central están a su vez, por lo general anergized través de los mecanismos de tolerancia periférica en el subsiguiente encuentro con el antígeno. Por el contrario, la hembra madura repertorio de células T debe contener una amplia frecuencia de precursores de células T capaces de reconocer todas las clases anteriores de antígenos de cáncer de próstata.

El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (alo-TPH) es un medio de alterar repertorio inmune de un paciente y la superación de los mecanismos de regulación del sistema inmune. los programas de acondicionamiento quimioterapéuticos y /o radiación rigurosos ablación sistema hematopoyético del huésped, que luego se reconstituyó con médula ósea o moviliza células madre de un donante adecuado. Estas células del donante se expanden en el paciente que da lugar a un nuevo sistema inmunológico que pueden reconocer las células malignas en el paciente como extraños en un proceso denominado el efecto injerto contra tumor (GVT) [8], [9]. GVT puede conducir a remisiones completas y duraderas en pacientes con cánceres que no se pueden curar de otro modo con la quimioterapia o la radiación. Por esta razón, allo-TPH se utiliza ampliamente en el tratamiento de una variedad de neoplasias malignas hematológicas
.
Además de mediación de los efectos GVT deseables, las células inmunes del donante pueden también atacar los tejidos del huésped normales resultantes en injerto contra huésped (EICH). GVHD tanto en las formas agudas y crónicas es una fuente importante de morbilidad y mortalidad en los receptores de alo-TPH. Elección de donante alogénico se sabe que potencialmente impacto en el riesgo de desarrollar EICH; receptores masculinos de injertos femeninos, por ejemplo, tienen un riesgo elevado de ambos EICH aguda y crónica, particularmente aquellos con donantes mujeres que han tenido múltiples embarazos [10] - [12].

La transferencia adoptiva de autóloga
ex vivo
expandido células T específicas de tumor de ingeniería tumor-infiltrante o ha mostrado potencial curativo tanto para el melanoma metastásico y leucemia linfoide crónica [13]. Estos enfoques, sin embargo, requieren una experiencia considerable y con frecuencia semanas de cultivo para expandir las células T. Mediante la transferencia adoptiva de linfocitos singénicos mujeres ingenuas en ratones macho pre-implantado con tumores de próstata, hemos tratado de poner a prueba el potencial del repertorio de células T hembra para reconocer y atacar tapa. Para mejorar la expansión de adoptivamente células transferidas, así como reducir el riesgo de GVHD y potencialmente aumentar efectos GVT, se trataron los ratones receptores con dosis no mieloablativos de la radiación, dado informes previos de que un estado quimérico mixto puede promover respuestas GVT y reducir al mínimo GVHD [14] , [15].

Resultados

ratones hembra inmunológicamente rechazar las células TRAMP-C2 adenocarcinoma prostático

En el adenocarcinoma de próstata modelo transgénico de ratón (TRAMP), los tumores que se desarrollan son inicialmente dependiente de andrógenos, pero más tarde convertido en independiente de los andrógenos, la recapitulación de la progresión normal de cáncer de próstata en los seres humanos [16]. Para nuestros estudios, hemos utilizado la línea de células TRAMP-C2 derivado de estos ratones. Estas células de CaP trasplantables forman tumores cuando se implantan en ratones C57BL6, son parcialmente sensible a andrógenos
in vitro
, y expresar una versión mutada de la proteína SPAS-1 que es la diana de la respuesta dominante de las células T CD8 [ ,,,0],17].

Nos hemos desafiado ratones hembras, ratones machos jóvenes, y los ratones machos maduros con células TRAMP-C2 y midió el crecimiento de los tumores con el tiempo (Figura 1A). Los tumores crecieron con fuerza en ratones machos adultos, pero creció más lentamente en ratones machos jóvenes quizá debido ya sea a bajos niveles de andrógenos o la falta de tolerancia inmunológica a los genes regulados por andrógenos. En ratones hembra, sin embargo, los tumores TRAMP-C2 crecieron inicialmente y luego una regresión espontánea. La capacidad de estos tumores para crecer inicialmente sugirió que su desaparición fue debido al rechazo inmunológico en lugar de una dependencia de los altos niveles de andrógenos para el crecimiento sostenido. Para confirmar esta hipótesis, se repitió el desafío del tumor en quimeras de médula ósea en el que transplantamos de células T de médula ósea agotada femenina y masculina en huéspedes femeninas. tumores TRAMP-C2 fueron totalmente rechazadas en quimeras hembra-hembra en-, mientras que en los tumores quimeras TRAMP-C2 masculino-en-femenina creció progresivamente (Figura 1B). Curiosamente, los ratones hembra trasplantados con una mezcla de médula ósea femenina y masculina también fueron incapaces de mediar el rechazo del tumor. Este experimento demuestra que estas células de cáncer de próstata no requieren niveles de andrógenos masculinos para el crecimiento sostenido
in vivo
, y que su rechazo en ratones hembra está mediada por el sistema hematolinfoide. Además, la presencia de células hematopoyéticas masculinos parece tener un efecto supresor dominante en la capacidad de las células hematopoyéticas hembra de rechazar tumores TRAMP-C2, tal vez debido a la selección negativa tímica mediada por la expresión de antígenos masculinos en células dendríticas tímicas derivadas de médula ósea.

células tumorales a) VAGABUNDO-C2 crecen progresivamente en ratones machos adultos, con una penetrancia más lenta cinética pero completo en ratones machos prepúberes, y crecen de forma breve pero luego son rechazados en ratones hembras adultas. n = 5 ratones /grupo, uno de los 2 experimentos con resultados similares. B) ratones hembra adultos se trasplantaron con mujer, hombre, o una mezcla 01:01 de las células T médula ósea agotada femenina y masculina y 10 semanas después del trasplante desafiado con tumores TRAMP-C2. n = 5 ratones /grupo, los resultados de un solo experimento. C) La prevención de inicio de la pubertad en ratones machos puede mediar retraso en el crecimiento de los tumores TRAMP-C2. ratones machos adultos castrados quirúrgicamente antes de inicio de la pubertad (4 semanas) muestran un crecimiento retardado de TRAMP-C2, mientras que la castración 1 semana antes de la exposición del tumor (7 semanas) no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral. n = 10 ratones /grupo, la curva de crecimiento del tumor y el área bajo la curva normalizada a valor de la mediana para el grupo 3 de cada experimento. Los resultados combinados de 2 experimentos.

Los resultados de los ratones quimeras macho-hembra en-implicaban también que el retardo en el crecimiento de las células TRAMP-C2 en prepúber de 5 semanas de edad, los ratones era probablemente debido a la tolerancia inmunitaria incompleta al cáncer de próstata de los adultos varones en lugar de una falta de suficientes niveles de andrógenos. Para evaluar de forma más directa para el impacto potencial de los niveles de andrógenos, así como otras diferencias inducida por la edad, desafiamos a los ratones machos adultos de la misma edad (8 semanas) que fueron castrados quirúrgicamente, ya sea temprano (a las 4 semanas de edad antes del inicio de la pubertad ), o tarde (una semana antes del desafío con tumor). Se encontró que los ratones machos adultos que no habían sido sometidos a la pubertad debido a la castración temprana mostrado retraso en el crecimiento de los tumores significativamente TRAMP-C2 (Figura 1C). Mientras que las células TRAMP-C2 son rutinariamente cultivadas en presencia de la dihidrotestosterona [16], nuestros resultados demuestran que TRAMP-C2 puede desarrollar tumores progresivos
in vivo
en ausencia de andrógenos testiculares derivados, posiblemente debido a la presencia de los andrógenos procedentes de otros órganos endocrinos tales como androstenediona producida por las glándulas suprarrenales. De hecho, el modelo de ratón TRAMP, de la que TRAMP-C2 se origina, es conocida por producir adenocarcinomas de próstata que puede progresar a pesar de la castración [18]. Nuestros datos sugieren además que, si bien existe cierto potencial para el reconocimiento inmune de los antígenos de próstata en los hombres maduros a una edad temprana, la tolerancia frente a estos antígenos de próstata se desarrolla después de la pubertad y conduce al crecimiento del tumor acelerado.

transferencia adoptiva de linfocitos Mujer en ratones macho pre-implantado células TRAMP-C2 frena el crecimiento tumoral y media en ocasiones el rechazo del tumor

Después de haber observado que el rechazo de las células de CaP en ratones hembra fue mediada por el sistema hematopoyético, nos preguntamos si la transferencia de un sistema hematopoyético femenina en ratones machos serían hacerlos resistentes a la exposición al tumor TRAMP-C2. Hemos generado quimeras de médula ósea en el que los anfitriones masculinos fueron trasplantados con la hembra de células T médula ósea agotada. A pesar de tener un sistema hematopoyético de origen femenino, tumores TRAMP-C2 crecieron fácilmente en estos ratones quiméricos (Figura 2A). Esto sugiere que las células T derivadas mujeres, son tolerantes a los antígenos de próstata cuando se desarrollan en un anfitrión masculino. La tolerancia de estas células puede ser debido tanto a timo "educación" mediada por las células epiteliales del timo radioresistant masculinos, y por los mecanismos de tolerancia periférica dedicadas cuando estas células T femeninos se encuentran con la próstata y otros tejidos masculinos.

A) El macho adulto los ratones fueron mieloablación a través de la irradiación y trasplantados con médula de células T empobrecido ósea femenina seguido de reto con TRAMP-C2 tumores 10 semanas después del trasplante. n = 5 ratones /grupo, los resultados de un solo experimento. B) los ratones machos adultos fueron irradiados subletalmente con 6 Gy y desafiados por vía intradérmica con 1 × 10
6 TRAMP-C2. Al día siguiente, los ratones recibieron una infusión de linfocitos del donante (DLI) de 3 × 10
7 esplenocitos
i.v.
. n = 10 ratones /grupo, uno de los 3 experimentos con resultados similares. células T reguladoras CD25 + C) adoptivamente-transferido no median el aumento del crecimiento del tumor observada después de macho DLI. Los ratones fueron irradiados y desafiaron al tumor como en B, y recibieron esplenocitos que eran CD25-agotado usando perlas magnéticas donde se indica. n = 10 ratones /grupo, los resultados de un solo experimento. ) las células T CD4 + D Mujer median retraso en el crecimiento de los tumores TRAMP-C2. Los ratones fueron irradiados y desafiaron al tumor como en B, y luego recibieron 1,5 × 10
7 esplenocitos que eran
in vivo
CD4-agotado, se mezcló con 1,5 × 10
7 esplenocitos que eran CD8 empobrecido, ya sea de origen masculino o femenino. n = 10 ratones /grupo, uno de los 2 experimentos con resultados similares.

Para eludir los mecanismos centrales de tolerancia, el próximo evaluó el potencial de los linfocitos maduros femeninos para transferir inmunidad anti-PAC. Estas células han sido sometidos a la selección tímica en el donante hembra antes de la transferencia, y, por tanto, debe contener células T capaces de reconocer cromosoma Y, regulado-andrógeno, específicos de tejido de próstata, y los antígenos mutacionales. Se administró a ratones macho sin mielosupresión una dosis de radiación para inducir linfopenia y crear espacio para nuestras células transferidas. Más tarde ese mismo día, los ratones fueron retados con células tumorales TRAMP-C2. Un día después, los esplenocitos ya sea macho o hembra fueron infundidas en estos ratones desafiados con el tumor. Hemos encontrado que mientras que la infusión de esplenocitos macho no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral, los esplenocitos hembra mediada por un retraso significativo en el crecimiento del tumor y la mejora de la supervivencia libre de tumor, en algunos casos conducen a completar el rechazo del tumor (Figura 2B).

Mediante la transferencia de esplenocitos totales, estamos transfiriendo células T reguladoras CD4 + CD25 + FoxP3 + (Treg) además de las células T efectoras responsables de los efectos GVT. Es posible, en particular el uso de ratones donantes masculinos, que estas células Treg pueden impedir la eficacia de los efectores transferidos. Para asegurarse de que nuestras observaciones no se ven comprometidos por la presencia de células Treg, se utilizó perlas magnéticas para agotar células T reguladoras de los linfocitos transferidos adoptivamente dejando a las células FoxP3 + menos de 1% restantes en el injerto (datos no mostrados). El agotamiento de las células Treg no mejoró la eficacia de los linfocitos de forma adoptiva transferidos hembra o macho (Figura 2C). Esto sugiere que el principal determinante de la eficacia GVT es la especificidad del antígeno de las células efectoras transferidos, y que las células Treg donantes no tienen un impacto significativo en GVT.

Para aclarar las contribuciones relativas de CD4 y las células T CD8 en la mediación de control del crecimiento tumoral por esplenocitos femeninos, se realizó un experimento de mezcla y combinación usando donantes masculinos y femeninos que se agotaron
in vivo
con anticuerpos contra cualquiera de CD4 o CD8. Curiosamente, se encontró que la transferencia de células T CD4 hembra mediadas control del tumor similar cuando transferido con las células T CD8 de cualquiera de origen masculino o femenino, mientras que las células T CD4 varones eran incapaces de mediar en el control del tumor, incluso cuando se infunde simultáneamente con las células T CD8 femeninos (figura 2D). En conjunto, estos resultados sugieren que las células CD4 T vírgenes de ratones hembra son esenciales para controlar el crecimiento de los tumores TRAMP-C2 en ratones machos, mientras que no se requieren células T CD8 femeninos.

Mujer DBY específicos de las células T CD4 potenciar la respuesta de células T CD8 contra TRAMP-C2 tumor antígenos

para confirmar que las células CD4 T juegan un papel fundamental en la dirección de la respuesta inmune hembra contra el cáncer de próstata, hemos realizado experimentos para identificar respuestas de células T contra epítopes específicos de antígenos expresado por TRAMP-C2. Anteriormente, hemos identificado SPAS-1, un antígeno en el cromosoma 2 expresada por TRAMP-C2 con una clase inmunodominante I epítopo derivado de un punto de mutación espontánea [17]. Por RT-PCR, también identificó la expresión de clase conocida I-restringido antígenos del cromosoma Y incluyendo SMCY, UTY, y EIAFIAY, así como la expresión del antígeno de cromosoma Y de clase II restringido-DBY (datos no mostrados). Se ha informado de antígenos de Y a menudo se sobreexpresa de forma selectiva en líneas celulares de CaP humanos y tumores [7]. Del mismo modo, se encontró que los genes de
SMCY
,
UTY
, y
DBY
aparecido que se sobreexpresa de forma selectiva en la línea de células TRAMP-C2 y en el que surge de forma espontánea tumores de próstata de los ratones TRAMP de próstata en comparación con B6 normal (Figura S1).

para comparar la respuesta inmune a los antígenos TRAMP-C2 que surgen en ratones machos y hembras, se utilizó una vacuna celular compuesto por irradiado TRAMP- GM-CSF que sobreexpresa células C2 (TRAMP-GM-CSF) que habíamos generado previamente y caracterizado [19]. Estamos analizarse ratones hembra macho vacunado y para CD4 y CD8 células T respuestas contra epítopos conocidos y previstos de péptidos derivados de estos antígenos. Después de re-estimulación con células dendríticas pulsadas con péptidos, se evaluó la producción de células T de IFN-γ. Se encontró que la vacunación de los ratones hembra con resultados TRAMP-GM-CSF en fuertes respuestas de células T CD4 contra DBY, mientras que los ratones machos no desarrollar respuestas medibles contra DBY, aunque las células T CD4 femeninos y masculinos tenían respuestas similares a la estimulación con anti-CD3ε /cuentas anti-CD28, o con acetato de forbol miristato (PMA) e ionomicina (Figura 3A). Probable esto es debido a la falta de tolerancia central contra DBY en mujeres, comparando con ratones macho y la alta expresión de DBY por las células TRAMP-C2. Se encontró que los ratones machos hacen montar las respuestas de células T CD8 contra los SPAS-1 antígenos mutados después de la vacunación de células TRAMP-C2. las células T CD8 femeninos, sin embargo, presentan respuestas más fuertes a SPAS-1 que en los hombres (Figura 3A), un hallazgo inesperado dado que la expresión de la SPAS-1 no es ni restringido en el género ni regulados por hormonas. Las respuestas a SPAS-1 fue dominante sobre las respuestas a otros antígenos, incluyendo antígenos del cromosoma Y SMCY, UTY, y EIAFIY, así como las respuestas al antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata (STEAP), que se había informado debido a ser inmunogénicos en ratones machos y sobreexpresados ​​selectivamente en tumores de próstata [20]. En conjunto, estos resultados sugieren que las células DBY-específicos hembra T CD4 son capaces de potenciar las respuestas de células T CD8 frente a un antígeno inmunodominante tumor que surge de una mutación espontánea.

A) La inmunización de mujeres con células TRAMP-GMCSF produce aumentada CD4 respuestas contra las respuestas DBY y CD8 contra SPAS-1. B6 ratones machos y hembras fueron inyectados por vía intradérmica con 1 × 10
6 irradiado TRAMP-GMCSF en días -9, -6 y -3 antes del sacrificio. esplenocitos CD4 + y CD8 + se purificaron con perlas magnéticas y se volvieron a estimular con CD11c + DCs esplénicas hembra pulsadas con el péptido indicado, o, alternativamente, se estimularon con anti-CD3ε /cuentas anti-CD28, o con acetato de forbol miristato (PMA) e ionomicina. concentraciones de sobrenadante de IFN-γ y otras citoquinas se ensayaron por BD serie de bolas de citometría. Los resultados de un solo experimento. B) la vacunación de ADN con SPAS-1 produce la respuesta inmune en ratones machos de forma adoptiva con linfocitos transferidos femeninos. ratones B6 machos se les dio 6 Gy de irradiación seguido por la transferencia de linfocitos adoptiva hombre o mujer. Los ratones fueron vacunados por pistola de genes con SPAS-1-expresión de plásmidos de ADN en los días 1, 7 y 13 después de la transferencia adoptiva. En el día 19, los esplenocitos se incubaron con o sin los SPAS-1 y péptidos DBY, y la producción de IFN-γ por las células T CD4 y CD8 se evaluó mediante citometría de flujo intracelular. Los resultados de un solo experimento.

Para determinar si un fenómeno similar de células DBY-T CD4 específica "ayuda" se estaba produciendo en el ámbito de la terapia celular adoptiva, transferimos cualquiera de esplenocitos macho o hembra en macho hosts y luego vacunados con un plásmido de ADN que expresa SPAS-1 mutado. Se encontró que los ratones machos que recibieron esplenocitos mujeres desarrollaron espontáneamente CD4 respuestas de células T contra DBY, evidenciado por la producción intracelular de IFN-γ. Sorprendentemente, los machos que recibieron esplenocitos femeninos desarrollado fuertes CD8 respuestas de células T a SPAS-1 de la vacunación, mientras que los machos que recibieron esplenocitos de sexo masculino tenían ninguna respuesta significativa a la SPAS-1 de la vacunación (Figura 3B). Los resultados de estos experimentos de transferencia adoptivos indican que los posibles mecanismos para un mejor control del crecimiento del tumor en los receptores de sexo masculino de los linfocitos femeninos incluyen tanto CD4 y el reconocimiento de las células T CD8 de antígenos expresados ​​por TRAMP-C2.

transferencia adoptiva de linfocitos Mujer en huéspedes lymphopenic macho no redundarán en importantes EICH

en nuestros modelos de trasplante inmunológico femenino-en-machos, se ha monitoreado activamente en busca de signos clínicos de la EICH, que pueden incluir la pérdida de peso, así como cambios en la actividad, la postura , la piel y el pelaje. No hemos visto ninguna evidencia de EICH en estos experimentos. En el ajuste de trasplante de médula ósea, sin embargo, la selección de un donante hembra puede conducir a un mayor riesgo de GVHD [10] - [12]. Con el fin de investigar más a fondo la seguridad de la terapia celular hembra adoptiva de los pacientes con cáncer de próstata, se evaluaron histológicamente en cuanto a evidencia subclínica de la EICH en dos modelos, B6 en B6 (singénico) y LP en B6 (emparejado por el MHC, alogénico menor antígeno no coinciden ), mirando a la GVHD órganos diana incluyendo el hígado, el intestino delgado y el intestino grueso. Se encontró que en la configuración singénico, en dos puntos diferentes de tiempo (días 21 y 42 después de la transferencia) linfocitos femeninos no producen significativamente más que los linfocitos EICH machos (Figura 4). En el entorno más clínicamente relevante de un modelo coincidente menor de antígeno-MHC igualado, encontramos un grado similar de EICH utilizando donantes femeninos y masculinos en ambos puntos temporales tempranos y tardíos. En general, GVHD patológica puntuaciones observadas en estos modelos de transferencia de irradiación de linfocitos subletales fueron leves en comparación con el trasplante de médula ósea MHC-coincidentes con el ajuste de las células T alogénicas (Figura 4), lo que confirma nuestras observaciones de que la EICH es leve en estos modelos, y que el uso de los linfocitos mujeres no parecen aumentar la incidencia o severidad de la EICH.

B6 ratones machos se les dio 6 Gy de irradiación seguido de un
iv
infusión de 3 × 10
7 esplenocitos, ya sea hombre o mujer, de donantes B6 LP o alogénicos singénicos. A modo de comparación, los ratones B6 hembras fueron letalmente irradiados (11 Gy) y trasplantados con 5 × 10
6 de células T células de médula ósea agotadas y 2 × 10
6 células T esplénicas purificadas de ratones B10.BR MHC-coincidentes (H2K en H2B). Los ratones se evaluaron en el día indicado para pruebas histológicas de GVHD en el hígado, el intestino delgado y el intestino grueso. Los resultados de un solo experimento.

Discusión

Aquí mostramos que la forma adoptiva transferidos linfocitos mujeres ingenuas retrasan el crecimiento de y, en algunos casos, rechazan pre-implantado el adenocarcinoma de próstata TRAMP-C2 células en subletalmente irradiados ratones machos. Un hallazgo similar también ha sido recientemente informado por Yi et. al, que también utiliza células TRAMP-C2 [21]. Se identificaron las células T como mediadores de la respuesta inmune contra el cáncer de próstata en ratones hembras y encontraron que la transferencia adoptiva de linfocitos hembras vacunadas puede llevar a un control del crecimiento de los tumores TRAMP-C2 en huéspedes masculinos. Nuestro estudio apoya sus conclusiones iniciales y se expande en ellos considerablemente mediante la identificación de mecanismos por los que el sistema inmune hembra monta respuestas superiores a cáncer de próstata. Se demuestra que las células T CD4 femeninos son mediadores esenciales de este efecto, en particular los específicos para el epítopo inmunodominante de la DBY antígeno masculino. Mientras Yi et. al encontró que los ratones hembra inmunizados con TRAMP-C2 desarrollado algunas respuestas de células T contra el tejido de próstata normal, así como la STEAP antígeno de próstata, nuestros datos demuestran que las respuestas a STEAP son relativamente menores en comparación con las respuestas a antígeno tumoral inmunodominante espontáneamente derivada mutado SPAS-1, que no se ensayó en el estudio anterior. Nuestros resultados indican que las respuestas de células T CD4 contra DBY, que son únicos a los repertorios inmunológicos femeninos, pueden aumentar notablemente las respuestas de células T CD8 contra un antígeno tumoral mutante que surge espontáneamente como SPAS-1. las respuestas de células T CD4 a DBY parecen ser particularmente robusto en el ajuste de la restricción I-Ab MHC II; células T derivadas de ratones portadores de un receptor de células T transgénico específico para el mismo epítopo DBY se han demostrado previamente capaz de respuestas de montaje contra tumores TRAMP-C2 en ratones knockout RAG [22]. Se encontró que los linfocitos femeninos en un huésped masculino también eran capaces de montar respuestas superiores a la vacunación contra la SPAS-1, en el entorno de desarrollar simultáneamente las respuestas espontáneas a DBY.

Es posible que las células T CD4 específicas para DBY puede suministrar ayuda de las células T CD8 que median la EICH, así como GVT. Sin embargo, mediante la utilización de un modelo con la irradiación subletal seguido por la transferencia de linfocitos sin co-transferencia de células madre hematopoyéticas, hemos sido capaces de minimizar notablemente los efectos de la enfermedad de injerto frente a huésped. Los ratones macho tratados con grandes dosis de linfocitos mujeres no tenían evidencia clínica de la enfermedad de injerto contra huésped y única evidencia patológica muy suave. Al mismo tiempo, sin embargo, este enfoque puede haber permitido el establecimiento de la tolerancia a los antígenos masculinos y próstata reconocidos por las células T derivadas por mujeres transferidos, limitando potencialmente la eficacia de esta estrategia y que resulta en menos ratones que rechazan completamente sus tumores.

Muchos de los recientes avances en la inmunoterapia tumoral se han centrado en cualquiera de las estrategias de vacunación o el bloqueo de los mecanismos de regulación inmune. Dos estrategias inmunes recientes que obtuvieron aprobación de la FDA incluyen la vacunación contra sipuleucel-T para CaP metastásico [1], y el bloqueo mediado por anticuerpos de la célula T negativo receptor co-estimuladoras CTLA-4 para el tratamiento del melanoma metastásico [23]. El objetivo de las estrategias de vacunación son para generar nuevas respuestas de células T anti-tumor, mientras que las estrategias de bloqueo de regulación inmune buscan para liberar las respuestas inmunes anti-tumorales endógenos que se generan espontáneamente pero restringidos e ineficaz [24]. Si bien ambos enfoques son prometedores, los datos clínicos muestran que la mayoría de los pacientes finalmente sucumben a la progresión del cáncer. Las combinaciones de los enfoques inmunes pueden ser los más prometedores. En este estudio, se identifica un tercer enfoque, a saber, la mejora del repertorio inmune mediante la transferencia adoptiva de linfocitos sexo no coinciden con una mejor capacidad de reconocer antígenos tumorales. mejora repertorio tiene el potencial de sinergia con dinámicamente tanto la vacunación tumoral y las estrategias de bloqueo de regulación inmune
.
Para el cáncer de próstata metastásico resistente a la castración, una enfermedad que sigue teniendo un mal pronóstico, se muestra que los linfocitos CD4 femeninos, en particular células T, adoptivamente transferidas en ratones machos con problemas de cáncer de próstata pueden mediar efectos sustanciales anti-tumorales. En términos de seguridad, este enfoque parece clínicamente viable como se observó que no EICH sustancial en cualquiera singénico o igualado por el MHC, mujer menor de edad alogénico no coincidentes con las transferencias de linfocitos masculinos. Los datos presentados aquí apoya una evaluación adicional de este enfoque para la inmunoterapia del cáncer de próstata y su potencial de sinergia con otros enfoques inmunoterapéuticos de apoyo.

Materiales y Métodos

Ratones

Todos los procedimientos de ratón se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del protocolo institucional en el Memorial Sloan-Kettering Cancr Center (MSKCC). Los ratones se mantuvieron según las directrices de NIH Cuidado de Animales, en virtud de los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional MSKCC que describen experimentos específicos para este estudio. ratones C57BL /6 y LP se obtuvieron del Laboratorio Jackson.

Los anticuerpos

CD4 (GK1.5) y CD8 (2,43) anticuerpos que agotan se adquirieron de Bio-Xcell. La citometría de flujo se realizó utilizando anticuerpos que reconocen el CD45 (30-F11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), IFN-γ (XMG1.2) adquiridos de BD Biosciences.

Los péptidos

Todos los péptidos utilizados fueron adquiridos de Biosíntesis, Inc. y se utiliza a una concentración final de 10 micras. péptidos CD8 incluyen SPAS-1 (244-252), SMCY (738-746), (246-254 UTY), EIAFIY (63-71) y steap (262-270, 327-335). péptidos CD4 incluyen DBY (608-622) y como control, Pep25, el MHC de clase dominante epítopo de M.
-II presentaron la tuberculosis
Ag85B [25].

Líneas Celulares

células tumorales TRAMP-C2 fueron proporcionados por el Dr. Norman Greenberg [26] y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [16]. células TRAMP-GM-CSF también se han descrito anteriormente [19].

BMT

Todos los protocolos de trasplante fueron revisados ​​y aprobados por el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center IACUC. Trasplante de protocolos se han descrito anteriormente [27].

castración quirúrgica

Los ratones fueron anestesiados y una pequeña incisión escrotal hechas para revelar los testículos. Estos fueron suturadas y se eliminan junto con el tejido adiposo circundante.

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