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PLOS ONE: SOX4 Transcriptionally Regula SEMA3 múltiple /Plexin Miembros de la familia y promueve el crecimiento del tumor de páncreas en Cancer


Extracto

semaforina señalización a través de Plexin participa con frecuencia en la tumorigénesis y la progresión maligna en varios tipos de cáncer. En particular, el papel de la señalización de semaforina en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) permanece sin explorar, a pesar de una alta probabilidad de metástasis y la mortalidad. A diferencia de otros tumores malignos epiteliales que a menudo expresan un pequeño número de genes específicos en la familia Semaforina /Plexin, cinco o más se expresan a menudo en PDAC humano. Tal expresión concomitante de estos miembros de la familia SEMA3 /Plexin no es el resultado de la amplificación del gen, pero (al menos parcialmente) de aumento de la transcripción de genes activados por SOX4 de novo expresa en PDAC. A través de la cromatina-inmunoprecipitación, ensayo de la actividad promotora de la luciferasa y la movilidad cambio de ensayo de electroforesis, SOX4 se demuestra a unirse al sitio de consenso en el promotor de cada
SEMA3
y
Plexin
gen para mejorar la actividad de transcripción. A la inversa, RNAi-desmontables de SOX4 en PDAC líneas celulares de resultados en disminución de expresión de miembros de la familia SEMA3 /Plexin y se asocia con el crecimiento del tumor restringido tanto
in vitro
y en ratones SCID. Además, demuestran que los niveles de SOX4 en paralelo con la expresión de los miembros de la familia resumió SEMA3 /Plexin (
P = 0,033
,
NPar
de Kruskal-Wallis
Uno de -
camino análisis FODA), que también se correlaciona con una pobre supervivencia en PDAC humana (
P = 0.0409
,
de Kaplan-Meier
análisis). Curiosamente, el miR-129-2 y miR-335, los cuales dirigen SOX4 para la degradación, son co-reprimida en casos PDAC humanos asociados con SOX4 hasta reguladas de una manera estadísticamente significativa. En conclusión, la revelamos un miR-129-2 (miR-335) /SOX4 /eje normativo semaforina-Plexin en el proceso tumoral en el cáncer de páncreas

Visto:. Huang HY, Cheng YY, Liao WC, Tien YW , Yang C-HJ, Hsu SM, et al. (2012) SOX4 Transcriptionally Regula SEMA3 múltiple /Plexin miembros de la familia y promueve el crecimiento tumoral en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (12): e48637. doi: 10.1371 /journal.pone.0048637

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 8 de Mayo, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: December 12, 2012

Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el fondo interno del hospital de la Universidad Nacional de Taiwán concedida a PH Huang y Huang HY (NTUH.96-M-037). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, y uno de los diez cánceres más comunes en Taiwán. El diagnóstico de la PDAC a menudo se produce sólo después de la metástasis generalizada. Como resultado, el mal pronóstico de PDAC se puede atribuir a su comportamiento biológico agresivo y su resistencia a la quimioterapia o radioterapia, lo que requiere un estudio mecanicista detallada de PDAC para el diseño terapéutico [1].

La expresión de genes y el genoma Los estudios mutacionales de ancho resultados indican que el cáncer de páncreas humano de alteración de múltiples genes que funcionan a través de un conjunto básico de al menos 12 rutas de señalización celular [2]. A través de un análisis de más de 20000 transcripciones, un promedio de 63 alteraciones genéticas en el cáncer de páncreas se ha demostrado. Los mecanismos para la expresión aberrante de cada gen específico en el cáncer de páncreas son diversos, incluyendo mutación puntual, deleción del gen, y la amplificación [2].

La expresión aberrante de clase 3 Semaforina así como de los receptores afines Plexin (PLXN ) y neuropilina (NRP) en diferentes tipos de cáncer humano indica que la señalización Plexin SEMA3-gated regula comportamientos celulares de cáncer [3], [4]. Por ejemplo, la sobre expresión de SEMA3C y Sema3E media la progresión del tumor y la metástasis en el cáncer, incluyendo adenocarcinoma humano de pulmón, cáncer de próstata, cáncer endometrioide, y adenocarcinoma mamario. Por el contrario, el
SEMA3F
y
SEMA3B
genes se eliminan con frecuencia en tumores malignos epiteliales, lo que resulta en una mayor angiogénesis [3]. Para PDAC, se ha informado sobre-expresión de NRP1 y Sema3A que se correlaciona con un mal pronóstico [5]. Sin embargo, los procesos moleculares que subyacen a dicha expresión durante la tumorigénesis PDAC no se han dilucidado, y si otros miembros de la clase 3 o Semaforina Plexin participar en la formación de cáncer de páncreas o la progresión no se conoce todavía. A continuación, se analizó la expresión de SEMA3 y Plexin /Neuropilina en el páncreas humano normal, piezas quirúrgicas PDAC, y líneas celulares PDAC. A diferencia de otros tumores malignos epiteliales que a menudo específicamente sobre-expresan un pequeño número de genes en la familia Semaforina, la mayoría de los casos PDAC más de expresar más de cinco genes relacionados con SEMA3 y Plexin. El mecanismo subyacente a la co-expresión de SEMA3 /miembros de la familia Plexin en PDAC fue investigado por tanto.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Nos confirmó que el trabajo en bloques de tejidos humanos y pares de muestras tumorales frescos /no tumorales en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del tejido y, con su consentimiento informado por escrito obtuvieron siguiendo las directrices establecidas por el tejido y el Comité de Ética en NTUH. El
in vivo
ensayo de tumorogénesis en ratones SCID se llevó a cabo bajo una aprobación emitida por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Nacional de Taiwán Escuela Universitaria de Medicina y la Facultad de Salud Pública.

caso selección

se identificaron sesenta y dos casos de adenocarcinoma ductal pancreático a través de una búsqueda de los registros patológicos registrados en el hospital de la Universidad Nacional de Taiwán (NTUH), Taiwán desde enero de 1996 hasta diciembre de 2006. Por cuantitativa en tiempo real PCR, se obtuvieron veintitrés casos de tejidos no tumorales y de tumor pancreático se congelaron pareadas. información demográfica seleccionada se recupera del registro de cáncer del hospital, como se detalla en el cuadro complementario S1.

Cultivo celular, el ARN de interferencia, y la selección de clones de células transfectadas estables

PANC-1, MiaPaca2, y células Capan-1 se adquirieron de ATCC. Todas las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO
2.

Para la interferencia de ARN, los oligonucleótidos de orientación específicos para
SOX4
gen (NM_003107.2: nt.1999-2019 y nt.1362-1382) o secuencias revueltos fueron clonados en el pSuperGFP /vector neo. Lentiviral shRNA orientación SOX4 a través de los oligonucleótidos construidos y dirigidos contra nt.4433-4453 nt.1101-1121 (NM_003107.2), respectivamente, fueron adquiridos de laboratorio central de RNAi en Taipei Sínica Academica.
PLXNA2
plásmidos siRNA fueron adquiridos comercialmente (Santa Cruz). Los clones transfectados de forma estable en plásmidos se seleccionaron por G418 (Sigma). RNAi-desmontables de cada molécula se confirmó por RT-PCR y Western blot

Antibodies, inmunohistoquímica, y Western blot

Los anticuerpos utilizados incluyen NRP1 anti-humano (R & amp; D Systems)., Sema3A, -3B, -3C, -3E, PLXNA1, -A2, -A3, -D1, NRP2, SOX4 (Santa Cruz), SEMA3F (Chemicon), la histona 3 (Millipore), Ki-67 (DAKO), ERK1 /2, fosfato ERK1 /2 (transducción de señales), PCNA, y tubulina (Calbiochem). La inmunohistoquímica y Western blot se realizaron como se describe anteriormente [6].

ensayo clonogénico agar blando, citometría de flujo, etiquetado BrdU, y ensayo in vivo tumorigénesis

Se realizaron Estos ensayos como se describe anteriormente [7 ].

la cuantificación de ARNm o micro-ARN y la cromatina immunoprecipitation ensayo (cHIP)

chip ensayos se realizaron utilizando el kit EZ Magna (Millipore) según lo indicado por el fabricante. se utilizó en tiempo real el análisis de PCR para cuantificar el ARNm o el micro-ARN como [6] se describe anteriormente. Los cebadores usados ​​fueron detallados en Materiales y métodos complementarios.

Array hibridación genómica comparada

ADN de matriz se extrajo la hibridación genómica comparativa de PANC-1, las células MiaPaca2 o ADN genómico humano femenino normal. La línea celular de ADN y el control de ADN fueron etiquetados con Cy5 o Cy3, respectivamente, a partir de experimentos por duplicado y se hibridan a las diapositivas matriz que contiene 2621 clones BAC en un promedio de resolución 1-MBP (2600 SpectralChip matriz, PerkinElmer). Las láminas fueron escaneados para Cy3 y Cy5 fluorescencia utilizando el escáner 4000B microarrays GenePix® (Molecular Devices). Las imágenes fueron analizados utilizando SpectralWare 2.2 (espectral Genómica).

Detección de K-Ras y el gen SOX4 mutación

secciones tumorales en los tejidos humanos incluidos en parafina fijado en formol recuperados fueron disecados y de- con parafina, y se extrajo el ADN genómico. Todos los cebadores utilizados se han observado en Materiales y métodos complementarios.

reportero de luciferasa ensayo

Las secuencias promotoras predichos fueron clonados en informador de luciferasa pGL3Basic vector (Promega) y se verificaron por secuenciación directa. células HeLa en placas de 24 pocillos fueron co-transfectadas con el constructo indicado más un SOX4-expresión de la construcción de ADN y el plásmido pRL-TK usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de la transfección durante 48 horas, se recogieron las células para un ensayo de actividad de luciferasa (Promega).

ensayos de movilidad electroforética (EMSA)

Nuclear extracto fue preparado a partir de células HeLa y la concentración total de proteína determinada por el reactivo de Bradford (BioRad). Para cada experimento EMSA, se utilizó 2000 cpm de
32P marcado con fragmentos de ADN de doble cadena para una reacción de unión que contiene extracto nuclear y poli-dI-dC (Sigma) a 30 ° C durante 30 min en una solución que contiene mM MgCl 5
2, 20 mM HEPES-KOH pH 7,9, KCl 60 mM, DTT 1 mM, 0,5 mg /ml de albúmina de suero bovino, 12% de glicerol y PMSF 1 mM. En el ensayo de competición, se utilizó el volumen de cinco o veinte veces de sonda fría en relación con la sonda caliente. Después de detener la reacción de unión, las muestras se sometieron a electroforesis en gel, secado al vacío, y se expusieron a película de rayos X para la detección de radiactividad.

El análisis estadístico

A emparejado
t
se utilizó la prueba-test para evaluar la correlación entre los resultados de la tinción inmunohistoquímica en tejidos tumorales y no tumorales. El impacto de los resultados de inmunohistoquímica sobre la supervivencia global de los pacientes con PDAC se evaluó mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, y las diferencias entre los subgrupos se analizaron mediante la prueba de log-rank. Se utilizó una prueba NPar de una vía para evaluar la asociación entre SOX4 (o E2F1) expresión y la intensidad de inmunohistoquímica SEMA3, PNR, o Plexins. de correlación de Pearson se utilizó para evaluar la relación entre la expresión SOX4 normalizada y el nivel microRNA (presentado como cambios veces en que se utilizó la relación entre el valor derivado de tumor frente a la que se deriva de la parte no tumoral en tejidos frescos pareadas). Una transformación log (base 10) de cada valor de la relación se lleva a cabo para lograr la distribución normal requerida para la prueba de regresión lineal. Las estadísticas se obtuvieron utilizando el software SPSS 12.0 (SPSS), y los cálculos de supervivencia de los pacientes se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad software).

Resultados

expresión concomitante de varios miembros de la clase 3 semaforinas y la complejidad de la familia neuropilina /plexin receptor en PDAC

Para investigar si SEMA3 o los receptores relacionados (plexin /neuropilina) están implicados en la carcinogénesis del cáncer de páncreas, inmunohistoquímica se realizó en 62 casos PDAC emparejado con normal de páncreas tejido. Como se muestra en la Fig. 1A, ductal pancreático normal y las células epiteliales acinares no expresan SEMA3 o Plexin. Por el contrario, las células de adenocarcinoma pancreático mostraron inmunorreactividad hacia la mayoría de los miembros de la familia y SEMA3 Plexin, y NRP1 (Fig. 1A). Más de 90% de los casos PDAC reveló fuerte inmunotinción citoplasmática o membranosa de Sema3E, y una relación variable (38% ~68%) de los casos fueron inmunorreactivas hacia Sema3A, SEMA3B, SEMA3C y SEMA3F (Tabla 1). En cuanto a SEMA3 receptores, PLXND1 y NRP1 fueron detectables en la mayoría de los PDAC, que representan el 90% de los casos. Por el contrario, NRP2 era mucho menor frecuencia expresada en PDAC (que representan el 14%), y no hubo relaciones variables de expresión de PLXNA1, PLXNA2 y PLXNA3 (31,67%, 68,85% y 66,67%, respectivamente, Tabla 1). Cuando la expresión combinada de todos SEMA3, los miembros PLXN, y NRP1 en cada caso PDAC se evaluó, se hizo evidente que la mayoría de los casos PDAC (que representan el 85,5% de las muestras) expresaron 5-10 miembros de SEMA3 /familia Plexin (fig. 1B ). En línea con la co-expresión de SEMA3 /Plexin de especímenes quirúrgicos PDAC, líneas celulares derivadas de PDAC humanos (Panc1, Capan1 y MiaPaca2 células) también expresaron varios miembros de SEMA3, Plexin y NRP1 en los niveles de transcripción y proteínas (Fig. 1C y 1D).

(A) inmunohistoquímica de los casos PDAC humanos que muestran la expresión de NRP1 y la mayoría de los miembros de la familia SEMA3 /Plexin. tejido pancreático normal no expresó ninguna SEMA3 /Plexin /NRP (en diagonal, barra de escala = 50 micras). Barra de escala = 100 micras. (B) Gráfico de barras que muestra la distribución de los números de SEMA3 /Plexin /NRP expresa en cada caso PDAC. Cincuenta y tres de cada 62 casos (85,5%) expresaron más de 5 miembros. (C) Análisis semi-cuantitativos RT-PCR de SEMA3-, Plexin- y transcripciones NRP- en líneas celulares humanas PDAC. GAPDH sirvió como control interno de carga. (D) inmunoblot del lisado de células enteras de las líneas celulares PDAC humano para detectar SEMA3 endógeno, Plexin, y NRP1. (E) representante SEMA3-, Plexin- y NRP1-inmunoreactividad en las lesiones detectadas PanIN adyacentes a carcinoma invasivo. Barra de escala = 100 micras.

Cuando se realizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en correlación con la expresión de SEMA3, Plexin o los miembros del PRN, no se encontró una asociación significativa excepción de que los casos positivos SEMA3F se muestra una supervivencia más larga y menos frecuente de metástasis de ganglios linfáticos (suplementario Fig. S1 y datos no publicados). Además, no se observó correlación entre la metástasis ganglionar y el nivel de expresión de SEMA3 o Plexin (Tabla S2). Por otra parte, RNAi mediada desmontables de un solo SEMA3 o Plexin resultó en un efecto insignificante sobre la supervivencia y la proliferación (Complementario. Fig S2B, S2C, S2D) celular. En consecuencia, ningún miembro de SEMA3 /Plexin juega un papel crucial en la formación de tumores o la progresión de la PDAC.

Dado que el cáncer de páncreas expresa cantidades variables de SEMA3 y Plexin en fuerte contraste con la no expresión en el tejido pancreático ductal normales , especuló que la expresión simultánea de SEMA3 /Plexin podría estar implicada en la tumorigénesis PDAC. Por lo tanto, el próximo examinado la expresión de SEMA3 y Plexin en lesiones cancerosas precursoras pancreáticas, en concreto, la neoplasia intraepitelial pancreáticos (PanIN). Como se muestra en la Fig. 1E, varios miembros de SEMA3 y Plexin más NRP1 ya estaban presentes en las lesiones PanIN adyacentes a los nidos tumorales neoplásicas ductal invasivo, lo que sugiere que la expresión concomitante de SEMA3 /PLXN /NRP1 se produce en las primeras etapas de la tumorigénesis PDAC.

Expresión de SOX4 en PDAC correlaciona con la expresión de genes resumido de las familias NRP1, SEMA3 y plexin

varios mecanismos podrían ser la base de la observación de que múltiples miembros de la familia y SEMA3 plexin fueron co-upregulated en PDAC. En primer lugar, los genes que codifican SEMA3 y miembros de la familia Plexin pueden co-amplificados debido a las variaciones del número de copias frecuentes en el cáncer de páncreas. Nos hemos dado cuenta que la mayoría de genes de la SEMA3 humana y familias Plexin se encuentran en el cromosoma 3 o 7 (Fig. 2A). En consecuencia, hemos utilizado gama de hibridación genómica comparativa para explorar la posibilidad de amplificación de ADN en SEMA3 y Plexin loci de genes de la familia. Como se muestra en la Fig. 2B, ningún cambio en el número de copias de ADN se observó en las regiones cromosómicas 7p12.1 (
Sema3A
locus), 7q21 (
SEMA3C
,
SEMA3D
,
Sema3E
loci) (Fig. 2B), 1q32.2 (
PLXNA2
locus), 3p21.3 (
SEMA3B
y
SEMA3F
loci), 3q21.3 (
PLXNA1
y
PLXND1
loci), o 10p12 (
NRP1
locus) (suplementario Fig. S2A). Se observó amplificación de ADN equívoca en la región Xq28 del cromosoma única, donde
PLXNA3
reside complementaria (Fig. S2A). loci

gen (A) de cada ser humano
SEMA3
,
Plexin
, y
NRP
gen. (B) serie representativa CGH en el cromosoma 7 con ADN genómico extraído de células PANC-1 y MiaPaca2, respectivamente, en comparación con el ADN humano normal genómico (puntos azules y la línea: Experimento hacia delante, línea celular versus control; puntos rojos y la línea: Experimento de revertir , control frente a la línea celular). se observó alrededor de
Sema3A
,
3C
,
3D
,
3E
y
PLXNA4
loci de genes (indicado por rectángulo de color verde y la flecha). (C) SOX4 se expresa en líneas celulares de PDAC. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron utilizando anticuerpo anti-SOX4 y a inmunotransferencia con SOX4 o un anticuerpo de control IgG. (D) de inmunohistoquímica SOX4 y E2F1 en casos PDAC humanos. SOX4 y E2F1 se detectaron tanto en PanIN de diferentes grados y adenocarcinoma invasivo, pero no en ductal normal y epitelio acinar o en la pancreatitis crónica. Barra de escala = 100 micras. (E) de suma de rangos de intensidad de la tinción de SEMA3 /Plexin /NRP1 se correlaciona con la expresión SOX4 en casos PDAC. La tinción de cada sección se anotó 1-3 para clasificar su intensidad como débil, media o fuerte. Las puntuaciones de todos SEMA3 /Plexin /NRP1 inmunotinción para cada caso se suman y se correlacionaron con la expresión SOX4 (análisis unidireccional NPar de Kruskal-Wallis). La mediana (línea dentro de la caja), los valores máximo y mínimo (líneas superior e inferior fuera de la caja, respectivamente) para cada grupo se muestra en el diagrama de caja.

Otra alteración común en las células cancerosas está silenciando de los genes supresores de tumores por hipermetilación [8]. Aunque SEMA3F y SEMA3B son generalmente considerados como supresores de tumores y metilados
SEMA3F
se ha informado en los cánceres de pulmón [9], es neo-expresión en lugar de la supresión de la expresión SEMA3 /Plexin que se observa generalmente en PDAC (ver Tabla 1). Además, islas ricas en CpG para la modificación de la metilación no siempre se encuentran en las regiones promotoras previstas de SEMA3 genes de la familia /Plexin (según lo predicho por el Programa de EMBOSS cpgplot). Como resultado, el próximo investigó la posibilidad de que la co-expresión de SEMA3 /miembros de la familia Plexin /NRP en PDAC es causada por la neo-expresión de algunos genes (s) de control maestro crucial para la tumorigénesis de PDAC, posiblemente factor de transcripción (s) que podrían interactuar con un motivo presente en el promotor de cada SEMA3 /Plexin gen /NRP de unión al ADN consenso. Varios candidatos, incluyendo E2F1, GATA6, y Sox2, se obtuvieron a través de una búsqueda en la literatura. El factor de transcripción E2F1 podría activar
NRP1
la transcripción en la corteza del ratón bajo el cambio isquémico [10]. Ratón
SEMA3C
y
PLXNA2 ¿Cuáles son los objetivos directos de GATA6 durante el desarrollo cardíaco [11]. Por último,
SEMA3C
y
se informó que los genes blanco directo de SOX4 [12] NRP1
. De acuerdo con ello, se intentó localizar el sitio de unión SOX4 en el consenso [(A /T) (T /A) CAA (A /T) G], el sitio GATA6 de unión [(A /T /C) GAT (A /T ) (a)], y el sitio de unión al E2F1 [TTT (C /G) (C /G) CGC] en promotores previsto para cada SEMA3 y Plexin de genes [12] - [15]. Tal como se recoge en el cuadro complementario S3, todo SEMA3, Plexin, y los genes NRP poseer al menos un supuesto sitio de unión SOX4 y un sitio de unión de E2F1 en las regiones promotoras predichos.

La presencia de la SOX4 putativo y E2F1 sitios de unión en el promotor del gen y cada SEMA Plexin nos llevó a examinar la expresión SOX4 y E2F1 en los tejidos PDAC humanos y líneas celulares. La inmunotransferencia mostró expresión en células MiaPaca2 SOX4 (Fig. 2C) PANC-1 y. Para muestras PDAC humanos, inmunohistoquímica reveló que el 76,4% de los PDAC humana expresada SOX4, y el 87,9% expresó E2F1 (Fig. 2D). Por el contrario, las células acinares y ductales epiteliales del páncreas normal y la pancreatitis crónica no fueron inmunorreactivas para SOX4 o E2F1. Por otra parte, SOX4 y E2F1 ya se detectaron en PanIN de diferentes grados (Fig. 2D), lo que sugiere que SOX4 y E2F1 son de novo expresa en los primeros procesos de PDAC tumorigénesis.

Para explorar la relación entre la expresión de SOX4 o E2F1 y la de SEMA3 /Plexin /NRP1 en pacientes con PDAC, que clasificó a la intensidad de la tinción de cada SEMA3 y Plexin como un número de 0-3 (0, negativo; 1, débil; 2; moderada; 3, fuerte) y analizado suma de rangos de cada paciente frente SOX4 o E2F1 expresión.
NPar
de Kruskal-Wallis
Uno de -
manera
análisis mostraron diferencias significativas en la suma de rangos de SEMA3, Plexins y NRP1 tinción entre los casos SOX4-positivos y negativos SOX4 (
P = 0,046
) (Fig. 2E). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia cuando la expresión E2F1 se consideró como la variable (
P
= 0,9121). La expresión altamente correlacionada de SOX4 con miembros de la familia SEMA3 /Plexin /NRP1 en PanIN humana y PDAC sugiere que SOX4 podría funcionar como un factor de transcripción maestro para dirigir la expresión de los genes SEMA3 y Plexin en la formación de cáncer de páncreas.

SOX4 activa la transcripción de genes SEMA3 y plexin

para demostrar que SOX4 podría regular la actividad de transcripción de los genes SEMA3 y plexin en PDAC, lo primero que investigó si SOX4 podría unirse al promotor predicho de cada gen y SEMA3 plexin. inmunoprecipitación de la cromatina realizado en células PANC-1 mostró que SOX4 de hecho unido al promotor de cada SEMA3 y el gen Plexin (Fig. 3A y 3B). se observaron importantes de plegado aumentos en la actividad de luciferasa en el constructo dirigido por el promotor derivado de SEMA3 y el gen Plexin cuando se transfecta en células HeLa que expresan SOX4. Además, co-transfección de un vector SOX4 expresan mejora aún más la actividad del promotor (Fig 3C, P & lt;. 0.001), que se atenúa cuando se mutó los sitios de unión SOX4-consenso (AACAATG a AACAAAA y TACAATG a mutaciones TACAAAA) ( Fig. 3D). ensayo de cambio de movilidad Del mismo modo, la electroforesis mostró que la proteína extraída a partir de núcleos que contienen SOX4-retardó la migración de una sonda de ADN radiomarcada compuesto de
SEMA3
o
Plexin
secuencias promotoras de una manera dependiente de la concentración . Este efecto se alivia específicamente por una sonda marcada con frío compuesta de secuencias de unión SOX4 en el consenso y podría ser supershifted por la adición de anticuerpos SOX4 (Fig. 3E). A la inversa, el agotamiento de SOX4 en las células Panc1 RNAi mediada (66% y la reducción de 78% en proteínas SOX4 para siSOX4#1 y siSOX4#2, respectivamente, Fig. 3F) dio como resultado una disminución concomitante en los niveles de ARNm y de proteína de más SEMA3 /plexin miembros de la familia y NRP1 (Fig. 3G y 3H). En conjunto, estos resultados sugieren que SOX4 podría funcionar como un factor principal para activar la transcripción de genes SEMA3 y Plexin simultáneamente, dando lugar a la expresión de SEMA3 múltiple y miembros de la familia Plexin en células de cáncer pancreático.

representante (A) punto final de PCR de inmunoprecipitación de la cromatina (chIP) utilizando un anticuerpo contra SOX4 en las células PANC-1. Los ADN genómicos se amplificaron con los conjuntos de cebadores después de proteínas unidas fueron digeridos con proteinasa K. Los resultados mostraron una unión de chip SOX4 a la región genómica que alberga sitios de unión en el promotor SOX4 previsto de más
SEMA3
y
Plexin
genes. (B) Cuantificación de los resultados de chip en (A), n & gt; = 3. Cada carril en la figura 3A se le dio un valor medido por densitometría y normalizado con el valor de IgG. eficiencia ChIP se define como porcentaje del valor derivado de PCR de SOX4-inmunoprecipitado con respecto al de entrada genómico total.
Las barras de error
, la desviación estándar (SD) de al menos por triplicado. (C) aumento de la actividad de la luciferasa de construcciones que contienen
SEMA3
- o
Plexin
- promotor en ausencia (barras blancas) o en presencia (barras grises) de co-expresado SOX4 en comparación con el promotor pGL3-Basic control. Las construcciones que albergaban un sitio de unión SOX4-consenso se transfectaron transitoriamente en células HeLa que contiene SOX4. Se muestran las proporciones de expresión de luciferasa de luciérnaga a la expresión de luciferasa de Renilla (expresado a partir del plásmido co-transfectadas), medida 48 h después de la transfección, normalizados a la relación media de la pGL3-Basic. Las barras de error muestran SD, n & gt; = 4. El estudiante de
t-test
, *,
P Hotel & lt; 0,01; **,
P Hotel & lt; 0,001. En presencia de co-transfectadas SOX4, la actividad de luciferasa dirigido por cada
SEMA3
- o
Plexin CD - promotor se ve aumentada aún más (barras grises) en comparación con (barras blancas) transfectadas de manera simulada y controles . (D) la actividad transcripcional de
PLXNA2
promotor impulsado por SOX4 se atenúa cuando se mutan los sitios de unión SOX4 en el consenso. secuencia de ADN en caja, el sitio consenso de unión a SOX4; Línea inferior con la sombra de las letras, los sitios de unión SOX4-mutados. El gráfico de barras muestra que la mutación de cualquiera de los sitios de unión SOX4-causado disminución significativa en la actividad de luciferasa impulsado por
PLXNA2
promotor en presencia de SOX4 sobreexpresa. Las barras de error, SD, n = 5. Estudiante de
t-test
, *,
P Hotel & lt; 0,01; **,
P Hotel & lt; 0,001. (E) EMSA muestra que la migración de un fragmento de ADN radiomarcada derivada de la
PLXNA2
promotor está retardado por HeLa extracto nuclear bruto que contiene SOX4-de una manera dependiente de la concentración. La señal de banda de retraso unido a proteínas (puntas de flecha) se redujo específicamente por sondas frías que contienen secuencias consenso de unión SOX4 y era super desplazado por el anticuerpo anti-SOX4 (punta de flecha vacía). Asterisco, las señales de unión no específica; flecha, sonda radiomarcada de las Naciones Unidas de ruedas. (F) caída efectiva de ARNi SOX4 endógena en las células PANC-1 que se muestra por inmunotransferencia SOX4. El valor indicado es la intensidad relativa normalizada medida por densitometría (La relación SOX4 /tubulina para las células revueltos-siRNA se define como 1.). Dos clones estables siSOX4 etiquetados como siSOX4#1 y#2 siSOX4 se construyeron con el oligonucleótido de orientación dirigidos contra diferentes secuencias de nucleótidos en
SOX4
gen (siSOX4#1, NM_003107.2 nt.1999-2019; siSOX4#2 , NM_003107.2 nt.1362-1382). (G) La inmunotransferencia en células SOX4 empobrecido muestra una disminución concomitante en la cantidad de proteína de NRP1, SEMA3- y miembros de la familia Plexin-. Tubulina se utilizó como un estándar para la normalización en la cuantificación de cada carril medido por densitometría. La relación indicada era el valor normalizado en las células siSOX4 en relación con el valor normalizado en las células-siRNA revueltos. (H) PCR en tiempo real para cuantificar la expresión de ARNm de
SEMA3 Opiniones y
PLXN
genes en células SOX4 empobrecido en relación con las células revueltos siRNA-SOX4-abundantes (como se muestra por cambio de tapa). Estudiante de
t-test
, *,
P Hotel & lt; 0,01; **,
P
. & Lt; 0,001

agotamiento de RNAi mediada por SOX4 suprime el crecimiento tumoral
in vitro
y
in vivo


Para investigar cómo afecta SOX4 tumorigénesis en las células PDAC, se examinó por primera vez el efecto de la caída SOX4 sobre la proliferación celular y la progresión del ciclo celular. Se demostró que el número total de células viables se redujo significativamente en las células SOX4-desmontables cultivadas
in vitro
durante tres días (Fig. 4A). la progresión del ciclo celular y la apoptosis se compararon cuantitativamente entre las células SOX4-suprimido y -competent, y no hay diferencia significativa se observó por citometría de flujo o ensayo de TUNEL desafiado por el agente genotóxico (Fig. 4B y 4C). Por el contrario, la proliferación de SOX4-suprimido células (siSOX4 siSOX4#2#1 y) fue obviamente disminuyó, como menos Ki-67 inmunoreactividad y se observaron mucho menos etiquetado BrdU en las células siSOX4 (Fig. 4D), lo que indica que el número de células entrar en el ciclo celular se reduce cuando se agota SOX4. Este hallazgo sugiere que SOX4 podría funcionar para facilitar la proliferación celular cuando se expresa en células de cáncer pancreático. La proliferación celular

(A) se ve afectada en las células PANC-1 con RNAi-supresión de SOX4. 30000 células se sembraron en cada pocillo en una placa de 12 pocillos. A los 24, 48 o 72 horas después de la siembra, las células se recogieron y se contaron mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano.
Las barras de error
, SD de seis experimentos independientes, Estudiante de
t-test
. (B) Representante de citometría de flujo de células siSOX4 teñidas con yoduro de propidio muestra ninguna variación significativa de las células revueltos-siRNA en la apoptosis (representado por la sub-G1) o en la progresión del ciclo celular. El porcentaje de células en sub-G1, G0 /G1, S y G2 /M fase se muestra en la esquina derecha hacia abajo de cada parcela. (C) representante de TUNEL-etiquetado de las células expuestas por el cisplatino como agente genotóxico (10 g /ml, 12 h). Las diferencias en la apoptosis no se observó entre las células (revueltos-siRNA) SOX4-desmontables (siSOX4#1 y#2 siSOX4) y el control. (D) menor tasa de proliferación celular y la disminución del número de células que se alojan en la fase M en las células siSOX4. siSOX4 y células revueltos-siRNA se sembraron en cubreobjetos y se incubaron durante 48 horas. Antes de la cosecha y la fijación con paraformaldehído, las células se incubaron con 10 M de BrdU durante 3 horas y luego se sometieron a anti-Ki-67 o la tinción de inmunofluorescencia anti-BrdU. Veinte campos de alta potencia seleccionados al azar (x400) se contaron para el análisis estadístico (de Student
t-test
). (E) xenoinjerto de tumor de células siSOX4 /PANC-1 se hace más pequeño que el de las células de control (revueltos-siRNA) en un ratón SCID. Los ratones se sacrificaron 30 días después de la inoculación subcutánea de las células de control a la izquierda y las células siSOX4 en el lado derecho del flanco. (F) xenoinjertos de tumores más pequeños y ligeros de células siSOX4 en comparación con los de control (n = 9, Estudiante de
t-test
). (G) representante de H & amp; E etiquetado, Ki-67, phh3 immunostain, y TUNEL en secciones de tejido de xenoinjertos tumorales. Barras de escala = 50 m. (H, I y J) la cuantificación de la proliferación (Ki-67 etiquetado), la apoptosis (TUNEL tinción) y la mitosis (phh3-immunostain). Dieciocho campos seleccionados al azar (x200) en cada sección Ki-67-manchado y células en veintisiete campos seleccionados al azar (x400) para el etiquetado TUNEL o immunostain phh3 fueron contados en cada tumor de xenotrasplante. El índice de proliferación y los mitótico de las células tumorales siSOX4 son significativamente más baja que la de las células de control, mientras que el porcentaje de células apoptóticas no difirió (de Student
t-test
). n, el número total de células contadas.

El uso de un
in vivo
tumorigénesis ensayo, también hemos demostrado que los tumores que crecen a partir de células SOX4-suprimido eran mucho más pequeños en tamaño y peso en comparación con los que crecen a partir de células SOX4-competente de control (Fig. 4E y 4F). Como se muestra en la Fig.

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