Extracto
Objetivos
transductor y activador de la transcripción 3 (STAT3) juega un papel importante en la invasión de células tumorales y la metástasis. El objetivo del presente estudio fue investigar los efectos de la caída de STAT3 en xenoinjertos de ratones desnudos de las células de cáncer de páncreas y la expresión del gen subyacente.
Métodos
Un vector lentiviral shRNA STAT3 se construyó y se infectaron en células SW1990. QRT-PCR y de inmunotransferencia Western se realizaron para detectar la expresión de genes. ensayos de xenoinjerto de ratón desnudo se utilizaron para evaluar los cambios en los fenotipos de estas células estables in vivo. HE tinción se utilizó para evaluar la invasión de células tumorales y la inmunohistoquímica se realizó para analizar la expresión génica.
Resultados
STAT3 shRNA expresión silenciado con éxito de STAT3 ARNm y proteínas en las células SW1990 en comparación con las células control. La tasa de crecimiento de las células tumorales STAT3-silenciado en ratones desnudos se redujo significativamente en comparación con los tumores en vector de control y los tumores de células generadas por los padres. La invasión tumoral en el recipiente y el músculo también fueron suprimidas en los tumores STAT3-silenciado en comparación con los controles. Colágeno IV fue completa y continua que rodea los tumores de células SW1990-STAT3 silenciados, mientras que la expresión de colágeno IV fue incompleta y discontinua que rodea a los tumores de control. Por otra parte, la densidad de microvasos fue significativamente menor en los tumores de STAT3-silenciado que los tumores de los padres o de control de las células SW1990. Además, MMP-7 expresión se redujo en los tumores de STAT3-silenciado en comparación con xenoinjertos SW1990 parentales y controles. En contraste, la expresión de IL-1β y IgT7α no se alteró.
Conclusión
Estos datos demuestran claramente que STAT3 desempeña un papel importante en la regulación del crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis, que podría ser actúan reduciendo la MMP-7 expresión en células de cáncer de páncreas
Visto:. Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang T, Cao J, et al. (2011) STAT3 Derribo Reduce la invasividad de las células del cáncer pancreático y MMP-7 Expresión en ratones desnudos. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10.1371 /journal.pone.0025941
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de mayo de 2011; Aceptado: September 13, 2011; Publicado: 3 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca (núm 09QA1404600) otorgado por fondo de investigación científica de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad letal y es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los países occidentales [1]. Los datos más recientes estiman que 43.140 nuevos casos se diagnosticaron en 2010, con aproximadamente 36.800 muertes asociadas en los Estados Unidos [2]. Aunque la resección quirúrgica ofrece una cura potencial, el cáncer de páncreas a menudo se diagnostica en las etapas avanzadas debido a la falta de síntomas o síntomas no específicos, por lo que la cirugía imposible. La quimioterapia paliativa podría mejorar la calidad de vida y potencialmente afectar a la supervivencia. Estos han dado lugar a un pronóstico muy sombrío para los pacientes con cáncer de páncreas, es decir, la supervivencia media es de aproximadamente 3 a 6 meses y 5 años de supervivencia es & lt; 5%. Los factores de riesgo para el cáncer de páncreas incluyen el tabaquismo, el consumo de alcohol, las dietas altas en carnes rojas, pero baja en verduras y frutas, pancreatitis crónica, y la historia familiar. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables del desarrollo del cáncer de páncreas no han sido aclaradas y no existen pautas establecidas para la prevención del cáncer de páncreas. Por lo tanto, nuevos enfoques para diagnosticar el cáncer de páncreas temprano para asegurar una terapia eficaz son drásticamente necesario.
El transductor de señal y activador de la transcripción de genes (STAT3) es un miembro de la familia de proteínas de factores de transcripción STAT. En respuesta a las citoquinas y factores de crecimiento, miembros de la familia STAT son fosforilados por las quinasas asociadas al receptor, formando homo- o heterodímeros y translocación en el núcleo de las células que se unen a ADN y regulan la expresión de los genes diana. STAT3 se activa mediante fosforilación de la tirosina 705 y la serina 727 en respuesta a varias citoquinas y factores de crecimiento (tales como interferón, EGF, y las interleucinas). STAT3 desempeña un papel importante en la mediación de diversos procesos celulares (por ejemplo, el crecimiento celular, la apoptosis y la diferenciación) [3]. Estudios anteriores han demostrado que la proteína oncogénica STAT-3 fue activado constitutivamente en muchos cánceres humanos [4] - [6]. En contraste, la inhibición de la vía de señalización STAT-3 suprime la invasión de células de cáncer en varios tipos de cáncer [7] - [9]. En el cáncer de páncreas, la activación de STAT-3 promueve el crecimiento de células tumorales, invasión y metástasis, lo que lleva a la mala supervivencia del paciente. Molecularmente, STAT3 puede regular la expresión de VEGF y MMP-2 genes [10] - [11]. Estos dos genes, junto con MMP-7, MMP-9, bFGF, IL-1β y IgT7αα están estrechamente relacionados con la progresión del tumor (angiogénesis, invasión y metástasis) [12] - [14]. En el presente estudio, se utilizó el lentivirus shRNA STAT3 para silenciar la expresión de STAT3. los datos anteriores de nuestro grupo sugiere que desmontables de STAT3 inhibió la invasión de las células SW1990 de cáncer de páncreas
in vitro
y marcadamente disminuido VEGF y MMP-2 expresión [7]. En el presente estudio, se investigó si el silenciamiento de STAT3 en células de cáncer de páncreas modula el crecimiento de células tumorales y la invasión en xenoinjertos de ratones desnudos y se determinaron los mecanismos de señalización subyacentes que implica el uso de una micromatriz de ADNc.
Materiales y Métodos
cultivo celular y la infección por lentivirus
La línea celular de cáncer pancreático humano SW1990 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de bovino fetal suero (FBS) y penicilina /estreptomicina a 37 ° C en un 5% CO
2 y 95% incubadora de aire. Para silenciar la expresión de STAT3, se construyó un vector lentiviral shRNA llevar STAT3 como se describe anteriormente [7]. células SW1990 (1 × 10
5) se sembraron en cada pocillo y se cultivaron en placas de 6 pocillos y después se infectaron con un vector lentiviral control negativo (Genechem, Shanghai, China) o el vector lentiviral llevar STAT3 shRNA a una multiplicidad de infección (MOI) de 40. Después de tres días, las células se sometieron a
in vivo
ensayo de invasión.
cuantitativa en tiempo real reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (QRT-PCR)
El ARN total fue aislado de las células de los padres y SW1990 SW1990 por vectores infectados vector control o STAT3 negativos utilizando el reactivo Trizol de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El ARN se purificó usando un kit RNeasy Mini de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Después de la cuantificación, 1 g de ARN total de cada muestra se sometió a síntesis de ADNc de primera cadena usando un kit de PrimeScript RT Reactivo (Takara Bio Inc, Shiga, Japón) a 37 ° C durante 15 min y 85 ° C durante 5 s.
qPCR se realizaron entonces para detectar la expresión de genes con estos ADNc sintetizado de nuevo. Los cebadores específicos para la reacción de PCR fueron como sigue: MMP-9, 5'-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 '(hacia delante) y 5'-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3' (inverso) con un tamaño de producto de 118 pb; MMP-7, 5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 '(hacia delante) y 5'-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3' (hacia atrás) con un tamaño de producto de 169 pb; IL1-β, 5'-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3 '(hacia delante) y 5'-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3' (hacia atrás) con un tamaño de producto de 239 pb; bFGF, 5'-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3 '(hacia delante) y 5'-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3' (hacia atrás) con un tamaño de producto de 224 pb; IgTα7, 5'-GCGGCCACTCGGTCTGTGTGGAC-3 '(hacia delante) y 5'-GGAGACTGTAGGACAAGGTCAC-3' (hacia atrás) con un tamaño de producto de 303 pb; ß-actina, 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 '(hacia delante) y 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3' (hacia atrás) con un tamaño de producto de 294 pb. qPCR amplificaciones se realizaron con el Sistema de ADN del motor Opticon (Bio-Rad, Foster City, CA, EE.UU.) con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara). Específicamente, 1 l de mezcla de reacción de transcripción inversa se utilizó para una reacción de PCR cuantitativa en un volumen total de 20 l. ciclos de PCR fueron 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Estos datos se analizaron a continuación de acuerdo con el método comparativo Ct y los niveles de expresión normalizados a ß-actina dentro de cada muestra. los niveles relativos de expresión de los genes diana, tras la normalización de una secuencia endógena, estuvieron a cargo de 2
-ΔΔ
Ct
.
También realizamos serie de experimentos de PCR en un RT
2 Profiler tumor humano Metástasis PCR array (HAP-028A) de SuperArray Bioscience (Frederick, MD, EE.UU.). Esta matriz contiene 89 genes y cinco "genes de limpieza" en una placa de 96 pocillos. Hemos utilizado esta matriz para detectar desmontables de la expresión del gen STAT3 mediada de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada reacción incluyó 40 ng de ARN total y los controles negativos apropiados (sin transcripción inversa y sin molde). Las muestras fueron analizadas por triplicado, y los datos se normalizaron a los niveles de GAPDH utilizando el método ΔΔCt.
La extracción de proteínas y Western inmunoblot
Las células se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Beyotime, Haimen, Jiangsu, China) que contiene 1 mmol /L de fluoruro de fenilmetanosulfonilo en hielo durante 15 min. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Los lisados se mezclaron con tampón de carga de muestra SDS-PAGE y se hirvieron durante 5 min. 30 g de proteína celular total a continuación se resolvió en 8% o 10% en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron teñidas con 0,5% Ponceau S que contiene ácido acético al 1% con el fin de evaluar la igualdad de la carga y la eficiencia de transferencia. Las membranas fueron bloqueadas en el 5% de leche desnatada bovina durante la noche y con el anticuerpo primario durante 4 h a temperatura ambiente. Después del lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las membranas se incubaron adicionalmente con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente. Para detectar las bandas de proteína positivos, se utilizó el reactivo de quimioluminiscencia de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: MMP-7 desde amp I +; D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.) a una concentración de 2 mg /ml, MMP-9 de Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.) a una dilución de 1:2000 , bFGF, IL1-β y IgTα7 de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.) a una dilución de 1:200, STAT-3 de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.) a una dilución de 1:1000; y β-actina de Biomart (Shanghai, China) a una dilución de 1:1000. Los anticuerpos secundarios fueron conjugados con peroxidasa de AffiniPure de cabra anti-ratón o anti-IgG de conejo de Jackson ImmunoResearch (West Baltimore Pike West Grove, PA, EE.UU.).
experimentos con ratones desnudos
Seis semanas de edad SPF BALB /c ratones desnudos masculinos grado fueron adquiridos por el Instituto de Zoología de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Estos ratones fueron alimentados con una dieta estándar de roedores y agua
ad libitum
en una sala aséptica de flujo laminar con 60% -70% de humedad a 25 ° C. Dos semanas después de la llegada, 50 soluciones de células que contienen l (2 × 10
6 células tumorales fase de crecimiento logarítmico) fueron inyectados en la almohadilla de la uña de los ratones por vía subcutánea. entonces Los ratones se observaron diariamente para consumo de la dieta, las heces y el estado mental, y el tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada cinco días. La longitud y la anchura del tumor se midieron con calibres Vernier y se calculan utilizando una fórmula del volumen del tumor = longitud x anchura
2 × 0,5. El uso de animales en este estudio se compila con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Este estudio fue aprobado por la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (Licencia#SYXK2009-0086).
inmunocitoquímica e inmunohistoquímica
Las células tumorales cultivadas en cubreobjetos de vidrio se lavaron con PBS por triplicado y se fijaron con 4% de formaldehído. La actividad peroxidasa endógena de las células fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3%. Los cubreobjetos se incubaron a continuación con 1% de albúmina de suero bovino en PBS durante 1 h a temperatura ambiente y con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con un anticuerpo secundario durante 30 min. Los cubreobjetos fueron counterstained con solución de hematoxilina.
Para la tinción inmunohistoquímica, 4 micras se cortaron secciones de parafina de tejido bloques fijados con formol y luego deparaffinized en xileno y rehidratada en lavados sucesivos de etanol. Las secciones se calentaron a continuación en un horno microondas a una potencia media durante 8 min en tampón de citrato, pH 6,0 para la recuperación de epítopo inducida por calor. Las secciones se sometieron a bloqueo de la actividad peroxidasa endógena y de unión no específica del anticuerpo primario y luego dirigirse a la localización de proteínas con el primer anticuerpo y la visualización con la reacción de anticuerpos y color secundario como se describe anteriormente.
Los anticuerpos primarios incluye: MMP-7 de R & amp; D Systems a una concentración de 10 mg /ml; colágeno IV o PECAM-1 a partir de Bioworld Tecnología (Louis Park, MN, EE.UU.) a una dilución de 1:100. Los anticuerpos secundarios fueron de cabra anti-ratón o anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de Dako Envision (Dako Corp., Carpinteria, CA).
Se revisaron las células tumorales y las secciones de parafina teñidas y obtuvo usando un microscopio de luz por un patólogo cegado al grupo de tratamiento. La positividad de las células tumorales teñidas en cubreobjetos y secciones de parafina se define por intensidad de la tinción y el% de células tumorales: la intensidad de la tinción de MMP-7 expresión se clasificó semicuantitativamente en negativo y débil, moderada y fuertemente positivas (0, +, ++ y +++, respectivamente). En nuestro estudio, la expresión génica se consideró positivo si la intensidad de la tinción fue moderada o fuerte y el porcentaje de células teñidas positivas eran & gt; 20%. Sin embargo, la densidad de microvasos tinción positiva para PECAM-1 se definió como positiva a 400 de potencia de un microscopio de campo como se describe anteriormente [15].
Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS software de 12.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Los datos se resumieron como media ± desviación estándar cuando sea posible y se analizaron mediante una prueba de Student-Newman-Keuls para determinar la significación estadística. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Desmontables expresión de STAT3 usando STAT3 shRNA
Para demostrar el papel de STAT3 en el cáncer de páncreas, hemos realizado experimentos de genes desmontables utilizando. STAT3 en células SW1990 shRNA. Se determinó que la STAT3 shRNA golpeó con éxito por la expresión de STAT3 en células SW1990, es decir, QRT-PCR datos mostraron que STAT3 shRNA vector inhibe la expresión de ARNm de STAT3 en comparación con los vectores de control (
P
= 0,004), mientras que los datos inmunotransferencia mostró la proteína STAT3 se inhibió notablemente en las células transfectadas con shRNA SW1990 STAT3 (
P
= 0,003) (Figura 1).
a, QRT-PCR. células SW1990 estables STAT3 shRNA y de control transfectadas con el vector y las células SW1990 parentales se hicieron crecer y se aisló ARN para el análisis de QRT-PCR de la expresión de mRNA STAT3 *
P
& lt; 0,01 en comparación con células transfectadas con vector SW1990 o de control. B, inmunotransferencia Western. Estas células fueron cultivadas para la extracción total de proteína celular y los análisis de inmunotransferencia Western de expresión de la proteína STAT3.
Supresión del crecimiento y la invasión de las células SW1990 transfectadas con shRNA STAT3 en ratones desnudos
Hemos inyectado STAT3 desmontables o de control de las células estables en la almohadilla de la uña de ratones desnudos. 10 días después de la inoculación del tumor, se encontró que la tasa de crecimiento de las células tumorales STAT3-silenciado se redujo significativamente (Figura 2). También se encontró que la expresión de la proteína colágeno IV que rodea las células tumorales en los tumores de control era incompleta y discontinuo, mientras que fue completa y continua en los tumores de células SW1990 STAT3-silenciado siguientes tinción inmunohistoquímica (Figura 3A & amp; B). capacidad de invasión de células tumorales se detectó en xenoinjertos de tejidos teñidos con HE by microscopio de luz. Además, la invasión tumoral en el recipiente y el músculo fue más frecuente en los tumores de control que los tumores STAT3-silenciado (Figura 4). El porcentaje de recipiente y el músculo invasión por tumores STAT3-silenciado fue 22,22% (2/9) y 33,33% (3/9) en comparación con 60% (6/10), 80% (7/10) y 70% (7 /10), 80% (8/10) en el tumor SW1990 y tumor de control negativo, respectivamente. la densidad de microvasos fue significativamente menor en los tumores de STAT3-silenciado que los tumores de los padres o de control de las células SW1990 (
P = 0,007
y
P = 0,021
, respectivamente; Figura 5). Estos datos indican que STAT3 desempeña un papel crucial en la regulación del crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis
.
vector de los padres o el control y las células SW1990 transfectadas con shRNA STAT3 se hicieron crecer en cultivo celular y se inyectaron en las almohadillas de uñas de ratones nude . El volumen del tumor se midió cada cinco días hasta 30 días después de la inoculación de células tumorales .. *
P
. & lt; 0,05 en comparación con el vector de control o tumores parentales
Los xenoinjertos tumorales de control de vectores y células transfectadas con shRNA STAT3 fueron sometidas a tinción inmunohistoquímica de la proteína del colágeno IV. Estos datos sugieren que la expresión de colágeno IV (flecha roja) es completo y continuo en el tumor silenciada-STAT-3 (A), sin embargo la integridad de colágeno IV fue destruido evidencia por (flecha roja) incompleta y discontinua tinción (B). × 400 magnificación.
Estos xenoinjertos de ratones desnudos fueron tomadas de tejidos procesados para la tinción HE. A y B, x 400 aumentos, C y D, x 100 aumentos. invasión de células tumorales en el microvasos es frecuente en los tumores de control de vectores (marcado en rojo en la flecha A), pero no es evidente en los tumores de STAT3-silenciada (B). El músculo fue invadido y destruido (flecha negro) por las células tumorales (flecha roja) de células SW1990 en C, pero el límite es clara entre el músculo (flecha negro) y el tumor (flecha roja) en el D.
las secciones de tejido de xenoinjertos de ratón desnudo se tiñeron para inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-PECAM-1. PECAM-1 microvasos positivos en tumores se contaron bajo un microscopio y se resumen. El número de microvasos fue 13,00 ± 2,36 por campo de gran aumento (N = 9) en los tumores de STAT3-silenciada en comparación con 16,30 ± 2,45 (N = 10) en los tumores SW1990 parentales y 15,80 ± 2,57 (N = 10) en los tumores de control de vectores . Estas diferencias fueron estadísticamente significativas. * P & lt; 0,01 frente a tumores SW1990 parentales, ** P & lt;. 0,05 frente a los tumores de control de vectores
Expresión de invasión tumoral y metástasis genes siguiente STAT3
caída
Hemos determinado gen expresión en estos tumores STAT3-derribando utilizando una metástasis de tumores humanos PCR array (# 028A-HAP) de SuperArray Bioscience. datos de la matriz de PCR sugieren que tres genes, es decir, MMP-7, IL-1β y IgT7α, se downregulated (reducciones de 2,54 veces, 23,90 veces y 5,39 veces, respectivamente) en los tumores STAT3-silenciado en comparación con el control y la SW1990 tumores parentales. Sin embargo, ocho genes se upregulated,: SYK (3,38 veces), MYCL1 (4,85 veces), la MMP-11 (4,59 veces), MMP-3 (10,88 pliegues), MMP-10 (19,93 pliegues), CST-7 (3,34 pliegues ), CDH11 (2,01 veces), e IL-8Rβ (7,06 veces).
Reducción de la expresión de ARNm y proteína en MMP7 tumores STAT3-silenciada
Hemos validado los datos de los experimentos de la matriz y se realizó adicional análisis utilizando QRT-PCR (Fig 6A & amp;. S1) e inmunotransferencia Western (Figura 6B) y se encontró que la MMP-7, MMP-9 expresión de ARNm se redujo significativamente en los tumores de STAT3-silenciado comparación con los tumores parentales y de control (
P = 0,033
y
P = 0,002
vs.
SW1990, respectivamente, o
P = 0,0001
y
P = 0,011
vs.
tumores de control, respectivamente). expresión de ARNm de IL-1β también se redujo significativamente en los tumores de STAT3-silenciado comparación con los tumores parentales y de control (
P
= 0,01 y P = 0,0001
vs.
tumores SW1990 y de control, respectivamente). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en bFGF o expresión IgT7α mRNA entre los tumores STAT3-silenciado o controles (Fig. 6A). MMP-7 expresión a nivel de proteínas se suprimió marcadamente en los tumores de STAT3-silenciado, sin embargo MMP-9 no se vio afectada significativamente (Figura 6B).
A, QRT-PCR. Se aisló ARN de los xenoinjertos tumorales y se sometió a análisis de QRT-PCR. B, Western blot. proteína celular total se extrajo de los xenoinjertos de ratón desnudo y se sometió a análisis de Western blot. **
P Hotel & lt; 0,01; *
P
. & Lt; 0,05 en comparación con el vector de control parental o tumores, respectivamente
Reducción de MMP-7 expresión en células tumorales STAT3-silenciado y xenoinjertos
para confirmar los datos anteriores, se realizó inmunocitoquímica de las células STAT3 desmontables y xenoinjertos de ratones desnudos. Nuestros datos sugieren que las células o xenoinjertos SW1990 STAT3-silenciado expresan niveles más bajos de la proteína MMP-7 en el citoplasma en comparación con las células y xenoinjertos (Figura 7) de los padres y de control, lo cual es consistente con la restricción invasión en xenoinjertos de ratones desnudos. Estos datos indican que la regulación de la capacidad de invasión STAT3 en células de cáncer de páncreas se asocia con la regulación por disminución de MMP-7 expresión.
Las células tumorales de, control de vectores de los padres y las células SW1990 STAT3-silenciado se cultivaron en una monocapa o en nude ratones. Las células en monocapa y xenoinjertos de tumores fueron sometidos a inmunocitoquímica e inmunohistoquímica tinción de la proteína MMP-7. A, células de los padres; B, células STAT3-silenciada; C, los tumores de los padres; D, tumores STAT3-silecnced. X 400 aumentos. La flecha roja, las células tumorales.
Discusión
STAT3 shRNA golpeó con éxito por la expresión de STAT3 ARNm y proteínas en las células SW1990 en comparación con las células control transfectadas con el vector SW1990. a continuación, se inyecta por vía subcutánea el vector de control y células SW1990 STAT3 shRNA transfectadas en ratones desnudos. Nuestros datos sugieren que la tasa de crecimiento de las células tumorales STAT3-silenciado en ratones desnudos se redujo significativamente en comparación con las células control de vector. La invasión tumoral en el recipiente y el músculo fue más frecuente en los tumores de STAT3-silenciada que en los tumores de control. La expresión de la proteína colágeno IV que rodea las células del tumor fue completa y continua en los tumores de células SW1990-STAT3 silenciados, mientras que la expresión de colágeno IV fue incompleta y discontinua dentro de los tumores de control. Además, la densidad de microvasos fue significativamente menor en los tumores de STAT3-silenciado que los tumores de los padres y de control de las células SW1990. A nivel molecular, MMP-7 expresión se redujo en los tumores de STAT3-silenciado en comparación con el control y xenoinjertos SW1990 parentales. Los datos del estudio indican claramente que STAT3 desempeña un papel crucial en la regulación del crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.
Sin embargo, no se encontraron cambios significativos en la MMP-9 expresión de la proteína, aunque la expresión de MMP9 ARNm se redujo. La razón de esta discrepancia puede deberse al inhibidor tisular de las metaloproteinasas de 1 (TIMP-1) se redujo cuando STAT3 silenciamiento llevó a activados MMP-9 aumenta, lo que disminuyó la expresión de MMP9 ARNm a través de la retroalimentación negativa [16], [17]. Por otra parte, nuestros datos actual también sugiere algunas discrepancias entre la matriz de PCR y QRT-PCR datos. De hecho, matriz de PCR es una técnica novedosa para investigar la expresión diferencial de los genes diana en el ARNm con un alto rendimiento, la sensibilidad y especificidad. Sin embargo, estos datos siempre deben ser confirmados mediante QRT-PCR, algunos de los cuales se puede verificar (confirmar) mediante qPCR. Esta razón puede ser debido al diseño del cebador y la dificultad en el control de la temperatura de recocido que conduce a amplificaciones no específicas en la matriz PCR. Por lo tanto, los datos de QRT-PCR podrían ser más específico y fiable. Aunque hemos demostrado que algunos genes que se upregulated después de silenciamiento de la expresión de STAT3, nos gustaría hacer hincapié en los genes que son regulados a la baja después de STAT3 silencio en el estudio actual.
STAT3 es un factor de transcripción clave que es oncogénico en humanos las células [18], [19]. La quinasa Janus (JAK) /señalización STAT3 desempeña un papel importante en la regulación del crecimiento y la diferenciación celular y la invasión tumoral y la metástasis en diversos cánceres humanos [20] - [22]. En el cáncer de páncreas, estudios recientes han demostrado la activación inapropiada y constitutiva de STAT3 [23], [24]. En un estudio anterior de nuestro grupo, se informó de la baja regulación de la expresión de STAT3 suprime la capacidad de invasión de las células del cáncer pancreático
in vitro
[7]. En este estudio, encontramos que el silenciamiento de la expresión de STAT3 suprimió el crecimiento tumoral y la invasión y la densidad de los microvasos en ratones desnudos. Estos datos son consistentes con un anterior
ex vivo
estudio [25], donde los autores demostraron que la expresión de STAT3 fosforilado en el carcinoma gástrico humano correlacionó significativamente con la invasión tumoral y el pronóstico
ex vivo.
Los estudios anteriores de otros y nosotros hemos demostrado que la densidad de microvasos STAT3 aumento puede deberse a STAT3 inducción de la expresión del VEGF [7], [26]. Otro estudio también presentado pruebas de que la supresión de la invasión y la metástasis al STAT3 caída dependía de VEGF baja regulación de las células de cáncer de colon [27]. Por otra parte, la disminución de la expresión de MMP-2 es una razón clave para la supresión de la invasión de células tumorales y la metástasis después de silenciamiento de STAT-3 en el melanoma humano [5]. MMPs juegan papeles importantes en la invasión de células tumorales y la metástasis por la degradación de los componentes de las membranas basales y la matriz extracelular [28] - [30]. Un creciente número de estudios indican que ciertas proteínas MMP son el blanco de STAT3 [31], [32]. Xie et al determinó que la activación de STAT3 promueve la invasión de células de melanoma a través de la regulación de MMP-2 transcripción de genes [33]. Además, se encontró que la MMP-1 y MMP-9 que se rige por STAT3, que desempeña un papel crucial en la invasión tumoral y la metástasis [34], [35]. En el presente estudio, hemos demostrado que desmontables de expresión STAT3 disminuyó MMP-7 expresión en células de cáncer de páncreas y xenoinjertos de ratones desnudos. MMP-7 es la proteína más pequeña de la familia de MMP, pero posee la matriz extracelular más alta (ECM) la actividad -degradative contra una variedad de componentes de ECM; por lo tanto, es capaz de desencadenar la activación de una cascada de MMP y se relaciona estrechamente con la invasión tumoral y la metástasis [36] - [39]. En el cáncer de páncreas, MMP-7 se ha demostrado estar implicado en la disociación de las células tumorales desde el sitio original y posteriormente obtener la capacidad de invasión [40], [41]. Otros estudios han sugerido que la MMP-7 podría ser un objetivo directo de STAT3 en células de cáncer gástrico y de mama [42], [43], que es coherente con nuestra conclusión en las células de cáncer de páncreas.
En el estudio actual , se utilizó el modelo de la almohadilla de ratón desnudo clavo en lugar del modelo de ratón desnudo flanco de rutina de las células tumorales. La ventaja del modelo de la almohadilla de las uñas es que este modelo pruebas no sólo la capacidad de invasión de células tumorales en el recipiente y el músculo, sino también un cierto método de la linfa inguinal nodos de metástasis de las células tumorales. Sin embargo, el modelo de tumor ortotópico es el mejor para la detección de la invasión y metástasis capacidad de las células tumorales. En el cáncer de páncreas, nos enfrentamos a una serie de dificultades, incluyendo la técnica de inyectar las células tumorales en el páncreas, la cirugía de inducción de alta mortalidad, y la incertidumbre de la invasión tumoral y metástasis (diferentes de los tumores primarios en el páncreas). En este contexto, el modelo de la almohadilla de ratón desnudo del clavo es fácil y fiable. Estos datos actuales sugieren que STAT3 knockdown alteró significativamente la capacidad de invasión de las células de cáncer pancreático, sin ningún tipo de tumores metastásicos en los ganglios linfáticos en ambos grupos experimentales y de control. Esto puede ser debido al período de tiempo de los experimentos (30 días). Este estudio también demostró los efectos de la caída de STAT3 en células de cáncer pancreático
in vivo
, lo que confirma nuestros
in vitro
datos anteriores que STAT3 desempeña un papel importante en la promoción del crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis , mientras que la supresión de la expresión de STAT3 hizo inhibir pancreático crecimiento celular del cáncer, la angiogénesis y la invasión. Estas funciones de STAT3 pueden actuar a través de la regulación de sus genes aguas abajo, incluyendo cyclinD1, Bcl-2, VEGF, y MMP-2, todos los cuales se mencionan en estudios previos [26], [44], [45]. En el estudio de la nuestra, se encontró que la inhibición STAT3 puede reducir MMP-7 la expresión en células de cáncer de páncreas. Los estudios futuros deberían centrarse en si el silenciamiento de la expresión de STAT3 usando STAT3 shRNA o su inhibidor tales como tirosina quinasa del receptor no es útil como una nueva terapia adyuvante a la quimioterapia en pacientes con cáncer de páncreas.
Información de Apoyo
Figura S1 . análisis
QRT-PCR de SYK, MYCL1, MMP-11, MMP-3, MMP-10, CST-7, la expresión CDH11, y IL-8Rβ en xenoinjertos de ratones desnudos. Se aisló ARN de los xenoinjertos de tumor de ratón y se sometió a análisis de QRT-PCR. Los datos mostraron que la expresión de MYCL1, MMP-3, MMP-10 e IL-8Rβ fue hasta regulada, pero SYK se había reducido regulado en el tumor de STAT3 silencio en comparación con el vector de control o tumores parentales. En cambio, la expresión de la CST-7, CDH11, MMP-11 mRNA hubo diferencia en cada muestra tumoral
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025941.s001 gratis (TIF)