Extracto
El cáncer de páncreas es una enfermedad mortal, y se necesitan urgentemente nuevas dianas terapéuticas. Hemos identificado previamente la amplificación de ADN en 7q21-q22 en líneas celulares de cáncer de páncreas. Ahora, por alta resolución perfil genómico de líneas celulares de cáncer de páncreas humano y los tumores humanos (injertados en ratones inmunodeficientes para enriquecer la fracción cáncer epitelial), definimos una amplificación mínima de 325 Kb que abarca
Smurf1
, una ubiquitina ligasa E3 y conocido regulador negativo de factor de crecimiento transformante β señalización inhibitoria (TGF) de crecimiento.
Smurf1
amplificación se confirmó en los cánceres pancreáticos humanos primarios por fluorescencia
In situ
hibridación (FISH), donde 4 de 95 casos (4,2%) mostraron amplificación. Por la interferencia de ARN (RNAi), desmontables de Smurf1 en una línea de cáncer de páncreas humano con la amplificación focal (AsPC-1) no alteró el crecimiento celular, pero condujo a la reducción de la invasión de células y el crecimiento independiente de anclaje. Curiosamente, este efecto no fue mediada a través de la señalización de TGF alterado, se ensayaron por el reportero transcripcional. Por último, la sobreexpresión de Smurf1 (pero no un mutante catalítica) condujo a la pérdida de inhibición por contacto en células de fibroblastos de embrión de ratón NIH-3T3. En conjunto, estos hallazgos identifican
Smurf1
como un oncogén amplificado conducción múltiples fenotipos tumorigénicos en el cáncer de páncreas, y proporcionar un nuevo objetivo para la terapia dirigida druggable molecularmente
Visto:. Kwei KA, Shain AH, Bair R, Montgomery K, Karikari CA, van de Rijn M, et al. (2011)
Smurf1
amplificación Promueve la invasividad del cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (8): e23924. doi: 10.1371 /journal.pone.0023924
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 14 Diciembre, 2010; Aceptado: August 1, 2011; Publicado: 22 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Kwei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH: CA112016 (JRP), CA09151 (Kak), GI cáncer SPORE CA62924 (AM); NIH /CNRR CTSA conceder UL1 RR025744 a Stanford espectro; y la Fundación Lustgarten (J.R.P.). M.D.B. fue apoyado en parte por un miembro asociado extranjero de Biotecnología del Departamento de Biotecnología del Ministerio de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India. Los autores también agradecen a la familia del Centro de Investigación del Cáncer de Páncreas Sold Goldman Margaret Lee y para apoyar los esfuerzos de los xenoinjertos de la Johns Hopkins. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (en lo sucesivo, el cáncer de páncreas) es casi siempre fatal, con una tasa de supervivencia de cinco años menos del 5% [1]. A menudo se difunde el momento del diagnóstico, y puede producir metástasis ampliamente. La detección temprana puede mejorar la supervivencia, pero la resección quirúrgica rara vez es curativa [2]. El cáncer de páncreas es también en gran medida resistentes a la quimioterapia convencional. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas terapias. En particular, será importante descubrir y validar nuevas dianas para la terapia molecularmente dirigida.
La genética molecular del cáncer de páncreas son en parte conocidos [3], [4]. Somatic la activación de mutaciones de
KRAS
(que ocurre a veces con la amplificación de genes) se encuentran en & gt; 90% de los cánceres pancreáticos. También son comunes inactivación de las mutaciones /deleciones de los supresores de tumores
CDKN2A gratis (& gt; 95% de los cánceres),
TP53 gratis (50-75%), y
SMAD4 gratis (también conocido como
DPC4
) (55%), un efector de la inhibición del crecimiento mediada por TGF. Otras mutaciones de genes, cada uno se presenta en menos del 5% de los cánceres, el impacto éstas y otras vías de señalización núcleo de cáncer [5].
Genómica estudios de perfiles, por hibridación genómica comparativa basada en matrices (CGH array), han comenzado para catalogar amplificaciones de ADN y supresiones, la identificación y nuevos genes de cáncer de páncreas reveladoras (por ejemplo, [6], [7]). Entre los loci alterada, nosotros y otros identificados previamente 7q21-q22 como un sitio de forma recurrente amplificado en cáncer de páncreas [8] - [13]. Aquí, reducimos ese locus, y caracterizar Smurf1 como un producto oncogénico promoción de la invasión de células y el crecimiento independiente de anclaje.
Resultados
Smurf1
se amplifica de manera focal en el cáncer de páncreas
Nos habíamos identificado previamente amplificación recurrente en 7q21-q22 en líneas celulares de cáncer de páncreas, el uso de CGH en microarrays de ADNc [12]. Para delimitar aún más la amplificación, e identificar el oncogén (s) residente, que ahora realizamos perfil genómico adicional de una colección de 22 líneas celulares de cáncer de páncreas y 58-principios de paso xenoinjertos de cáncer de páncreas, el uso de matrices de alta resolución 244K Agilent CGH. El locus 7q21-q22 se amplificó de manera focal (tumor /relaciones normales & gt; 3 veces) en 1 de 22 líneas celulares (4,5%) (ASPC-1), y en 1 de 58 (2%) xenoinjertos. Incluyendo las ganancias de niveles inferiores (relaciones de & gt; 1,3 veces)., Aumento /amplificación de 7q21-q22 que abarca se encontró en 6 de 22 (27%) líneas celulares, y en 19 de 58 (33%) xenoinjertos
Cuatro muestras (la línea de células AsPC-1, y tres xenoinjertos) tenían perfiles genómicos que eran particularmente informativa en la delimitación de los límites de amplicón en 7q21-q22 (Fig. 1A). La región común más pequeño de ganancia atravesado apenas 325 Kb dentro cytoband 7q22.1, y contenía sólo dos RefSeq [14] genes,
Smurf1 gratis (SMAD específica E3 ubiquitina ligasa de proteínas) y
KPNA7 gratis ( karyopherin alfa 7). Smurf1 es un conocido inhibidor de TGF señalización (mediante la promoción de la degradación de su receptor TGFβRI, y mediador de señalización SMAD4 [15], [16]), una vía interrumpida con frecuencia en el cáncer de páncreas. Dada una clara relación con la carcinogénesis pancreática, por lo tanto, centramos los esfuerzos posteriores en
Smurf1
.
(A) Un mínimo de amplificación se define por cuatro especímenes de cáncer de páncreas (ASPC-1 y tres xenoinjertos). A partir de la parte inferior: CHR 7 ideograma; Mapa de calor del número de copias de ADN (rojo indica la ganancia) para las cuatro muestras en toda la región 7q21-q22 (91-101 Mb); Diagrama de dispersión de ADN registro de número de copias
2 ratios entre 7q21.3-q22.1 (96-100 Mb), se superpone el cghFLasso [34] llama ratios (línea roja); Captura de pantalla del locus correspondiente de la UCSC genoma navegador. Las líneas de puntos entre paréntesis el 325 Kb amplicón mínima, que se extiende por
Smurf1
. (B)
Smurf1
cuando se sobreexpresa ganado /amplificado. Los diagramas de caja muestran 25
ª, 50
º (mediana) y 75
º niveles de transcripción de percentiles (ensayadas por matriz Agilent 44K) para las muestras con (rojo) o sin ganancia 7q21-q22 (gris), para
Smurf1
y sus genes vecinos más próximos. Nota,
KPNA7
no estaba representado en la matriz. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001 (Mann-Whitney U-test). (C) FISH revela
Smurf1
amplificación en los cánceres de páncreas primarios. Se muestran dos tipos de cáncer de páncreas con
Smurf1
amplificación (
Center of, y
derecha), junto con un control no amplificada (células BxPC3,
izquierdo
).
Smurf1
una sonda de locus (rojo); el control CHR 7 centrómero (CRP7) sonda (verde).
De acuerdo con un papel oncogénico,
Smurf1 Versión taquigráfica (medida por microarrays) fue significativamente elevado en líneas celulares /xenoinjertos con 7q22 0,1 /ganancia de amplificación (al igual que varios genes vecinos co-amplificado) (Fig. 1B). Para evaluar
Smurf1
amplificación en los tumores pancreáticos primarios, también lleva a cabo FISH en un microarray de tejido que contiene 105 casos de cáncer de páncreas. Cuatro de 95 (4,2%) casos evaluables mostraron
Smurf1
amplificación (locus /relación centrómero & gt; 2,5) (Figura 1C.), Comparable a nuestros hallazgos para CGH-xenoinjertos de paso temprano. No hemos podido identificar un anticuerpo y condiciones de tinción adecuados para evaluar la expresión Smurf1 por inmunohistoquímica.
y la invasión de células independiente de anclaje Smurf1
amplificación promueve el crecimiento
Para evaluar posibles oncogénico funciones de Smurf1, se utilizaron por primera vez RNAi desmontables expresión Smurf1 en el contexto pertinente de la amplificación de genes, utilizando células AsPC-1. La transfección de cuatro pequeños RNAs de interferencia (siRNAs diferentes), o un grupo de los cuatro juntos, cada uno dio lugar a la reducción de los niveles de proteína Smurf1 (por Western blot), en comparación con un grupo no director siRNA (Fig. 2A). Desmontables de Smurf1 no alteró la proliferación celular, medida por WST-1 de ensayo (Fig. 2B, C), y la incorporación de BrdU (Fig. 2D), pero condujo a una disminución significativamente la invasión de células a través de Matrigel, medido por el ensayo de cámara de Boyden (Fig . 2E). La disminución de la invasión fue visto con cada uno de los cuatro siRNAs dirigidos
Smurf1
secuencias distintas, mientras que la tasa de crecimiento de las células se mantuvo sin cambios en el mismo período de tiempo (Fig. 2C), apoyando fuertemente el papel específico de Smurf1 en el fenotipo invasivo.
(a) cuatro diferentes siRNAs focalización
Smurf1
, y un grupo de los cuatro, llevar a niveles reducidos Smurf1 (por Western blot) en comparación con un grupo control de siRNA no director ). Smurf1 niveles residuales, aquí se normalizaron a GAPDH, se indican. (B) Smurf1 caída (utilizando el conjunto de siRNA) no reduce la proliferación celular /viabilidad, medido por el ensayo de WST1, y hecho por triplicado (media +/- 1SD se muestra). (C) Smurf1 desmontables utilizando cuatro diferentes siRNAs no altera significativamente la proliferación celular /viabilidad, medido tres días después de la transfección. Hecho por triplicado (media +/- 1SD se muestra). (D) knockdown Smurf1 no reduce la progresión del ciclo celular (fase S), medida por la incorporación de BrdU (1,5 hr y el etiquetado de impulsos 4 hr), hecho por triplicado (media +/- SD 1 se muestra). (E) Smurf1 caída (utilizando el conjunto de siRNA y siRNAs individuales) inhibe la invasión de las células a través de Matrigel. cámara de Boyden ensayo realizó por triplicado y se cosecha tres días después de la transfección (media +/- 1SD se muestra); *,
P Hotel & lt; 0,05 (prueba t de Student). (F) Smurf1 caída no aumenta la transcripción de TGF vía mediada. AsPC-1 células fueron co-transfectadas con siRNAs y reportero p3TP-Lux, hecho por triplicado, y la luciérnaga relaciones de luciferasa /Renilla muestran (media +/- 1SD se muestra). células Panc1 (con tipo salvaje
SMAD4
) +/- TGF sirven como control positivo.
Debido a su conocida función, antagónica en la vía TGF, también tratamos de evaluar el efecto de Smurf1 caída en la señalización de TGF, usando un reportero de TGF sensible transcripcional (p3TP-Lux) [17]. Desmontables de Smurf1 no mejoró la transcripción mediada por la vía de TGF en AsPC-1 células (Fig. 2F). Es de destacar, sin embargo, las células AsPC-1 (como la mayoría de los cánceres de páncreas) albergan una mutación
SMAD4
, aquí SMAD4 (R100T) [18], que se caracteriza inactivar [19], [20]. Por lo tanto, las células AsPC-1 son probablemente incapaces de una vía de respuesta transcripcional TGF. En términos más generales, estos resultados sugieren que el efecto principal (s) de
Smurf1
amplificación /sobreexpresión es probable mediada a través de distintas vías de señalización de TGFß.
Para evaluar fenotipos de más largo plazo, también de forma estable transfectadas un corto horquilla RNA (shRNA) dirigidos a
Smurf1
. caída estable de Smurf1 en células ASPC-1, confirmada por Western blot (Fig. 3A), redujo significativamente el crecimiento independiente del anclaje (colonias en agar blando), en comparación con un control no shRNA orientación (Fig. 3B).
(a) un transducidas de forma estable shRNA orientación Smurf1 conduce a niveles reducidos (Smurf1 por Western blot) en comparación con un control no la orientación shRNA. Smurf1 niveles residuales, aquí se normalizaron a GAPDH, se indican. (B) Estable desmontables Smurf1 reduce el crecimiento independiente de anclaje (es decir, colonias en agar blando). Ensayo realizado por triplicado (media +/- 1SD se muestra); *,
P
. & Lt; 0,05 (prueba t de Student)
Otro objetivo fue evaluar el efecto de siRNA desmontables en otras líneas celulares de cáncer de páncreas. Elegimos dos líneas celulares, BxPC-3 células que (como AsPC-1 en las células y tumores pancreáticos más) han mutado
SMAD4 gratis (aquí por deleción homocigótica) [21], y las células HS700T las cuales son de tipo salvaje para
SMAD4
y tener una vía de TGF inhibidor del crecimiento intacta (Fig. S1). Cabe destacar que ninguna de estas líneas alberga la amplificación focal de
Smurf1 gratis (células AsPC-1 son la única línea establecida con la amplificación focal), ni los niveles de proteína Smurf1 elevados (Fig. 4A). Desmontables de Smurf1 (validado por Western blot; Fig. 4B) condujo a una reducción modesta en la proliferación de células BxPC-3 células (Fig 4C.), Y más aún en inhibidora de TGF-crecimiento celular HS700T vía intacta (Fig 4D.). knockdown Smurf1 también resultó en la reducción de la invasión de células en BxPC-3 células (Fig. 4E), aunque no de manera significativa. Sin embargo, teniendo en cuenta que
Smurf1
no es ni focalmente amplificó ni sobreexpresa en estas líneas, una explicación simple para los fenotipos discordantes (en comparación con AsPC-1) es que Smurf1 no puede funcionar como un controlador oncogénica en estos contextos celulares.
(a) análisis de transferencia de Western de los niveles de proteína Smurf1 endógenos en un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas. Tenga en cuenta que Smurf1 es altamente expresado sólo en la línea celular AsPC-1 7q22.1-amplificado. Se muestran dos exposiciones diferentes de la mancha Smurf1; GAPDH sirve como control de carga. (B) la comprobación de Western blot de Smurf1 caída (en la piscina siRNA Smurf1 de metas, en comparación con la orientación no-piscina siRNA control) en las células BxPC-3 y HS700T. (C) La proliferación celular /viabilidad se ensayó (por WST-1) en BxPC-3 células siguientes knockdown mediada por siRNA Smurf1 (comparado con el control no la orientación). Ensayo realizado por triplicado (media +/- 1SD se muestra); *,
P Hotel & lt; 0,05 (prueba t de Student). (D) La proliferación celular /viabilidad se ensayó en células HS700T, como arriba. invasión (E) de la célula ensayada (por cámara de Boyden) en BxPC-3 células siguientes Smurf1 caída (en comparación con el control no director). Ensayo realizado por triplicado (media +/- 1SD se muestra). Nota, la reducción de la proliferación observada con Smurf1 caída en células HS700T impide un ensayo de invasión celular (donde el número de células invadidas a las 72 horas se ven influidas por los tiempos de duplicación).
Por último, en la sobreexpresión de estudios, complementarios, transfectadas
Smurf1
ADNc (expresada a partir de un promotor de CMV) en el NIH-3T3 fibroblastos de ratón. La sobreexpresión de Smurf1, confirmada por Western blot (Fig. 5A), dio lugar a una pérdida significativa de la inhibición por contacto (es decir, aumento de focos), en comparación con un control de vector (Fig. 5B). En particular, la transfección de un mutante catalíticamente inactivo de Smurf1 (C699A) [22] no redujo la inhibición por contacto (Fig. 4B), que indica que esta actividad oncogénica es dependiente de la actividad de la proteína ubiquitina ligasa E3 de Smurf1.
(a) transfección de Smurf1 cDNA, o un mutante catalítica de Smurf1 (C699A) (Smurf1
m), conduce a la sobreexpresión (por Western blot) en comparación con el control de vector vacío. niveles de sobreexpresión Smurf1, normalizado a GAPDH, se indican. (B) Smurf1 (pero no Smurf1
m) sobreexpresión en células NIH-3T3 conduce a la pérdida de inhibición por contacto (es decir, aumento de la formación de focos). Los ensayos realizados por triplicado (media +/- 1SD se muestra); *,
P
. & Lt; 0,05 (prueba t de Student)
Discusión
A continuación, nos propusimos identificar y descubrir la conducción oncogén 7q21-q22 amplificación en el cáncer de páncreas. -Alta resolución perfil genómico de líneas celulares de cáncer de páncreas y xenoinjertos de paso de principios define una amplificación mínima de 325 Kb que abarca
Smurf1
. los niveles de transcripción de
Smurf1
fueron elevados en las muestras con la ganancia /amplificación, y por FISH confirmamos
Smurf1
amplificación en los cánceres de páncreas primarios. El uso de enfoques complementarios de caída (en focalmente amplificado por AsPC-1 en las células) y la sobreexpresión (en células NIH-3T3), se determinó que
Smurf1
amplificación /sobreexpresión no altera la proliferación celular, sino que promueve la invasión de células, fondeadero crecimiento -independiente, y la pérdida de inhibición de contacto, de los cuales al menos el último es dependiente de su actividad catalítica.
Smurf1 fue inicialmente un candidato oncogén intrigante debido a su conexión conocida a la señalización de TGF. La vía de TGF, por lo menos al principio del desarrollo del tumor, es el crecimiento de supresión [23]. Normalmente, TGF une a sus receptores (TGFβRI, TGFβRII), que conduce a la fosforilación de transductores de señal SMAD2 /Smad3, que luego de transporte al núcleo y en el complejo con SMAD4 median la transcripción. transcripcional respuestas clave incluyen la inducción de
CDKN2B gratis (p15Ink4b) y
CDKN1A gratis (p21Cip1), y la represión de los
MYC
, junto conduce a G
1 ciclo celular arrestar. La vía supresora de crecimiento TGF se interrumpe comúnmente en el cáncer de páncreas, lo más a menudo a través de la mutación /deleción de
SMAD4
, pero también a través de inactivación /pérdida de
TGFβRI
y
TGFβRII
[ ,,,0],4].
Smurf1 es una hect-dominio E3 ubiquitina ligasa (E3 ubiquitina ligasas llevar a cabo la tercera y específico del sustrato paso en la ubiquitinación de proteínas). Smurf1 promueve la exportación nuclear de TGF inhibidor de la vía SMAD7 (aumentando su disponibilidad), y la destrucción de TGFβRI y SMAD4 (a través de la degradación mediada por ubiquitinación) [15], [16]. Todas estas actividades deben servir para antagonizar la señalización de TGF, y juntos proporcionan una sólida justificación para
Smurf1
amplificación /sobreexpresión en cáncer de páncreas. Era notable entonces, que Smurf1 caída en células AsPC-1 no mejoró la transcripción de TGF-vía (aunque quizás no es sorprendente, dada la inactivación de la mutación de
SMAD4
). Por lo tanto, las actividades oncogénicas de Smurf1 deben actuar al menos en parte de manera independiente de sus funciones en TGF señalización (al menos en el nivel de la vía de SMAD4). Con este fin, Smurf1 también se ha demostrado para disolver las uniones estrechas (por la degradación de RhoA) durante la transición epitelial-mesenquimal [24], y las adhesiones focales (por degradación de cabezas Talin) para potenciar la migración celular [25]. Estudios adicionales deben aclarar los sustratos Smurf1 clave en relación con la invasión y el crecimiento independiente de anclaje en los cánceres de páncreas con 7q22 amplificación.
Durante el progreso de este trabajo, otros dos estudios caracterizan la amplificación de 7q21-q22 en el cáncer de páncreas. Suzuki
et al.
[26] por un perfil genómico de líneas celulares identificó el amplicón en las células AsPC-1, con el pico de amplicón se extiende por 11 genes. Otros esfuerzos se centraron en dos genes,
TRRAP
y
Smurf1
, con expresión significativamente elevado cuando se amplifica. Sin embargo, a diferencia de nuestro estudio, se informó que desmontables de Smurf1 inhibe la proliferación de células AsPC-1. Cabe destacar, sin embargo, evaluaron sólo un siRNA. Teniendo en cuenta nuestros resultados que cuatro siRNAs independientes derribados niveles comparativamente Smurf1 y la disminución invasión sin afectar la proliferación celular, se sugiere que su hallazgo podría reflejar un inespecífica o específica fuera del objetivo RNAi efecto. De hecho, la inhibición del crecimiento es un efecto no específico común, provocada por una respuesta de interferón de tipo I de siRNA [27]. Suzuki
et al.
Llegó a demostrar que la sobreexpresión Smurf1 en dos líneas celulares de cáncer de páncreas mejora el crecimiento de colonias en el plástico de cultivo de tejidos. Sin embargo, nuestros hallazgos basados en caída en el contexto fisiológicamente relevante de coordinación
Smurf1
amplificación sugieren que la principal función oncogénica de Smurf1 se refiere a la promoción de la invasividad celular en lugar de la proliferación.
En otro estudio reciente , Laurila
et al.
[28] mediante análisis FISH de líneas celulares delimitada la amplificación 7q21-q22 de 0,77 Mb abarcan 10 genes (incluyendo
Smurf1
), pero centrado sus esfuerzos en
ARPC1A
y
ARPC1B
, subunidades del funcionamiento Arp2 /3 en la polimerización de actina. El uso de RNAi, encontraron que desmontables de cualquiera reducida motilidad celular y desmontables de
ARPC1A
también redujo la invasión celular. Aunque nuestro mínima amplicón excluido
ARPC1A
y
ARPC1B
, no obstante es posible que su amplificación contribuye a la motilidad /invasión en tumores donde se amplifican. No es raro encontrar múltiples oncogenes conductor dentro de amplicones de tumores (por ejemplo, ref. [29]). De hecho, nuestros propios estudios no resolver si
KPNA7
, dentro de nuestro 325 Kb amplicón mínima, podría también tener un papel oncogénico (junto con
Smurf1
).
Para resumir , por el perfil genómico y análisis funcional identificamos
Smurf1
como un oncogén amplificado conducción invasividad celular en el cáncer de páncreas. Tal vez de mayor importancia, como una enzima Smurf1 representa una diana terapéutica tratable. Otros ubiquitina ligasas E3 se han relacionado con el cáncer, y debido a su especificidad de sustrato se cree ligasas E3 ubiquitina ser objetivos atractivos para la terapia [30]. De hecho, se están evaluando actualmente varios inhibidores de moléculas pequeñas (incluyendo contra MDM2, un regulador de TP53) [31]. Nuestros hallazgos identifican Smurf1 como una posible nueva diana para la terapia molecularmente dirigida contra la devastadora enfermedad de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Los especímenes
líneas celulares de cáncer de páncreas, se describe anteriormente [12], y las células NIH-3T3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). xenoinjertos de cáncer de páncreas, que enriquecen con eficacia la fracción epitelial del tumor para el análisis de ADN, se generaron como se describe [32] en el Hospital Johns Hopkins, con la aprobación del Comité de Revisión Institucional (IRB) (ID de protocolo 05-04-14-02) y Cuidado de Animales y el empleo Comisión (protocolo MO05M466 ID). En pocas palabras, un 1 mm
3 pedazo del tumor primario se remojan en Matrigel (Collaborative Biomedical Research), por vía subcutánea a continuación, implantado en un ratón nu /nu. tumores injertados se cosecharon cuando llegaron a 1-2 cm de diámetro, y el enriquecimiento de las células tumorales confirmado por H & amp; E-sección congelada manchadas. ADN y ARN se aislaron utilizando el Qiagen (Valencia, CA) kit AllPrep. Once de los 48 xenoinjertos fueron previamente configurada en el marco de menor resolución CGH en cDNA arrays [6].
Array CGH
CGH se realizó utilizando Agilent (Santa Clara, CA) Catálogo de 244K CGH arrays. Los ADN fueron etiquetados como se describe [33], y luego hibridado (
vs.
Un grupo de ocho emparejados por sexo de leucocitos normales ADN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las matrices fueron escaneados utilizando un escáner de Agilent G2505B, y los datos extraídos y normalizó el uso de software de extracción de características de Agilent (versión 9.1) con la configuración predeterminada. Copiar alteraciones numéricas fueron llamados usando cghFLasso [34], y las ganancias de bajo nivel y amplificaciones de nivel superior definido por cghFLasso tumor /relaciones normales & gt; 1,3 y & gt; 3,0, respectivamente. CGH datos detallados en este documento están disponibles en GEO (GSE19852); una descripción completa del conjunto de datos está en preparación.
perfiles de expresión
De perfiles de expresión se realizó utilizando Catálogo de Agilent arrays 44K de todo el genoma humano. Los ARN se marcaron utilizando el kit rápido de amplificador de etiquetar (Agilent), entonces hibridado (
vs.
Una referencia piscina ARN universal de 11 líneas celulares de cáncer [35]) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la exploración y extracción de datos (como el anterior), los datos de expresión se normalizaron (media centrada) por la matriz y por el gen, y la media centrada registro informaron
2 proporciones.
Fish &
Un microarray de tejido que contiene 105 casos de adenocarcinoma ductal pancreático (archivada en la Universidad de Stanford, y se utiliza con la aprobación del IRB) fue descrito previamente [6]. la sonda de etiquetado y FISH se realizaron con Vysis (Downers Grove, Illinois) los reactivos de acuerdo con los protocolos del fabricante. Un mapeo BAC locus específicos de
Smurf1
en 7q22.1 (RP11-62N3; Recursos BACPAC Centro, Oakland, CA) se marcó con SpectrumOrange, y co-hibridado con la sonda centrómero CHR 7 marcada con SpectrumGreen (CEP7 ; Vysis). Las diapositivas se counterstained con DAPI y fotografiado usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 con Applied Imaging (San Jose, CA) Cytovision software 3.0. Veinticinco células tumorales fueron anotados por caso, y la amplificación definen como un promedio
Smurf1
/relación CEP7 & gt;. 2.5
siRNA transfecciones
on-TARGETplus siRNAs dirigidos
Smurf1
, junto con una piscina ARNsi de control negativo (eN-TARGETplus siCONTROL piscina Non-targeting), se obtuvieron de Dharmacon (Lafayette, CO). Secuencias de siRNAs se enumeran en la Tabla S1. células AsPC-1 se cultivaron a 37 ° C en medio completo de RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% de FBS, 50 U /ml de penicilina, y 50 U /ml de estreptomicina. Para la transfección, se sembraron 150.000 células por placa de 6 pocillos bien, y se transfectaron usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células fueron transfectadas con una concentración final de 50 nM siRNA durante 6 horas.
Western blot
Las células se lisaron en 1 × tampón RIPA suplementado como se describe [6]. Cuarenta mg de proteína total lisado se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 4-15%, después se transfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon en TBST-T con leche en polvo 5%. Los anticuerpos se utilizan como sigue: anticuerpo policlonal de conejo anti-Smurf1 (H-60; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una dilución 1:500; anti-GAPDH anticuerpo policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:5,000; HRP-conjugado IgG anti-conejo (Pierce, Rockford, IL) a una dilución 1:20,000. La detección se realizó utilizando un kit ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), y las intensidades cuantificó por densitometría usando el software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD).
crecimiento celular y la invasión ensayos
la proliferación celular /viabilidad se cuantificó por colorimetría basado en la escisión metabólica de la WST-1 sal de tetrazolio en células viables, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche, Indianapolis, IN). incorporación de BrdU se determinó mediante ELISA colorimétrico utilizando la celda BrdU Ensayo de proliferación, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). La invasión se cuantificó mediante un ensayo de cámara de Boyden (BD Biosciences, San Jose, CA). Brevemente, 24 horas después de la transfección, se sembraron 50.000 células en 24 pocillos insertos recubiertos con Matrigel con un gradiente de FBS 0,5% a 10%. Setenta y dos horas más tarde, se fijaron las células, se tiñeron con cristal violeta, y las células que atraviesan la membrana se contaron. Todos los ensayos se realizaron como transfecciones por triplicado, y todos los experimentos se repitieron al menos una vez con resultados similares.
TGF reportero transcripcional ensayo
Las células fueron co-transfectadas con 4 g p3TP-Lux (Addgene, Cambridge, MA), una sensible reportero TGF luciferasa de luciérnaga que contiene tres elementos de respuesta a TPA consecutivos (tres) y una porción del inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) promotor de la región [17], junto con 0,4 g pRL-TK (Promega, Madison, WI) que expresa luciferasa de Renilla como control de normalización interna. La actividad de luciferasa se ensayó 48 horas después de la transfección (por Lipofectamine 2000) utilizando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega, Madison, WI). reportero de la actividad se expresa como la relación de luciérnaga /Renilla. Los ensayos se realizaron como transfecciones por triplicado, y se repitieron al menos una vez con resultados similares.
crecimiento independiente del anclaje
Un pGIPZ shRNAmir construcción de la orientación
Smurf1 gratis (V2LHS_229724), junto con un control pGIPZ shRNAmir no director, se obtuvieron de Abrir Biosystems (Huntsville, AL). Para crear transducidas de forma estable células piscinas AsPC-1, construcciones lentiviral (junto con plásmidos mezcla de empaques Trans-lentiviral) se transfectaron en 293TN células productoras (Sistema Biosciences, Mountain View, CA), y el virus de empaquetado sobrenadante transducidas en las células ASPC-1 siguiente las instrucciones del fabricante (Trans-lentiviral GIPZ protocolo envases abiertos Biosystems). Dos días después de la infección, se añadió 1 mg /ml de puromicina (Invitrogen) al medio de cultivo, y las células seleccionadas durante 14 días. el crecimiento independiente del anclaje se ensayó por la formación de colonias en agar blando. Brevemente, 10.000 células fueron incorporados en una placa de 6 pocillos bien dentro de una capa superior de 0,36% de agarosa en medio completo, sobre una capa de 0,48% de agarosa en medio completo. Las células se cultivaron durante 14-21 días, entonces colonias visibles contaron después de la tinción con 0,015% de solución de rojo neutro. Los ensayos se realizaron por triplicado como transducción, y se repitieron al menos una vez con resultados similares.
NIH-3T3 ensayo de formación de focos
humano de longitud completa
vector de expresión de ADNc Smurf1
, pcDNA3 0,1-Smurf1 fue una especie de regalo de Di Chen (Universidad de Rochester Medical Center, Rochester, NY), y el vector pcDNA3.1 padre fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Un mutante catalítica Smurf1 (C699A) [22] fue diseñado usando la mutagénesis dirigida al sitio QuickChange Kit XL II de Stratagene (La Jolla, CA), con los siguientes cebadores mutagénicos: 5'-CGTGGAGGAGACCGCCGGGTTTGCTGTGG -3 '(degenerado, bases mutadas denota por el texto en negrita) y 5'-CCACAGCAAACCCGGCGGTCTCCTCCACG-3 '. Cincuenta mil células se sembraron por 60 mm de placa, y 8 g de plásmido se transfectaron por el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Dos días después de la transfección, las células de cada placa de 60 mm fueron re-sembraron en dos placas de 10 cm y se dejaron crecer hasta la confluencia durante 28 días. focos visibles se contaron después de la fijación de metanol y la tinción Giemsa. Los ensayos se realizaron como transfecciones por triplicado, y se repitieron al menos una vez con resultados similares.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
secuencias de siRNA dirigidos Smurf1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0023924.s001 gratis (PDF)
Figura S1. células
HS700T muestran la inhibición del crecimiento inducida por TGF. Se sembraron células HS700T, y luego 2 ng /ml TGF (o control de vehículo) añaden y la proliferación celular /viabilidad se ensayaron (por WST-1) al día. Los ensayos se realizaron por triplicado (media +/- 1SD se muestra); *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001 (prueba t de Student). En consonancia con la inhibición del crecimiento TGF intacta, sin supresiones que abarca
SMAD4 gratis (244K Agilent CGH array de datos; no se muestra) y no hay mutaciones puntuales de
SMAD4 gratis (análisis de Illumina RNAseq; no se muestra) se identificaron.
doi: 10.1371 /journal.pone.0023924.s002 gratis (EPS)
Reconocimientos
agradecemos a Ilana Halperin (Stanford Laboratorio de Citogenética) para obtener ayuda con el análisis FISH, y el los miembros del laboratorio Pollack útil para los debates.