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PLOS ONE: Sox2 es un gen reprimido-receptor de andrógenos que promueve el cáncer de próstata resistente a la castración


Extracto

A pesar de los avances en la detección y la terapia, el cáncer de próstata resistente a la castración sigue siendo un problema clínico importante. La actividad aberrante de las vías de células madre, y su regulación por el receptor de andrógenos (AR), tiene el potencial de proporcionar información sobre nuevos mecanismos y vías para prevenir y tratar avanzado, resistente a la castración cáncer de próstata. Con este fin, se investigó el papel del regulador embrionaria de células madre Sox2 [SRY (región determinante del sexo Y) -box 2] en las células epiteliales de próstata normales y malignas. En la próstata normal, Sox2 se expresa en una parte de las células epiteliales basales. Los tumores de próstata eran o Sox2-positivo o negativo Sox2, con el porcentaje de tumores Sox2-positivo aumenta con la puntuación de Gleason y la metástasis. En la línea celular de cáncer de próstata resistente a la castración CWR-R1, la expresión endógena de Sox2 fue reprimida por la señalización AR, AR y la cromatina-IP muestra que la AR se une el elemento potenciador en el promotor Sox2. Del mismo modo, en las células epiteliales normales de la próstata y células madre de embriones humanos, el aumento de la señalización de AR también disminuye la expresión de Sox2. La resistencia a los resultados MDV3100 anti-andrógenos en un marcado incremento en la expresión de Sox2 dentro de las líneas celulares de cáncer de próstata tres, y en el LAPC-4 línea celular de cáncer de próstata la expresión ectópica castración sensible de Sox2 era suficiente para promover la formación de tumor resistente a la castración. La pérdida de expresión de Sox2 en la línea celular de cáncer de próstata CWR-R1 resistente a la castración inhibió el crecimiento celular. Sobre regulación de Sox2 no se asoció con un aumento de la expresión de CD133 pero se asoció con un aumento de FGF5 (5 factor de crecimiento de fibroblastos) expresión. Estos datos proponen un modelo de expresión Sox2 elevada debido a la pérdida de la represión AR mediada durante la castración, la castración y la consecuente resistencia a través de mecanismos que no implican la inducción de las vías de células madre embrionarias canónicas

Visto:. Kregel S, Kiriluk KJ , Rosen AM, Cai Y, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) es un gen Sox2 reprimida-receptor de andrógenos que promueve el cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10.1371 /journal.pone.0053701

Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América

Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado: 3 de diciembre de 2012; Publicado: 11 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Kregel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los fondos para este trabajo fue generosamente proporcionada por: la Universidad de Chicago Departamento de Cirugía, la Sección de Urología; la Universidad de Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC); un premio Piloto del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) SPORE P50 CA090386 en el cáncer de próstata en el Centro Oncológico Integral Robert H. Lurie de la Universidad Northwestern y el Centro de Investigación del Cáncer de la Universidad de Chicago; la Sociedad Americana del Cáncer Institucional de Becas de Investigación (ACS-IRG, IRG-# 58-004); un programa de subsidios del Centro del Cáncer (CA14599 P30); La Fundación Brinson; el Fondo de la Familia Baum Alvin; y la Universidad de Chicago Junta de cáncer de la Fundación de Investigación de las mujeres. S. Kregel es apoyada por un HHMI: Med-en-Grad Fellowship (56006772) y una Biología del Cáncer Formación Grant (T32-CA09594); E. Reyes el apoyo de un subsidio de estudios Inmunología (AI07090-31). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la recaída del cáncer de próstata maligno después de la terapia hormonal es un problema clínico importante y se necesitan nuevas estrategias para prevenir y tratar el cáncer de próstata resistente a la castración. la terapia de privación de andrógenos (ADT) ha sido el pilar del tratamiento del cáncer de próstata desde el descubrimiento de Charles Huggins y Clarence Hodges en 1941 que la castración pacientes ayudados significativamente con cáncer de próstata avanzado [1]. Sin embargo, existe progresión de la enfermedad inevitable debido al crecimiento de células de cáncer de próstata resistente a la castración. Hay una serie de mecanismos para el desarrollo de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), la mayor parte de los cuales se centran en el receptor de andrógenos (AR) [2]. Por lo tanto, la inhibición de la señalización intracelular AR dentro de las células de cáncer de próstata ha sido un foco principal de la investigación del cáncer de próstata, lo que resulta en una variedad de inhibidores químicos de orientación AR señalización que se utilizan en la clínica [3]. Desafortunadamente, mientras que todos estos inhibidores de producir una respuesta terapéutica inicial, esto es seguido comúnmente por recaída y progresión de la enfermedad.

Los recientes descubrimientos de la reprogramación de células somáticas usando genes definidos para crear células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) demuestra profundamente que la expresión de algunos genes de células madre son capaces de provocar cambios a gran escala en la expresión de genes y el comportamiento celular, muchas de las cuales son propiedades de las células malignas [4]. oncogenes De hecho, se establecen dichos factores de reprogramación de células madre (c-Myc y Klf4) o se perfilan como oncogenes (Sox2, Oct4, Nanog y) en una variedad de tipos de cáncer [5], [6], [7]. Los factores de transcripción Sox2, Oct4, Nanog y comprenden la maquinaria núcleo factor de transcripción de células madre embrionarias y son esenciales hacia el mantenimiento de la pluripotencia y la prevención de la diferenciación [8]. En los estudios que utilizan líneas celulares, estos genes no sólo promueven la proliferación celular y la supervivencia, sino que también perjudican los procesos de diferenciación normales; ambos de los cuales son señas de identidad de la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. En algunos casos, la expresión de tales genes se cree que marcar madre de cáncer rara /iniciar las células [12], [16]. Por lo tanto, se cree que la función de estos factores de transcripción en células de cáncer de adultos para inhibir la diferenciación y promover mecanismos de pluripotencia de células madre y de supervivencia similar a su función esencial en las células madre embrionarias.

Sox2 [SRY (región determinante del sexo Y) -box 2] es un factor de transcripción que es esencial para mantener la supervivencia y la pluripotencia de células madre embrionarias indiferenciadas, y tiene un papel emergente como un factor de reprogramación epigenética y oncogén [5], [17], [18], [19] , [20]. En las células madre de embriones humanos Sox2 regula la expresión de genes de 1259, muchos de los cuales son co-regulados con Oct4 y /o Nanog [21]. En la próstata, la expresión de Sox2 se ha observado en las células dentro de la capa de células basales epiteliales de los epitelios glandulares normales [22], y en tumores de próstata [22], [23]. La expresión de Sox2 en los tumores de próstata se ha pensado para promover un fenotipo tumoral más agresivo mediante la promoción de una "de células madre como" fenotipo tumoral. De hecho, la expresión serie de genes de análisis mostraron que una firma de células iPS como está presente dentro de una porción de los tumores de próstata benignos y agresivos, y esta firma confiere un pronóstico de la enfermedad peor [24]. Nuestro grupo ha identificado previamente Sox2 como siendo altamente expresado en las células epiteliales normales de la próstata en comparación con las células epiteliales de las vesículas seminales: un órgano con función similar y el origen del desarrollo que, a diferencia de la próstata, rara vez es un sitio de la tumorigénesis [25]. Colectivamente, estos datos se prestan a la hipótesis de que las funciones de Sox2 en las células epiteliales normales y malignos de adultos para regular la expresión de muchos de los mismos objetivos de genes regulados por Sox2 dentro de las células ES humanas, promoviendo así un fenotipo de tumor de células madre embrionarias menos diferenciadas; la expresión de Sox2, además, podría limitarse a madre de cáncer rara /iniciar las células que confieren un pronóstico de la enfermedad peor. Alternativamente, Sox2 podría tener una función muy diferente en las células epiteliales adultas. Estos datos también sugieren que Sox2 puede promover la castración resistencia por la disminución de la dependencia de las células de cáncer de próstata en la señalización AR para su crecimiento y supervivencia.

Aquí mostramos que Sox2 se expresa en la mayoría de las células epiteliales basales normales de la próstata , y se expresa de manera uniforme en un subconjunto de tumores de próstata. Por otra parte, Sox2 se expresa en la inmensa mayoría de las lesiones metastásicas de próstata resistente a la castración. En las células epiteliales normales de próstata, células madre embrionarias humanas, y células de cáncer de próstata resistentes a la castración, la activación de ligando de AR promueve una disminución en la expresión de Sox2, que es un resultado de la unión directa de la AR a la región cis-potenciador Sox2. La expresión de Sox2 también se aumenta dentro de las células de cáncer de próstata que son resistentes a la MDV3100 anti-andrógenos. En las células de cáncer de próstata sensible a la castración, la expresión de Sox2 es suficiente para promover la formación de tumor resistente a la castración. La expresión de Sox2 en células de cáncer de próstata, sin embargo, no da lugar a cambios en la expresión de PSA específicos de diferenciación, un aumento de la madre de cáncer putativo CD133 positivas /células que inician, o la expresión de conocidas células madre embrionarias humanas (células madre): se asocian genes diana Sox2. Por lo tanto, Sox2 parece promover la resistencia a la castración a través de mecanismos que no implican la re-expresión de genes de células madre o el aumento de vástago de tumor raro Sox2 diana embrionarias /iniciar las poblaciones de células.

Materiales y Métodos

Líneas celulares y Materiales

R1881 y actinomicina D fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), y MDV3100 fue adquirido de Selleck Químicos (Houston, TX), y se almacenaron a -20 en etanol . Todas las líneas celulares de cáncer de próstata humano se cultivaron tal como se describe anteriormente [26], [27]. Todos los cultivos se rutinariamente para detectar la ausencia de contaminación por micoplasma usando el kit de detección de Mycoplasma universal ATCC (Manassas, VA). PC-3, las líneas celulares VCAP y NCCIT fueron adquiridos de ATCC, y el Du145, LNCaP, LAPC-4, C4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2B, y las líneas celulares E006AA fueron generosamente proporcionado por el Dr. John Isaacs en la Universidad Johns Hopkins y se han caracterizado previamente [28]. La línea de células madre embrionarias humanas WA01 (H1) fue adquirido de WiCell (Madison, WI) y se cultivaron usando el protocolo de enlace de medios de comunicación independientes usando mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, aC). Se utilizaron células madre embrionarias dentro de los diez pasos de descongelación. Secretada PSA total y testosterona se midieron utilizando antígeno Roche Elecsys total prostático específico (PSA) y testosterona (T) Los ensayos. El crecimiento celular se midió usando el kit de ensayo de proliferación celular Vybrant MTT (Invitrogen Sondas /Molecular; Eugene, OR).

Lentiviral Sox2, vectores AR y de control (Preceiver-Lv105) fueron adquiridos de GeneCopoeia (Rockville, MD ). transactivador de tetraciclina Lentiviral (LV-rtTA) y inducible vector lentiviral Sox2 del laboratorio Hochedlinger se compraron a través de Addgene [29]. Cuando se indujo necesario, la expresión de Sox2 usando 1 ug /ml de doxiciclina (Sigma). Desmontables expresión de Sox2 usando shRNA expresión se logró utilizando el conjunto de genes Sox2 shRNA anti-humano, que consiste en 4 diferentes secuencias de lentivirus de orientación contra vectores (control) CSHCTR001-HIVH1 Sox2 y un control no silenciar [HSH017628-HIVH1 (Sox2) y que contiene una GFP y puromicina de resistencia a componentes; Genecopoeia]. lentivirus de alto título fue hecha por la co-transfección con ViraPower Lentivrial mezcla de empaques (Invitrogen, Grand Island, NY) y Lenti-X Concentrador. (Clontech; Mountain View, CA) según las instrucciones del fabricante

no malignas se establecieron cultivos epiteliales de tejidos de próstata humanos frescos adquiridos a partir de muestras quirúrgicas como se describe anteriormente [25]. Estos tejidos fueron adquiridos en virtud de un protocolo acelerado aprobado por la Universidad de Chicago Junta de Revisión Institucional (IRB). Las muestras de tejido fueron gestionados por la Universidad de Chicago Tejidos Humanos facilidad de la base del Centro de Recursos; la necesidad de consentimiento del paciente se renunció a medida que se identificaban de-muestras adquiridas. 4 mm punzones de biopsia de tejido no tumoral fueron tomadas de la próstata y los tejidos de la vesícula seminal de los pacientes sometidos a prostatectomía radical; la mitad de este tejido se fijó y analizada por un patólogo para confirmar la ausencia de tumor. La disociación de tejido de la próstata y el crecimiento de las células epiteliales se ha descrito anteriormente [30], [31], y se utilizaron los mismos métodos para establecer próstata emparejados (PrEC) y cultivos de células epiteliales de la vesícula seminal (SVEC). Los cultivos se desarrollaron utilizando medios definidos Keratinoctye libre de suero suplementado con factores de crecimiento (GFs) (estándar K-SFM, Invitrogen Life Technologies) y se pueden cultivar hasta 8 pasajes antes de la senescencia celular notable [32]. Para nuestros experimentos, se analizaron todas las culturas en o antes de su cuarto pase.

Transferencia Western, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y

lisados ​​celulares completos recogidos de 100.000 células fueron utilizados por carril. Los anticuerpos utilizados fueron: anti-AR (N-20, Santa Cruz; Santa Cruz, CA); anti-beta actina (Sigma-Aldrich); anti-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz); anti-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Nanog (D73G4 XP, Señalización Celular Tecnología); anti-Oct4 (C30A3, Señalización Celular Tecnología); y anti-deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH, Cell Signaling Technology). anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano secundaria eran de Tecnologías de Señalización Celular, y HRP detectados utilizando SuperSignal West Femto sustrato quimioluminiscente (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL). Alternativamente, se utilizaron anticuerpos secundarios de Rockland (Gilbertsville, PA) y los datos capturados utilizando un sistema de Odyssey Licor (Lincoln, NE)

inmunotinción para Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology; monoclonal de conejo). Se realizó en (FFPE), secciones incluidas en parafina fijado en formol gestionados por la Universidad de facilidad de la base de tejidos de recursos de Chicago humana o la Universidad de Northwestern /Universidad de Chicago programa de próstata SPORE y su programa de Adquisición de muestras. Después de la desparafinación y rehidratación, los tejidos se trataron con tampón de recuperación de antígeno (S1699 de DAKO; Glostrup, Dinamarca) en un vapor durante 20 minutos. se aplicó anticuerpo anti-Sox2 (01:25 dilución) durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara de humedad. Después de TBS de lavado, se detectó la unión a antígeno del anticuerpo con el sistema Envision + (DAKO, K4001 de anticuerpos primarios de ratón) y DAB + cromógeno (DAKO, K3468). Las secciones de tejido se sumergieron brevemente en hematoxilina durante counterstaining y eran encubrimiento deslizado. Los tejidos fueron analizados por un patólogo entrenado y genitourinario anotó en el porcentaje de células con tinción positiva nuclear (0 = sin tinción; 1 = 1-10% de células positivas; 2 = 11-50% de células positivas, y 3 = & gt; 50% positivas Células); así como la intensidad de la tinción (0 = sin tinción; 1 = débil tinción; tinción 2 = moderado; 3 = fuerte tinción). Para las imágenes, diapositivas fueron digitalizadas mediante un escáner de diapositivas Total Pannoramic Scan (Cambridge Research e Instrumentación; Hopkinton, MA) y las imágenes capturadas utilizando la versión de software Pannoramic Visor 14/01/50. (3DHistech; Budapest, Hungría)

Para inmunofluorescencia, los tejidos se desparafinaron, se rehidrata, y se trató con tampón de recuperación de antígeno. unión del anticuerpo Sox2 (D6D9, Tecnología de la señalización celular; Alexa-Fluor 555-conjugado, dilución 1:50 en TBST) y p63 (4A4, Santa Cruz Biotechnology; Alexa-Fluor 647 conjugado, dilución 1:50 en TBST) se llevaron a cabo para 1 hora a temperatura ambiente. Los tejidos fueron contra el teñidas con DAPI y se montaron usando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL). Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio Leica TCS SP2 AOBS láser confocal de barrido.

Cuantitativo PCR en tiempo real (Q-RT-PCR) y PCR análisis de matriz

ARN fue purificado utilizando el Qiagen RNeasy Mini kit con el kit opcional digestión DNasa (Qiagen, Valencia, CA) y la calidad probada usando un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para el estándar Q-RT-PCR, el ARN extraído se convirtió en ADNc mediante transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa Superscript® III (Invitrogen). Los niveles de Sox2, PSA, FGF5 y la transcripción GAPDH se cuantificaron utilizando
Potencia
SYBR verde Master Mix (Invitrogen), utilizando cebadores personalizados para Sox2 [5'-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 '(hacia adelante), 5'-CGGGGCCGGTATTTATAATC- 3 (reverso)]; PSA [5'-TCATCCTGTCTCGGATTGTG-3 '(hacia adelante), 5'-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3' (inverso)]; FGF5 [5'-AGTCAATGGATCCCACGAAGC-3 '(hacia adelante), 5'-TGAACTTGGCAG TTGCATGGA-3' (inverso)]; y GAPDH [5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 '(hacia adelante), 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' (reverso)]. Las curvas de calibración se utilizaron para evaluar la eficiencia de imprimación y el cambio medio en ciclo umbral valores (Ct) se determinó para cada una de las muestras relativas a los niveles de GAPDH endógeno y se compararon con el control del vehículo (ΔΔCT). Los experimentos se realizaron por triplicado para determinar el error estándar de la media, y la t de Student pruebas realizadas con la normalización de controlar para obtener los valores de p.

En las embrionarias humanos de células madre de PCR matrices, el RT
2 Primera Strand Kit (SA Biosciences; Valencia, CA) se utilizó para revertir transcribir el RNA a cDNA. RT
2 qPCR Master Mix (SA Biosciences) y embrionarias humanas de células madre RT
2 Profiler ™ PCR Arrays (Cat#SPAS-081, SA Biosciences) se utilizaron para examinar las transcripciones de 84 genes clave implicados en el mantenimiento de la pluripotencia y el estado de auto-renovación de las células madre embrionarias. Las matrices se realizaron con réplicas biológicas por triplicado para cada condición. El RT
2 Profiler ™ PCR software de análisis de datos de la matriz se utilizó para evaluar el cambio medio en los valores de ciclo umbral (Ct) para cada una de las muestras relativas al control del vehículo (ΔΔCT), determinar el error estándar y obtener los valores de p mediante la t de Student -test.

AR cromatina Immunoprecipication

protocolos cromatina-IP han sido adaptados de los métodos reportados previamente [33]. Las células fueron cultivadas a 70-90% de confluencia y se trataron durante 24 horas con 1 nM R1881. Las células se fijaron con formaldehído al 1% a temperatura ambiente durante 15 minutos; la reticulación se inactivó con 0,125 M de glicina en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavó con PBS enfriado en hielo. Después las células se rasparon en PBS más 1 x cóctel de inhibidor de proteasa (Roche Molecular Biochemicals; Penzberg, Alemania), los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación y las células núcleos extraídos por centrifugación a 14.000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos. Los núcleos celulares se resuspendieron y se lavaron en tampón de nucleasa microcócica (Tris [pH 7,4] 10 mM, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, espermina 0,15 mM, espermidina 0,5 mM, CaCl2 1 mM) y luego se incubaron con 10.000 U de nucleasa micrococcal para 20 minutos a 37 ° C con thermomixing suave. Los núcleos se recoge después y se resuspendieron en tampón RIPA-PIC [cloruro de sodio 150 mM, 1,0% de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, Tris 50 mM, pH 8,0 /1 × proteasa cóctel de inhibidores (Roche)] y se sometió a ultrasonidos (Fisher Scientific; Hampton, NH; modelo FB-120 de sonic Dismembrator). extractos de cromatina sonicados fueron pre-borran durante la noche a 4 ° C por incubación con proteína G-agarosa perlas tratadas con IgG normal de conejo (Cell Signaling Technology), y fragmentos de cromatina se inmunoprecipitaron con anticuerpos específicos durante la noche a 4 ° C. Para una solución diluida de la cromatina 1-ml, se utilizaron 50 g de los siguientes anticuerpos: normal de conejo IgG (Cell Signaling Technology) como control negativo; Histona H3 (Abcam; Cambridge, MA) como control positivo; y AR (N-20, Santa Cruz,) para las condiciones experimentales. Perlas se recogieron y se lavaron en TSE I buffer [0,1% Triton X-100, 2 nM EDTA, NaCl 150 mM, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1)], tampón TSE II [0,1% de SDS, 1% Triton X-100, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1)], Brown Buffer III [0,25 LiCl, 1,0% de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich; St. Louis, Mo), 1% de desoxicolato, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,1)], y dos veces con tampón TE [EDTA 1 mM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,1)]. Los fragmentos de cromatina inmunoprecipitadas se eluyeron fuera de las perlas de agarosa utilizando tampón de elución de Brown [1% SDS, 0,1 M NaHCO3, DTT 1 mM, 1 x cóctel de inhibidor de proteasa (Roche)] y se incubó durante 10 minutos a 95 ° C con thermomixing vigorosa. a continuación, la cromatina y entradas eluido se incubó durante la noche a 65 ° C con thermomixing suave para revertir entrecruzamientos. Las muestras se trataron a continuación con 2 g RNaseA (Novagen; Darmstadt, Alemania) a 37 ° C durante 15 minutos, a continuación, con 2 mg de proteinasa K a 55 ° C durante 30 minutos (Cell Signaling Technology). Por último, los fragmentos de ADN immunoprecipiated fueron extraídos por fenol-cloroformo (Sigma-Aldrich) y se sometieron a la extracción Q-RT-PCR utilizando comercialmente disponibles SimpleChIP ™ Sox2 humano promotor cis-promotor de cebadores (Cell Signaling Technology).

En vivo formación de tumores

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Chicago Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, números de protocolo 72066 y 72231). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia ketamina /xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
vivo
formación de tumores en las células CWR-R1 LAPC-4 y se llevaron a cabo a través de una inoculación subcutánea de un millón de células en 4-6 semanas de edad ratones desnudos atímicos macho (Harlan; Indianápolis, IN) usando una 75% de Matrigel y la solución de HBSS 25% (BD Biosciences). Para medir la toma de tumores en un huésped castrados, los ratones receptores fueron castrados quirúrgicamente una semana antes de la inoculación celular. Para medir la progresión de la resistencia a la castración, los huéspedes animales fueron castrados cuando los tumores alcanzaron 0,5 cm
3. Para el análisis de PSA total en circulación de la implantación del tumor y para confirmar el agotamiento de la testosterona en huéspedes castrados, se extrajo sangre mediante punción cardiaca en el punto final experimental.

Citometría de Flujo

Todas las incubaciones de anticuerpos, lavados, y flujo análisis de citometría se realizaron usando tampón de clasificación de células enfriado con hielo (1 × PBS, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 2 mmol /l de EDTA) a la luz mínima utilizando protocolos previamente comunicados [26], [31]. Las células se tiñeron con Live /Dead corregible verde kit de tinción Dead Cell (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se incubaron con FcR Reactivo bloqueante (Miltenyi Biotec; Colonia, Alemania, dilución 1:20 durante 10 minutos), y luego marcadas con /2 de anticuerpos CD133 (293C3) -APC conjugado monoclonal humano (Miltenyi Biotec) o isotipo control del ratón IgG2b-APC (Miltenyi Biotec) a una dilución 1:10 de 30-min. Después, las células se lavaron y se fijaron durante 15 minutos con 3,2% Ultra Pure EM Grado formaldehído (Polysciences, Inc .; Warrington, PA). Después de la fijación, las células se lavaron y se tiñeron con violeta FXCycle (Invitrogen, 1:1000 dilución). El análisis se llevó a cabo en un Becton Dickinson LSR II, y un mínimo de 250.000 recuentos se adquirió para cada condición experimental. FACSDiVa software fue utilizado para la adquisición de datos, y el software FlowJo se utilizó para el análisis.

flotante esferoide Ensayo de Cultivo


in vitro
esferoides flotantes se cultivan a partir de 1 × 10
5 LAPC-4 y LNCaP transducidas con cualquiera de los Medias lentiviral y vectores GFP ConFtrol [Preceiver-Lv105; GeneCopoeia (Rockville, MD)]. Las células se cultivaron en el apego Ultra-Low 25 cm
2 frascos de cultivo celular (Corning; Corning, NY) y se cultivaron en suspensión durante 5 días. Esferoides formadas después de 5 días se transfirieron a 10 cm
2 platos (Corning; Corning, NY) durante 24 horas para permitir la unión. Esferoides fueron teñidas con solución de cristal violeta (Sigma-Aldrich), se enjuagaron, y se contaron. formación de esferas se realizó por triplicado.

Análisis estadísticos

En todos los casos, los datos se reproducen utilizando múltiples repeticiones biológicos y técnicos. Los datos se analizaron usando el software SigmaPlot 11.0 utilizando un ANOVA de una vía con los procedimientos de comparación múltiple por parejas, (método de Holm-Sidak).

Resultados

Sox2 se expresa en la próstata normal las células epiteliales basales y en un subconjunto de tumores de próstata

Para evaluar la prevalencia y el patrón de expresión de la proteína Sox2 en la próstata, se realizó una evaluación inmunohistoquímica de una serie de tejidos de la próstata y los tumores humanos. Estos análisis muestran que en hiperplásicas normal y benigna tejidos de la próstata (BPH) expresión Sox2 se restringe a las células epiteliales basales (Figura 1A). Los análisis de los tumores de próstata demuestra que Sox2 es o bien uniformemente expresa o uniformemente ausente (Figura 1A). La mayoría (12 de 14) de las metástasis resistentes a la castración analizados también expresan Sox2 (Figura 1B y C). El porcentaje de Sox2-positivo tumores aumenta con la puntuación de Gleason, con un pequeño subconjunto de pronóstico favorable-puntuación de Gleason 6 tumores y la mayoría de mal pronóstico puntuación de Gleason 10 y resistentes a la castración metástasis positivo (Figura 1C). Curiosamente, los análisis de pre-maligna prostática neoplasia intraepitelial (PIN) lesiones documentaron una basal mixto y la tinción de las células epiteliales luminal (Figura 1C). Estos datos tumorales son consistentes con la observación hecha por Jia et al. utilizando un anticuerpo Sox2 diferente que muestra que la expresión se correlaciona con Gleason Grade [23]. Nuestros datos contrasta con este informe, sin embargo, como se observa una fuerte tinción basal epitelial en tejidos no malignos, así como una fuerte expresión Sox2 uniforme en un pequeño porcentaje de los tumores, en lugar de un aumento gradual en la intensidad de tinción [23]. Estos datos documentan que Sox2 se expresa de manera uniforme en un subgrupo de tumores de próstata, e indica que la expresión de Sox2 confiere un tumor único subtipo que no parece estar restringida a cáncer raro iniciar /células madre como en los tumores de próstata.

a) tinción inmunohistoquímica de Sox2 demostrando tinción representativa nuclear basal epitelial (rojo oscuro) en las glándulas normales (Región 3) #, y dos regiones tumorales distintas que son ya sea de manera uniforme Sox2-influjo positivo (Región 2) o Sox2-negativo ( región#1). B) La expresión de Sox2 en lesiones metastásicas representativas resistentes a la castración. La caja en la magnificación × 8 corresponde a la región se muestra en la imagen de 40 ×. C) Porcentaje y distribución de la expresión de Sox2 entre los estados de la enfermedad de la próstata. En condiciones normales, BPH, y los tejidos HGPIN, Sox2 se expresa en las células basales epiteliales (gris bares). Expresión positiva se define en más de un 50% de las células cancerosas positivas con una intensidad relativa de 1 o más en una escala de 0-3. En los tejidos de cáncer y metástasis, Sox2 está bien expresada de manera uniforme o ausente, y el porcentaje de tumores Sox2-positivo aumenta con la puntuación de Gleason (barras negras). HPB: Hiperplasia prostática benigna; PIN de alto grado: de alto grado neoplasia intraepitelial prostática; GS: puntuación de Gleason (N = número de muestras individuales de los pacientes analizados) guía empresas
Sox2 se co-expresada dentro de una porción de p63-positivos basales células epiteliales

La expresión de Sox2 en. células basales del epitelio-AR-negativo implica que Sox2 puede funcionar para promover la supervivencia de las células madre de la próstata y transitorios de amplificación basales, o para mantenerlas en un estado indiferenciado. En la próstata normal, la interacción paracrina entre células estromales y epiteliales es andrógeno dependiente, donde las células estromales AR-positivo producen una serie de factores de crecimiento, denominados colectivamente "andromedins" que señalan a las células epiteliales cercanos para promover la proliferación de AR-negativo, luminal las células epiteliales positivas a las células epiteliales basales p63-positivas y la supervivencia de AR-positivo /antígeno prostático específico (PSA) [34]. Para determinar qué proporción de células basales epiteliales fueron Sox2-positivo, se realizó tinción de inmunofluorescencia de co-Sox2 y p63. Estos datos muestran que 75% de las células epiteliales de la próstata basal situadas en la zona periférica de la próstata expresan tanto Sox2 y p63, mientras que el restante 25% de las células p63 expresa pero no Sox2 (Figura 2A). Esta observación implica que la expresión de Sox2 delimita dos poblaciones potenciales de las células epiteliales basales; estas células también pueden tener características fenotípicas únicas y pueden derivar tumores distintos [35].

A) Inmunofluorescencia co-tinción de Sox2 (verde) con el p63 marcador-basal específico (rojo), que muestra que el 75% de las células normales basales epiteliales son positivas tanto para Sox2 y p63 (amarillo), mientras que el 25% restante son Sox2-negativo (rojo). DAPI Destacados tinción núcleos (imágenes representativas de epitelio prostático normal adquirida a partir de tres diferentes muestras de pacientes individuales). B) Western Blot de una serie de próstata derivado del paciente (PrEC) y vender epiteliales culturas Vesícula seminal (SVEC) (PrEC) demuestra que una parte de estos cultivos expresar Sox2 detectable, mientras que otra PREC y todas las culturas SVEC no lo hacen. C) La tinción inmunocitoquímica de Sox2 que muestra la expresión de Sox2 en uniforme nuclear PrECs Sox2-positiva y la falta de células Sox2-positivo dentro PrECs Sox2-negativo (imágenes representativas de tres experimentos independientes).

En base a esto, establecimos una serie de cultivos no maligna de células epiteliales de la próstata (PrEC) a partir de tejido de próstata recién disociadas y las analizamos para la expresión Sox2. Tales cultivos PrEC no expresan niveles detectables de la proteína AR, ya que consisten en células de amplificación de transitorios sobre todo p63-positivas, junto con poblaciones menores de CD133-positivo células madre, células intermedias PSCA-positivas y células neuroendocrinas cromogranina A-positivas [ ,,,0],26], [31]. Como un control adicional, se aislaron cultivos de pacientes emparejados vesícula seminal de células epiteliales (SVEC) utilizando los mismos métodos. Los análisis de transferencia de Western documentado que las culturas PrEC eran o Sox2-positivo o negativo Sox2, y su adecuación a las culturas SVEC fueron siempre negativos (Figura 2B) [25]. Las poblaciones de células heterogéneas dentro de tales cultivos PrEC sugirieron que Sox2 puede ser altamente expresado en un pequeño subconjunto de células. inmuno análisis de la expresión de Sox2, sin embargo, documentos que la mayoría de las células dentro de las culturas PrEC Sox2-positivas expresan Sox2; mientras que hay pocos, si alguno, Sox2 células que expresan detectables en cultivos PrEC Sox2-negativas (Figura 2C). Por lo tanto, en las culturas PrEC no malignas, la expresión de Sox2 no se limita a una población de células única, tales como las células madre de próstata CD133 positivas.

Aumento del receptor de andrógenos (AR) de señalización disminuye la expresión Sox2 en las células normales de la próstata epitelial ( PrECs) y las células madre embrionarias humanas (hESCs) guía
se ha demostrado experimentalmente previamente que la activación de la señalización de andrógenos AR por la unión en las células epiteliales de la próstata induce la detención del crecimiento y la diferenciación terminal eventual en las células secretoras luminal [36] , [37], [38]. La expresión de Sox2 en las células epiteliales basales y la falta de expresión Sox2 en las células epiteliales luminales no maligno AR-positivo sugirieron que AR puede reprimir la expresión de Sox2. Utilizando cultivos PrEC Sox2-positivo, se evaluó la respuesta de la expresión de Sox2 a la expresión exógena y la inducción de ligando de tipo salvaje AR. ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga.

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