Extracto
STC1 es una hormona glicoproteína involucrada en calcio /fosfato de la homeostasis (Pi). Hay una creciente evidencia de que STC1 está estrechamente asociada con el desarrollo de cáncer. Pero la función de STC1 en el cáncer no se entiende completamente. Aquí, se encontró que STC1 es el regulado en los tejidos clínicos de cáncer de cuello uterino en comparación con los tejidos cervicales normales adyacentes (15 casos). Posteriormente, la expresión de STC1 fue derribado por la interferencia de ARN en las células CaSki de cáncer cervical y la baja expresión del crecimiento celular promovido, la migración y la invasión. También se encontró que la sobreexpresión STC1 inhibió la proliferación celular y la invasión de células de cáncer cervical. Por otra parte, la sobreexpresión STC1 sensibilizado células CaSki a las drogas. Además, se demostró que la proteína p65 de NF-kappa B unido directamente al promotor STC1 y se activa la expresión de STC1 en células de cáncer de cuello uterino. Por lo tanto, estos resultados proporcionan evidencia de que STC1 inhibió la proliferación celular y la invasión a través de la activación de p65 NF-kB en el cáncer cervical
Visto:. Guo F, Li Y, Wang J, Li Y, Li Y, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) inhibe la proliferación celular y la invasión de células de cáncer cervical. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10.1371 /journal.pone.0053989
Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2012; Aceptado: 5 de diciembre de 2012; Publicado: 29 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.672.352) y el Proyecto de Innovación de la Educación de Postgrado de la Universidad central del Sur (Nº 2340 hasta 74334,000006 millones). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Stanniocalcin1 (STC1) es una hormona glicoproteína que participan en la homeostasis del calcio fosfato /(Pi), que fue descubierto originalmente en una hormona secretora de los corpúsculos de Stannius, una glándula endocrina de los peces óseos [1]. El STC1 de mamífero se expresa ampliamente en varios tejidos incluyendo el corazón, pulmón, hígado, suprarrenal, riñón, ovario, próstata, colon y el bazo [2] - [5]. STC1 juega un papel diverso en procesos fisiológicos y patológicos, como el embarazo, la lactancia, la angiogénesis, la organogénesis, el estrés oxidativo, la isquemia cerebral, y la apoptosis [6] - [10]. Un ortólogo humano de STC1 peces fue encontrado por ARNm de expresión diferencial de genes relacionados con el cáncer [11]. STC1 se clonó originalmente en una pantalla de genes relacionados con el cáncer. Numerosas líneas de estudios indicaron que la expresión alterada de STC1 puede tener un papel en la carcinogénesis y el desarrollo. El aumento de la expresión de genes STC1 se ha encontrado en hepatocelular, colorrectal, leucemia aguda, y carcinomas medulares de tiroides, sin embargo, disminuyó la expresión de expresión STC1 se encontró en mama y líneas celulares de cáncer de ovario [12] - [19]. Pero la relación entre la expresión diferencial de STC1 en el tumor en comparación con el tejido normal y su función biológica necesita más investigación. Algunas estudio indicó que la expresión STC1 estuvo involucrado en la formación de la vasculatura del tumor, y puede inducir STC1 adaptativo de respuesta a la hipoxia por la regulación de HIF en las células de cáncer humano [20], [21]. Se ha informado de que la apoptosis celular inducida por inhibidor de histona desacetilasa implica la activación STC1 [22].
A pesar de un mayor conocimiento de STC1, existe poca función de STC1 conocidos en la progresión del cáncer. En este estudio, hemos examinado el papel de la expresión génica en el cáncer de cuello de útero STC1 humano. Se encontró que STC1 se había reducido regulado en los tejidos clínicos de cáncer de cuello uterino. Posteriormente, se encontró que STC1 baja expresión promovió el crecimiento celular, la migración y la invasión. También se encontró que la sobreexpresión STC1 inhibió la proliferación celular y la invasión de células de cáncer cervical. Por otra parte, la sobreexpresión STC1 sensibilizado células CaSki a las drogas. Estos datos apoyan la función pro-apoptótica de STC1. Además, se demostró que la proteína p65 de NF-kB ligado directamente al promotor STC1 y activa la expresión de STC1 en células de cáncer de cuello uterino.
Resultados
STC1 se había reducido regulado en los tejidos clínicos de cáncer de cuello
Para explorar el papel de STC1 en el cáncer de cuello uterino, lo primero que examinó el nivel de expresión de ARNm en 15 pares de tejidos del cuello uterino emparejados por RT-PCR. El nivel de expresión de ARNm STC1 en tejidos de cáncer de cuello uterino se redujo en comparación con los normales adyacentes (Figura 1A y B). Entonces, el análisis de inmunohistoquímica reveló que el nivel de proteína de STC1 fue baja en los tejidos tumorales, y mientras que el aumento en los tejidos normales adyacentes, lo que indica su papel potencial en la progresión del cáncer cervical (Figura 1C y D).
(A ) El nivel de expresión de mRNA en STC1 canceroso (T) y adyacente normal (N) corresponde tejidos del cuello uterino se examinó por RT-PCR. GAPDH sirvió como control de carga. gráfico de trama (B) Caja mostró los resultados cuantitativos de la expresión de ARNm STC1 en todos los pares de muestras (
p Hotel & lt; 0,05). nivel (C) Proteína de STC1 en los tejidos tumorales y normales se examinaron mediante análisis de inmunohistoquímica. tamaño de la barra: 100 micras. (D) Análisis Cantidad de nivel de proteínas de expresión STC1. La intensidad de la reactividad se obtuvo usando un sistema de tres niveles (
p Hotel & lt; 0,05). Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos separados. Un valor de P & lt;. 0,05 se consideró como significación estadística
El descenso de regulación de STC1 Promovido células CaSki crecimiento y la invasión
Para estudiar la función biológica de STC1, generamos RNAi vector que contiene siRNA STC1 dirigido específicamente para golpear de forma estable por la expresión endógena de STC1 en las células CaSki. Como se muestra en la Figura 2A, en comparación con el control (CaSki /NC), las células transfectadas con siRNA -STC1 habían disminuido significativamente los niveles de mRNA o proteína STC1.
(A) Golpear abajo de STC1 en las células CaSki. células CaSki fueron transfectadas por STC1 orientación siRNA, y la eficiencia desmontables se muestran mediante RT-PCR y Western Blot. ensayos (B) MTT demostraron que el efecto de disminución de STC1 sobre el crecimiento celular CaSki. Después de un período de 7 días, el crecimiento de las células CaSki /siRNA era mucho más rápido que las células CaSki /NC (*
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& lt; 0,05). ensayo (C) La formación de colonias demostró el gran número de colonias de células a partir de células CaSki /siRNA comparación con las células CaSki /NC (
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& lt; 0,05). (D) la curación de heridas ensayos mostraron el efecto de STC1 sobre la migración de las células CaSki. CaSki /células siRNA migró más rápido en comparación con las células CaSki /NC (panel izquierdo). La distancia de migración relativa de células se calculó CaSki (panel derecho) (
p Hotel & lt; 0,05). tamaño de la barra: 100 micras. ensayos de invasión (E) de Matrigel mostraron el efecto de STC1 en la invasión de las células CaSki. El número de células CaSki /siRNA sobre la superficie del filtro era más grande que las células CaSki /NC (panel izquierdo) (
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& lt; 0,05). El valor medio de las células invadidas se muestra en el panel derecho. tamaño de la barra: 100 micras. (F) Las curvas de crecimiento de los xenoinjertos fueron determinados por el volumen del tumor (panel izquierdo) (*
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& lt; 0,05). Las tasas de crecimiento de los xenoinjertos se valoran mediante el volumen tumoral /días (panel derecho) (*
p Hotel & lt; 0,05). Se inyectaron células CaSki /o siRNA CaSki /NC por vía subcutánea en ratones desnudos. (G) Al final del período experimental, se demostró que los tumores de xenoinjertos finales. (H) RT-PCR se analizó la expresión de STC1 en los tumores de xenoinjertos representativos. (I) Imágenes representativas de la inspección histológica de los tumores de xenoinjertos. Las secciones de los xenoinjertos de tumores fueron teñidas con H & amp; E. tamaño de la barra: 20 micras. Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos separados. Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos separados. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró como significación estadística
A continuación, se analizó el efecto de la disminución en el crecimiento celular STC1 CaSki mediante ensayos de MTT.. Después de un período de 7 días, el crecimiento de las células CaSki /siRNA era mucho más rápido que las células CaSki /NC, y no se observaron significativamente altos números de células CaSki /siRNA de día 4 (Figura 2B). Un patrón similar de promover efecto de la expresión STC1 reducida en las células CaSki se logró en el ensayo de formación de colonias (Figura 2C). Por lo tanto, la alta actividad y un gran número de colonias de células a partir de células CaSki /siRNA demostraron que la regulación por disminución de la expresión STC1 promovió el crecimiento celular in vitro.
migración celular y la invasión es importante proceso de desarrollo del tumor y la metástasis. A continuación, se examinó el efecto de STC1 sobre la migración de las células CaSki por el ensayo de curación de herida en la Figura 2D. Después de la incubación de las células físicamente herido por 48 h, las células CaSki /siRNA migraron más rápido en comparación con las células CaSki /NC. Un análisis más detallado del impacto de STC1 en CaSki células invasión reveló que la baja regulación de STC1 mejoró la invasión de las células in vitro, determinado por el ensayo de invasión de Matrigel (Figura 2E). La distancia significativamente más larga de números grandes de migración y de células CaSki /siRNA sobre la superficie del filtro indicó que la baja regulación de STC1 mejoró la capacidad de migración e invasión de células CaSki in vitro.
A fin de determinar el papel de STC1 en la tumorigenicidad y el desarrollo de cáncer cervical, CaSki /siRNA o células CaSki /NC se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. El desarrollo de tumor se monitorizó durante 40 días. Como se muestra en la Figura 2F, los tumores desmontables STC1 surgieron más temprano y crecieron rápidamente en comparación con los tumores de control. Al final del período experimental, se encontró que los pesos finales de STC1 desmontables tumores (1.417 ± 0.169 g) ser notablemente mayor que los controles (0,478 ± 0,115 g) (Figura 2G). RT-PCR de STC1 en xenoinjertos de tumores representante indicó que la disminución de la expresión STC1 se había mantenido a lo largo transcurso de tiempo experimental (Figura 2H). H & amp; E tinción de los tumores desmontables STC1 mostraron una elevada relación núcleo /citoplasma, grande, y los núcleos profundamente teñida en comparación con los tumores de control (Figura 2I). En conjunto, estos datos evidencian que la regulación a la baja de STC1 promovió el desarrollo de tumores de xenoinjerto in vivo.
La sobreexpresión de STC1 inhibe la proliferación celular y la invasión de las células CaSki
Dado que la baja regulación de STC1 promovió células CaSki el desarrollo in vitro o in vivo, se planteó la hipótesis de que STC1 puede inhibirse CaSki desarrollo de las células. Para probar esta hipótesis, las células CaSki fueron transfectadas con plásmido que codifica STC1. En comparación con el control (CaSki /NC), células (CaSki /STC1) transfectadas con el plásmido que codifica STC1 ha aumentado los niveles de mRNA o proteína STC1 (Figura 3A). ensayos de MTT demostraron que el crecimiento de las células CaSki /STC1 fue mucho más lento que las células CaSki /NC (Figura 3B). ensayo de formación de colonias mostró que una pequeña cantidad de colonias de células a partir de células /STC1 CaSki demostró una baja actividad (Figura 3C). ensayo de invasión de Matrigel reveló que la sobre regulación de STC1 mitigado la invasión de las células in vitro (Figura 3D).
(A) La sobreexpresión de STC1 en las células CaSki. vector de expresión STC1 se transfectó en células CaSki, y aumento de la expresión de STC1 se demostró por RT-PCR y Western Blot. ensayos (B) MTT demostraron que el crecimiento de las células CaSki /STC1 fue mucho más lento que las células CaSki /NC (*
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& lt; 0,05). ensayo de formación de (C) de colonias mostró que una pequeña cantidad de colonias de células a partir de células /STC1 CaSki demostró una actividad baja (
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& lt; 0,05). ensayo de invasión (D) Matrigel reveló que la sobre regulación de STC1 mitigado la invasión de las células in vitro. tamaño de la barra: 100 micras. (E) STC1 sobreexpresa tumores surgieron después y crecieron lentamente en comparación con los tumores de control (*
p Hotel & lt; 0,05). (F) Al final del período experimental, se encontró que los pesos finales de los tumores sobreexpresan STC1 a ser más bajos que los controles. (G) RT-PCR de STC1 en los tumores de xenoinjertos indicado que el aumento de expresión STC1 se ha mantenido a lo largo de transcurso de tiempo experimental. (H) H & amp; E tinción de los tumores STC1 sobreexpresados mostró una baja relación núcleo /citoplasma, y se limita a los nidos de cáncer en comparación con el control de los tumores. tamaño de la barra: 20 micras. Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos separados. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró como significación estadística se inyectaron células
A continuación, CaSki /o STC1 CaSki /NC por vía subcutánea en ratones desnudos.. STC1 sobreexpresa tumores surgieron después y crecieron lentamente en comparación con los tumores de control (Figura 3E). Al final del periodo experimental, los pesos finales de los tumores sobreexpresan STC1 (0,285 ± 0,057 g) fueron más bajos que los controles (0,523 ± 0,154 g) (Figura 3F). RT-PCR de STC1 en los tumores de xenoinjertos indicado que el aumento de expresión STC1 se ha mantenido a lo largo de transcurso de tiempo experimental (Figura 3G). H & amp; E tinción de los tumores STC1 sobreexpresados mostraron una baja relación núcleo /citoplasma, y se limita a los nidos de cáncer en comparación con los tumores de control (Figura 3H). En conjunto, estos datos sugieren que la regulación de STC1 inhibe la proliferación celular y la invasión de las células CaSki in vitro o in vivo.
STC1 sensibilizados CaSki células a las drogas
Los resultados anteriores demostraron que STC1 puede inhibir proliferación celular de las células CaSki. El cisplatino, thapsigargin y rapamicina son fármacos asociados con el crecimiento de células y la apoptosis. a base de cisplatino quimioterapia de combinación ha sido comúnmente utilizado en la terapia tumoral incluyendo el cáncer cervical [23]. Tapsigargina como un agente apoptótico puede exhibir efectivamente el control del tumor basado en la capacidad de inhibir la bomba de calcio sarcomas /endoplasmtic intracelular [24], [25]. El objetivo de mamífero de la rapamicina es una proteína serina /treonina quinasa de la ruta de señalización de PI3K /AKT, que desempeña un papel crítico en el control del crecimiento celular del cáncer, el metabolismo y la progresión del ciclo celular [26]. A continuación, las células CaSki fueron tratadas con con o sin cisplatino (0, 1, 2, y 3 mg /L), tapsigargina (0, 1, 3, 6, y 9 M), o rapamicina (0, 0,01, 0,1, 0,5 , y 1 mg /L) durante 96 h o 72 h, la eliminación de alícuotas cada 24 h para evaluar la viabilidad celular. Se encontró que el crecimiento de las células CaSki fue lento con la mejora del tiempo y la concentración de los fármacos (Figura 4A-C). Para determinar si la expresión de STC1 aumentó retardar el crecimiento de células inducida por fármacos, CaSki /STC1 o CaSki /NC se trataron con diferentes fármacos como cisplatino, thapsigargin y rapamicina. El crecimiento de las células /STC1 CaSki fue más lento con el aumento de tiempo en comparación con las células CaSki /NC cuando las células se trataron con cisplatino, thapsigargin o rapamicina (Fig. 4D-F). Estos datos demostraron que la sobreexpresión de STC1 aumentó la sensibilidad de las células CaSki a las drogas.
(A) Efecto de cisplatino en CaSki crecimiento celular. células CaSki fueron tratadas con con o sin cisplatino (0, 1, 2, y 3 mg /L) durante 96 h, la eliminación de alícuotas cada 24 h para evaluar la viabilidad celular. (B) Efecto de thapsigargina en CaSki crecimiento celular. células CaSki fueron tratadas con o sin con tapsigargina (0, 1, 3, 6, y 9 mM) durante 72 h, la eliminación de alícuotas cada 24 h para evaluar la viabilidad celular. (C) Efecto de la rapamicina sobre CaSki crecimiento celular. células CaSki fueron tratadas con rapamicina con o sin (0, 0,01, 0,1, 0,5, y 1 mg /L) durante 72 h, la eliminación de alícuotas cada 24 h para evaluar la viabilidad celular. células CaSki (D) STC1 sensibilizados a cisplatino. células CaSki /STC1 o CaSki /NC se trataron con cisplatino (2 mg /L) durante 96 h. ensayos de MTT detectan el crecimiento de las células de CaSki /STC1 o células CaSki /NC en la cara de cisplatino (*
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& lt; 0,05). células (E) STC1 CaSki sensibilizado a thapsigargina. células CaSki /STC1 o CaSki /NC se trataron con tapsigargina (3 M) durante 72 h. ensayos de MTT detectan el crecimiento de las células de CaSki /STC1 o células CaSki /NC en la cara de thapsigargin (*
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& lt; 0,05). (F) STC1 sensibilizado células CaSki a la rapamicina. células CaSki /STC1 o CaSki /NC fueron tratados con rapamicina (0.5 mg /L) durante 72 h. ensayos de MTT detectan el crecimiento de las células de CaSki /STC1 o células CaSki /NC en la cara de la rapamicina (*
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& lt; 0,05). Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos separados. Un valor de P & lt;. 0,05 se consideró como significación estadística
Unión directa de NF-kB proteína p65 a STC1 región promotora en células de cáncer cervical y regulada la expresión de STC1
La factor nuclear kappa B (NF-kB), la familia de factores de transcripción regula la expresión de una gran cantidad de genes que incluyen proliferación y la invasión genes. ruta de NF-kB desempeña un papel fundamental en los cánceres y enfermedades cardiovasculares. El promotor de STC1 contiene múltiples NF-kB de unión a p65 sitios [27]. Para comenzar a explorar más los mecanismos entre la correlación de STC1 y p65, los sitios de unión fueron probados en células CaSki por coimmunoprecipitation cromatina. Se encontró que el sitio (-GGGACAAACC-) que se unen a p65 NF-kB (Fig. 5A). Para determinar si la expresión en las células CaSki STC1 se correlacionó con NF-kappa B, la actividad de NF-kB fue detectado. Acompañando con mayor actividad de PARP y la caspasa-3, la actividad de p65 NF-kappa B y STC1 también aumentó cuando las células CaSki fueron tratadas con tapsigargina (Fig. 5B). TNF activa las vías de apoptosis después de la inducción simultánea de NF-kB. Para determinar si la expresión de STC1 aumentó de manera similar en la apoptosis inducida por TNF-, las células CaSki fueron tratadas con el tiempo de TNFa en aumento. La expresión de p65 NF-kappa B aumenta y la actividad de STC1 y la caspasa-3 mejorada en respuesta a TNF (Fig. 5C). Pirrolidina ditiocarbamato (PDTC) es un inhibidor eficaz de la activación de NF-kB y suprime la transcripción dependiente de NF-kB de citoquinas pro-inflamatorias en y quimiocinas [28]. Cuando las células CaSki fueron tratadas con PDTC, la actividad de p65 NF-kappa B disminuye y la expresión de STC1 el regulado con el tiempo de PDTC (Fig. 5D) en aumento. Por otra parte, después de la caída de p65 se realizó mediante la transfección de siRNA dirigidos p65 NF-kB, la expresión subcelular de p65 en las células y STC1 CaSki fue analizado (Figura 5E). La expresión de p65 en el citoplasma y el núcleo tanto disminuye, y mientras el uno en el núcleo reduce significativamente. La expresión STC1 abajo de la regulación en el núcleo también se encontró después de la caída de p65. La caída de p65 provocó la expresión de p65 y STC1 tanto la disminución en el nivel de mRNA (Figura 5F).
(A) los sitios de unión de STC1 se ensayaron en células CaSki por coimmunoprecipitation cromatina. Se encontró que el sitio que se unen a p65 NFkB. (B) transferencia de Western detecta la actividad de PARP, caspasa-3, STC1, y NF-kappa B p65 en las células CaSki. células CaSki fueron tratadas con tapsigargina (3 M) durante 12 h. (C) de transferencia Western detectó la actividad de p65, STC1, y la caspasa-3 en células CaSki. células CaSki fueron tratadas con el aumento del tiempo de TNF (10 mg /L) durante 2,5 h. (D) de transferencia Western detectó la actividad de p65 y STC1 en las células CaSki. células CaSki fueron tratadas con PDTC (10 mM) durante 60 min. (E) la actividad subcelular de p65 y STC1 en las células CaSki se analizó por transferencia Western. células CaSki fueron tratadas con siRNA desmontables de p65 durante 72 h. (F) La expresión de p65 y STC1 en CaSki fue detectado por RT-PCR a nivel de mRNA. células CaSki fueron tratadas con siRNA desmontables de p65 durante 48 h. (G) Representación esquemática de algunos de los hallazgos en este trabajo.
Discusión
Hay una creciente evidencia de que STC1 está estrechamente asociada con el desarrollo de cáncer. Sin embargo, la expresión de STC1 varió en diferentes tejidos e incluso para el mismo tejido en diferentes niveles (ARNm o proteína), y por lo tanto la función de STC1 podría mostrar la diferencia [29]. En este estudio, se encontró que STC1 inhibió la proliferación celular y la invasión de células de cáncer cervical. STC1 es el regulado en los tejidos clínicos de cáncer de cuello uterino, lo que indica STC1 está implicado en la progresión del cáncer de cuello uterino. En el cáncer de cuello uterino, la baja expresión de STC1 podría causar el desarrollo de tumores. Posteriormente, se encontró que STC1 baja expresión promovió el crecimiento celular, la migración y la invasión después de la baja regulación de STC1 por la interferencia de ARN en las células del cáncer de cuello uterino. Además, también se encontró que STC1 sobreexpresión inhibe la proliferación celular y la invasión de células de cáncer de cuello uterino. Por otra parte, la sobreexpresión STC1 sensibilizado células CaSki a las drogas. Estos datos apoyan la opción que STC1 puede inhibir la progresión del tumor para el cáncer cervical. La pérdida de la función de STC1, que inhiben el crecimiento y la invasión de las células tumorales, podría conducir a la progresión tumoral en el cáncer de cuello uterino.
El promotor del gen STC1 contiene HIF y el sitio de unión de NF-kB. Se ha informado de que se requería HIF-1α unido al promotor y p300 gen STC1 para una interacción productiva con HIF-1 y la regulación al alza de STC1 mRNA y expresión de la proteína [30]. Chen et al pensó que STC1 bloqueado parcialmente la activación de NF-kB en las células TNF-a-tratada humanos coronarias endoteliales de la arteria [31]. Law et al informaron de que la histona hiper-acetilación y la contratación de NFkB activadas estimulan la expresión de genes en las células HT29 STC1 [22]. La relación entre STC1 y NF-kB es diferente en diferentes tipos tejidos. Hemos demostrado que la proteína p65 de NF-kB ligado directamente al promotor STC1 y regula la expresión de STC1 en células de cáncer de cuello uterino. Estos resultados tienen implicaciones clínicas potenciales. Nuestros resultados sugieren que el aumento de la expresión de STC1 debe ser una buena estrategia para inhibir la proliferación e invasión tumoral y también podría ser un tratamiento combinado con fármacos quimioterapéuticos viable en el cáncer de cuello uterino.
Desde arriba estos resultados, se propuso la modelo para la inhibición mediada por STC1 de la progresión del tumor (Figura 5): Después de la activación de la p65 de NF-kappa B, la expresión STC1 aumentó. La expresión STC1 elevada disminuyó la progresión del tumor, y por consiguiente la sensibilidad de las células de cáncer cervical con la expresión STC1 elevada para el medicamento de quimioterapia aumentó. Por lo tanto, más estudios para dilucidar son profundamente los mecanismos implicados en la inhibición mediada por STC1 de la progresión tumoral y para explorar más a fondo lo que otras moléculas participan en la progresión.
Materiales y Métodos
Muestras e inmunohistoquímica
los casos de cáncer de cuello de útero y los tejidos normales adyacentes se obtuvieron en los protocolos aprobados por el hospital secundaria Xiangya de la Universidad central del Sur. características clínico-patológicas de los 15 pacientes con cáncer de cuello uterino se mostraron en la Tabla S1. secciones de parafina fueron desparafinados con xileno y rehidratada clasificado en el alcohol. la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación en peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante 10 min. La unión no específica fue bloqueada con PBST que contenía 10% de suero de cabra durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo STC1 (Santa Cruz Biotechnology) para cada portaobjetos y se incubó a 4 ° C durante la noche. Después de tres lavados, los portaobjetos se incubaron con Envision (DAKO) durante 40 min a RT. Diaminobencidina se utilizó como cromógeno. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Evaluación de diapositivas de inmunohistoquímica se realizó con un microscopio Nikon Eclipse E800 a 200 × magnificación. La intensidad de la reactividad se obtuvo usando un sistema de tres niveles: 0-3 (0 = sin manchas, 3 = 100% de tinción). La puntuación inmunorreactiva de la muestra se determinó por el porcentaje de células positivas. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Xiangya, Universidad Central del Sur.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
ARN aislado de los tejidos y las células se transcribió inversamente y amplificada mediante el sistema inverso SOLO PASO PCR con transcripción (Fermentas). Las secuencias de cebadores usados se muestran en la Tabla S2. Después de calentar a 95 ° C durante 1 min, PCRs se expusieron a 30 ciclos (GAPDH, 25 ciclos) de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 68 ° C durante 1 min 30 s con una extensión final a 68 ° C durante 10 min. El valor de la densidad integrada (IDV) de cada banda se evaluó mediante Gel-Pro Image Analyzer (Bio-Rad, Hercules, CA), y las proporciones de los valores IDV se calcularon para evaluar los niveles relativos de expresión del ARNm.
Cell Cultura
CaSki células de cáncer cervical humano se mantuvieron por nuestro laboratorio y se cultivaron en medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado con 10% de suero bovino de ternero (BCS) (Gibco). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de aire humidificado con un 5% de CO2.
Construcción de vectores y transfección celular
Para derribar la expresión STC1, se utilizó pRNAT-U6.1 /Neo vector que codifica una pequeña horquilla de ARN dirigido contra el gen diana en las células CaSki. Las secuencias diana para STC1 eran 5'-TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 '(CaSki /siRNA). Utilizamos control universal negativo como control negativo (CaSki /NC).
Para la transfección de la STC1 humano plásmido de expresión de vector que codifica la secuencia de ADN que contiene el marco de lectura abierto STC1 flanqueada por sitios de restricción HindIII-XhoI se amplificó por PCR a partir de células CaSki. Las secuencias de cebadores utilizados fueron 5'-sentido GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG 3 'y 5' antisentido TTCTCGAGTTATGCACTCTC ATGG -3 '. El fragmento resultante se insertó en HindIII /XhoI -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) para generar pcDNA3.1- STC1. La secuencia deseada se confirmó mediante secuenciación directa del ADN.
Para la transfección, las células de cáncer cervical fueron cultivadas a 70% de confluencia y se transfectaron en medio libre de suero durante 6 h con lipofectamina 2000 (Invitrogen) y vector. Después de 48 h, se recogieron las células, seguido por dilución limitada en placas de 96 pocillos para la generación de clones de células individuales. Tres semanas más tarde, los niveles de expresión STC1 en clones de células que habían sido infectadas con los vectores, se caracterizaron para la proteína STC1 y mRNA.
MTT y la formación de colonias
ensayo de MTT se realizó como se informó anteriormente [32]. Para el ensayo de formación de colonias, las células en 100 células por pocillo en placas de 60 mm fueron cultivadas en 10% de FBS DMEM a 37 ° C con CO2 al 5% durante 3 semanas. Las colonias de células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 15 min y se tiñeron con Gimsa para 30 min. Se contaron los clones individuales con más de 50 células. Se calculó la eficiencia de formación de Clone para el tipo individual de células, de acuerdo con el número de colonias /número de células inoculadas x 100%.
Monocapa Curación de Heridas y la invasión ensayos
ensayo
Para monocapa cicatrización de heridas, las células fueron cultivadas en 10% de FBS DMEM en placas de 60 mm. Después de que las células alcanzaron la sub-confluencia, las células de la monocapa fueron heridos por el raspado de las células y luego cultivadas en medio durante 48 h. La distancia migrada de las células CaSki fue supervisado y la imagen bajo el microscopio. Las distancias de migración de células se calcularon restando la distancia entre los bordes de la lesión a las 48 h de la distancia medida a 0 h. La distancia de migración relativa de las células se mide por la distancia de la migración celular /la distancia medida a 0 h. Para el ensayo de invasión, las células en 10
4 /pocillo fueron sembradas en las cámaras superiores en 200 l DMEM-FBS libre y los pocillos inferiores se llenó con 500 l 10% de FBS DMEM para inducir la migración celular. Después de la incubación durante 24 h, las células en la superficie del filtro se fijaron con formaldehído al 4%, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta, y se examinaron con un microscopio. Las células en al menos seis campos microscópicos al azar (200 ×) se contaron.
Análisis Western Blot
Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en tampón de Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 50 mM, y 0,01% de azul de bromofenol) durante 5 min a 95 ° C. Los lisados celulares se analizaron por SDS /PAGE y se transfirieron electroforéticamente a membrana de difluoruro de polivinilideno. Las transferencias se sondaron con anticuerpos específicos de una etapa de detección secundaria. Las proteínas inmunorreactivas fueron revelados por un kit ECL. Western blot se llevó a cabo usando los siguientes anticuerpos: Conejo anti-STC1 anticuerpo (Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-fosfo-NF-kB anticuerpo p65 (Cell Signaling Technology), anticuerpo de conejo anti-PARP (Cell Signaling Technology), anti conejo se examinó -Caspase 3-anticuerpo (Señalización celular Tecnología).
en vivo crecimiento tumoral Ensayo
la influencia de STC1 en el desarrollo de tumores de carcinoma de cuello uterino in vivo. Las células en 5 × 10
6 por ratón se inyectó a /c ratones desnudos por vía subcutánea en 4 semanas de edad Balb (n = 4 por grupo, Shanghai Laboratory Animal Center, de Shanghai, China). Los pares experimentales se realizaron en diferentes ratones. El desarrollo y crecimiento de tumores sólidos se monitorearon midiendo el tamaño del tumor usando un calibre vernier de una manera ciega cada cinco días durante un período de 40 días. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula: volumen del tumor (mm
3) = anchura (mm)
2 x longitud (mm) x 0,5 [33]. Al final del experimento, todos los ratones fueron sacrificados y pesos de los tumores individuales se midieron utilizando un equilibrador.
Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina
chip de ensayo se llevó a cabo usando el kit de ensayo ChIP según las instrucciones del fabricante (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York) y el anticuerpo contra p65 NF-kB (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.). cebadores de inmunoprecipitación de la cromatina fueron diseñados para amplificar un fragmento que contiene el promotor STC1. Las secuencias de los cebadores utilizados se muestran en la Tabla S2.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± SEM. La diferencia entre los grupos se determinó mediante análisis de varianza y comparación entre los dos grupos se analizó mediante la prueba t de Student con el software GraphPad Prism versión 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Un valor de P & lt; 0,05 se consideró como significación estadística
Apoyo a la Información sobre Table S1..
características clínico-patológicas de los 15 pacientes con cáncer de cuello uterino.
doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s001 gratis (DOC) sobre Table S2.
Primer para RT-PCR.
doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s002 gratis (DOC)