Extracto
Antecedentes
El tumor derivado de factores solubles, incluyendo moléculas de HLA solubles, pueden contribuir al cáncer de escape inmune y por lo tanto impacto en la evolución clínica de las enfermedades malignas. Hemos informado anteriormente de que las células de melanoma producen,
in vitro
, formas solubles de la clase no clásica MHC I molécula HLA-E (sHLA-E). Con el fin de investigar sHLA-E de producción en diversos tumores y para hacer frente a su valor potencial como un marcador asociado a un tumor, se desarrolló un ELISA específico para la cuantificación de sHLA-E en fluidos biológicos.
Metodología /Principales conclusiones
hemos desarrollado un sHLA-e específica y sensible ELISA y se demostró que los niveles séricos de sHLA-e fueron significativamente elevados (P & lt; 0,01) en pacientes con melanoma (n = 127), en comparación con donantes sanos (n = 94 ). sHLA-E también se detectó en los sobrenadantes de cultivo de una amplia variedad de líneas de células tumorales (n = 98), incluyendo melanomas, riñón, colorrectal y los cánceres de mama. la regulación de la producción de citoquinas sHLA-E por las células tumorales también se llevó a cabo. IFN-γ, IFN-α y TNF-α se encontraron para regular positivamente la producción de sHLA-E por las células tumorales.
Conclusiones /Importancia
A la vista de la liberación amplio tejido tumoral de HLA-E y su regulación por citoquinas inflamatorias, sHLA-e debe ser estudiado por su implicación en la respuesta inmune contra los tumores. Curiosamente, nuestros resultados demostraron una asociación positiva entre la presencia de suero sHLA-E y melanoma. Por lo tanto, la determinación de los niveles de sHLA-E, utilizando el enfoque de ELISA, puede ser investigado como un marcador clínico en pacientes con cáncer
Visto:. Allard M, R Oger, Vignard V, Percier JM, Fregni G, A Périer , et al. (2011) Suero Soluble HLA-E en Melanoma: un nuevo potencial inmunológico relacionado con marcador de cáncer. PLoS ONE 6 (6): e21118. doi: 10.1371 /journal.pone.0021118
Editor: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recibido: 10 de mayo de 2011; Aceptado: 19-may de 2011; Publicado: 21 de junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Allard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones concedidas por la "Ligue Nationale contre le Cancer" (labellisation 2007). El donante no tiene ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Evidencias acumuladas demuestran la capacidad del sistema inmunitario para identificar y destruir las células malignas, con el fin de prevenir el desarrollo de tumores. Este proceso llamado inmunovigilancia cáncer, se basa en la acción conjunta de los efectores de innatas (células NK, células NKT, γδ T y células dendríticas) y adaptativa (células específicas de antígeno T y B) la inmunidad para detectar y erradicar naciente transformadas Células. Sin embargo, a pesar de la existencia de antígenos tumorales inmunogénicas bien definidos, e incluso en la presencia de células T citotóxicas tumoral antígeno-específicos, el sistema inmunológico no parece ser totalmente eficaz en la erradicación de tumores [1].
Varios mecanismos han sido implicados en escape inmune tumor, incluidas las modificaciones estructurales y funcionales de los antígenos leucocitarios humanos (HLA), que representan eventos frecuentes en los cánceres. Esto incluye HLA de clase I clásico antígeno (HLA-A, -B, -C) la pérdida o regulación a la baja y aberrante expresión de antígenos no clásicos HLA de clase I (HLA-E, -G), proporcionando mecanismos que conducen a una disminución en el reconocimiento y la destrucción de las células tumorales por efectores citotóxicos inmunes (principalmente las células CTL y NK) [2]. El interés por las moléculas de HLA no clásicas se ha visto estimulado por la demostración de que puedan contribuir a NK y T de escape de las células tumorales de células a través de su interacción con los receptores inhibidores NK [3] - [6]. Además, la producción de no unidos a células moléculas solubles de HLA (sHLA) también se ha descrito y puede representar una estrategia alternativa para el cáncer de escape inmune [7], [8]. En apoyo de esta hipótesis, las moléculas de sHLA se han demostrado inducir
vitro
inhibición y /o la apoptosis de CTL y NK [9], [10]. Por otra parte, el aumento de los niveles séricos de sHLA clásico y no clásico se han descrito en varias enfermedades malignas, y su relevancia pronóstica es sugerido por asociación estadísticamente significativa con la enfermedad de la etapa alta o con especial curso clínico en diversos tumores malignos [11].
Hemos observado anteriormente, en colaboración con los patólogos, una expresión frecuente de HLA-e por melanomas y carcinomas de colon [12]. Estudios de nuestro grupo y otros apoyaron un potencial inmunosupresor de esta expresión, a través del compromiso de la NKR inhibidor CD94 /NKG2A sobre las células citotóxicas (NK y CD8 TIL) de la membrana de las células tumorales HLA-E [13] - [16]. También informó de que las líneas celulares de melanoma pueden producir formas solubles de HLA-E (sHLA-E)
in vitro
, por el derramamiento de la proteasa dependiente de moléculas de superficie, y que esta producción se incrementó por el IFN-γ [12] .
el objetivo del presente proyecto consistía en desarrollar un ensayo de ELISA para la detección y la cuantificación de sHLA-e en fluidos biológicos, para validar su especificidad y, si es adecuado, para hacer frente a la importancia clínica de sHLA- e niveles en la sangre de pacientes con melanoma.
resultados
Desarrollo de un HLA-e ELISA específico
Para detectar y cuantificar sHLA-e en muestras biológicas, desarrollamos una ELISA sándwich utilizando no competitivos de captura sólido y detección biotinilado anti-HLA-e anticuerpos monoclonales MEM-e /08 y MEM-e /07, respectivamente. En primer lugar se puso a prueba un rango de concentración de un purificada soluble recombinante HLA-E (rsHLA-E). A mostrada en la Figura 1A, rsHLA-E se detectó a una concentración mínima de 5 pg /ml. Teniendo en cuenta los informes sobre la reactividad cruzada de ambos anti-HLA-E con el ABS de cuatro HLA clase Ia formas alélicas: HLA-A23, -B7, B8 y -B27, que entonces nos registramos su detección usando nuestro ensayo ELISA diseñado. Entre recombinante soluble HLA-A23, -B7, B8 y -B27 así como rsHLA-A2 utiliza como control negativo, sólo se obtuvo una señal débil con rsHLA-B7 a la dosis máxima de 20 ng /ml (Fig. 1B).
A /Detección de sHLA-E utilizando diluciones seriadas de monómero de HLA-E recombinante. El área gris indica el rango de niveles medibles sHLA-E. B /Determinación de la especificidad de unión de HLA-E. diluciones seriadas de HLA-A2, -A23, -B7, B8 y -B27 monómeros solubles recombinantes han sido probados en comparación con monómero de HLA-E recombinante.
Estos resultados llevaron a la conclusión de que la sándwich ELISA descrito aquí es altamente específico y sensible para HLA-e y podría ser utilizado como un método de cribado para la detección de sHLA-e en muestras biológicas.
Aumento soluble HLA-e en el suero de pacientes con melanoma
Se seleccionaron sueros de 94 donantes sanos y 127 pacientes con melanoma y sin terapia actual para la presencia de sHLA-e (Tabla 1). Detectamos sHLA-E en muestras de suero de donantes sanos y de pacientes de una manera dilución dependiente (Fig. 2A) que demuestran que este ELISA se podría utilizar para cuantificar sHLA-E en muestras de suero. Teniendo en cuenta la posible incidencia de la edad y el sexo, no se observaron diferencias significativas en los niveles de sHLA-E (datos no mostrados). Los valores individuales de suero sHLA-E se presentan en un punto de parcelas usando una escala logarítmica (Fig. 2B) y medios, medianas y rangos se indican en la Tabla 2.
Una de detección /ilustrativa de sHLA-E utilizando diluciones seriadas de dos muestras de suero mediante ELISA. B /distribución de las concentraciones solubles HLA-E en el suero de controles sanos y pacientes con melanoma. P-valor indica la diferencia entre los dos grupos. C /Los porcentajes de sueros positivos sHLA-E (sHLA-E≥5 pg /ml) en donantes sanos y pacientes con melanoma. D /Distribución de las concentraciones solubles de HLA-E en el suero de pacientes con melanoma con respecto de las fases del tumor.
En los pacientes con melanoma, los niveles séricos de sHLA-E (mediana [intervalo] ) aumentaron significativamente en comparación con los controles sanos (9 pg /ml [0-2544] vs 0 pg /ml [0-1224], respectivamente, p & lt; 0,001). Para cuantificar la frecuencia de sueros sHLA-E-positivo, damos un valor de corte de 5 pg /ml. Este análisis reveló que en el grupo de 94 donantes sanos, sHLA-E puede ser detectada en 30 sueros (31,9% del total). Por el contrario, en pacientes con melanoma, 68 de 127 sueros (53,5% del total) contenían sHLA-E (Fig. 2C). Por lo tanto, los porcentajes de sueros positivos fueron significativamente mayores en los pacientes con melanoma en comparación con donantes sanos (p & lt; 0,001). Seguidamente se realizó un análisis de subgrupos teniendo en cuenta las etapas de la AJCC (American Joint Committee on Cancer http://www.cancerstaging.org/). No hay relación entre los niveles séricos sHLA-E fue encontrado con respecto a la clasificación del tumor (Fig. 2D). Sin embargo, como se muestra en la Tabla 1, los niveles de sHLA-E fueron significativamente superiores en pacientes en estadio III de melanoma en comparación con los donantes sanos (p & lt; 0,0001).
conjunto, estos resultados validan un ELISA para la determinación de sHLA-E en el suero humano y demostró que sHLA-e se incrementa significativamente en el suero de pacientes con melanoma.
producción de soluble HLA-e por un panel diverso de líneas celulares tumorales humanas
se analizó la producción de soluble HLA-E por 98 líneas celulares de tumores humanos establecidos diferentes, que representan los tumores sólidos como los melanomas (n = 30), carcinomas (cáncer de pulmón (n = 5), colo-rectal (n = 12), riñón (n = 10 ), ovario (n = 3), de mama (n = 11) y de próstata (3)), cáncer de tiroides (n = 1), el cáncer de cuello uterino (n = 1), sarcomas (osteosarcomas, n = 3), gliomas (n = 2) y tumores líquidos (mesoteliomas (n = 7), mielomas (n = 7) y leucemias (n = 3)). Como se muestra en las Figuras 3A y 3B (en blanco), sHLA-E se detectó en los sobrenadantes de líneas celulares tumorales derivadas de todos los orígenes probados, exceptuado en el sobrenadante de tumor de ovario, mieloma, leucemia y líneas celulares de glioma (Fig. 3 y datos no mostrados). En nuestras condiciones de cultivo (500 000 células, en 3 ml, durante 48 h), los niveles de sHLA-E producidos de forma natural por líneas celulares tumorales se van de 5 a 400 pg /ml. Se detectaron las producciones más altas entre melanoma, colorrectal y tumores de riñón líneas celulares. El análisis de frecuencia de las líneas de células tumorales capaces de producir sHLA-E (teniendo un valor de corte de 5 pg /ml), reveló que aproximadamente un tercio de las líneas de células tumorales produce sHLA-E (24,5%, 24 de 98) con porcentajes más altos obtenidos en el melanoma (40%, 12 de 30) y el carcinoma de células renales (40%, 4 de cada 10) (Fig. 3C).
El análisis de las concentraciones solubles de HLA-e en sobrenadantes de líneas de células tumorales tratadas o no por IFN-γ con respecto de los orígenes tumorales:. distribución de las concentraciones individuales (a), los niveles medios de (B) y los porcentajes de los sobrenadantes positivos (sHLA-E≥5 pg /ml) (C)
regulación selectiva de la producción sHLA-e por citoquinas
Hemos demostrado previamente que el IFN-γ aumenta la expresión superficial de HLA-e y el derramamiento de solubles de HLA-e por células de melanoma. Para confirmar este resultado y ampliar el panel de citoquinas ensayadas, el efecto de la IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, se sometió a ensayo IFN-a2A, IFN-γ, TNF-α y GM-CSF sobre la producción de células tumorales de líneas sHLA-e. Como era de esperar, la liberación sHLA-E fue inducida o aumentó significativamente en sobrenadantes de células tumorales después de la activación de IFN-γ (p & lt; 0,0001). El análisis de frecuencia de las líneas de células tumorales capaces de producir sHLA-E después del tratamiento de IFN-γ se duplicó (de 24,5% a 49%, 48 de 98) (Fig. 3C). En menor medida, la exposición a IFN-α y TNF-α aumentó significativamente la producción de sHLA-E por líneas de células tumorales (p & lt; 0,001 y p & lt; 0,05 respectivamente). Estos resultados se ilustran en la figura 4A usando dos líneas celulares de melanoma (M88 y M102) y una línea celular de adenocarcinoma de colon (HT29). Otras citocinas ensayadas no tienen efecto sobre esta producción. El análisis cinético y de dosis-respuesta experimentos se realizaron con IFN-γ, IFN-α y TNF-α. Como se muestra en la Figura 4B, la producción de sHLA-E se incrementó significativamente de una manera dependiente de la dosis con el efecto máximo observado con 10 ng /ml para las tres citocinas. Esta producción fue detectable tan pronto como 1 día después del tratamiento con citoquinas de las células tumorales y fue máxima después de 48 horas (Figura 4C.) Guía
Una de detección /sHLA-E en sobrenadantes de líneas celulares tumorales de tres:. De células de melanoma dos líneas (M88 y M102) y una línea celular colocarcinoma (HT29), tratados o no con IFN-α, IFN-γ o TNF-α (10 ng /ml, 48 h). Las diferencias significativas entre los valores de control y de tratamiento se indican (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). B /detección sHLA-E en sobrenadantes de cultivo de M102 tratadas con concentraciones seriadas de IFN-α, IFN-γ y TNF-α por 48 h. Por supuesto C /hora de producción de sHLA-E en el sobrenadante del cultivo de M102 tratada para un máximo de 6 días con 10 ng /ml de IFN-γ.
Discusión
Este estudio proporciona evidencia de que suero sHLA-e es significativamente mayor en los pacientes que sufren de melanoma en comparación con individuos normales, independientemente de la edad y el género. Hemos llevado a través de este análisis, utilizando un ELISA específico y sensible que hemos desarrollado y validado para la determinación de los niveles de sHLA-E en los fluidos biológicos. En este amplio estudio incluyendo 221 individuos, se observó concentraciones elevadas de suero de sHLA-E, así como una mayor frecuencia de sHLA-E sueros positivos en pacientes con melanomas en comparación con los donantes sanos. Teniendo en cuenta el grado tumoral, mientras que los niveles sHLA-E parecían ascender con estadios avanzados de la enfermedad hasta el estadio III, no hemos encontrado una asociación significativa entre los niveles de sHLA-E en suero y la etapa del melanoma, que pueden ser causados por el reparto desigual de los pacientes por subgrupos. Sin embargo, si se compara con los donantes sanos, los pacientes con melanoma en etapa III exhibieron nivel muy elevado en suero sHLA-E tanto en términos de concentración y la frecuencia de sueros positivos. Por otra parte, los pacientes con enfermedad en estadio IV mostraron niveles más bajos de sHLA-E, que es de acuerdo con la expresión espontánea débil de HLA-E por secciones de tumores metastásicos que se informó anteriormente por inmunohistoquímica [12].
Estos datos hicieron hincapié en el interés por moléculas solubles no clásica HLA-I en las enfermedades malignas. Otra HLA-I no clásica molécula HLA-G, se ha identificado en diversas enfermedades malignas como el cáncer y ha recibido mucha atención en publicaciones recientes. Los estudios clínicos han demostrado que los niveles de sHLA-G fueron significativamente elevados en el suero de pacientes con melanomas malignos, gliomas, cáncer de mama y de ovario, el cáncer no microcítico de pulmón-(NSCLC), leucemias linfocítica crónica, células B y células T no Hodgkin linfomas [17] - [21]. Por otra parte, Zhu et al. demostraron que los niveles de sHLA-G en suero podrían ser un indicador útil en los cánceres colorrectales distintivas de enfermedades colorrectales benignos [22]. Por último, los niveles de sHLA-G también fueron significativamente más altos en la ascitis maligna de los carcinomas de ovario y de mama benignos que en los controles [23]. Del mismo modo, los niveles elevados de las MHC de clase I glicoproteínas de la superficie relacionados con la cadena-inducibles por estrés, MICA y MICB, se ha encontrado que se correlacionan con las etapas del cáncer y la metástasis en varios carcinomas [24] - [26]. En conjunto, estos estudios revelaron congruentemente mayores cantidades de moléculas no clásicos HLA-I en fluidos biológicos (sangre y ascitis) de los pacientes que sufren de varios tipos de cáncer.
Dado el hecho de que nosotros y otros hemos detectado previamente sHLA-E en los sobrenadantes de melanoma y líneas celulares colorrectales mediante análisis de transferencia Western, se investigó, utilizando nuestro diseñado ELISA, la producción de sHLA-e por líneas de células tumorales derivadas de las principales categorías de tumores, incluyendo tumores sólidos como el melanoma, el cáncer de mama, colon y riñón y tumores líquidos como mesoteliomas y mielomas [12], [27]. Demostramos que sHLA-E se produce espontáneamente por 25% de las líneas analizadas celulares (24 de 98), derivados de varios tipos de tumores humanos, especialmente de melanoma, colorrectal y riñón. Por lo tanto, será interesante para abordar el potencial valor predictivo y de pronóstico de los niveles de sHLA-E en la sangre de pacientes que sufren de estos tipos de cáncer.
También hemos examinado la influencia de diversas citoquinas sobre la producción de HLA-E por líneas de células tumorales. De acuerdo con nuestros resultados anteriores en las líneas celulares de melanoma [12], se mostró que el IFN-γ inducida o aumento de la producción sHLA-E, lo que lleva a la producción de sHLA-E por 50% de las líneas celulares tumorales analizadas (48 de 98) . Por otra parte, la liberación de sHLA-E también fue impulsado por IFN-α y TNF-α en menor medida. Teniendo en cuenta que el IFN-γ e IFN-α son altos inductores de HLA-I moléculas de expresión, su impacto en la producción de sHLA-E probablemente refleja el aumento de la expresión de HLA-E por las células tumorales. Desde el lanzamiento sHLA-E por células de melanoma es principalmente la matriz metaloproteinasa-dependiente, efecto de TNF-α en la producción de HLA-E podría ser debido a la capacidad de TNF-α para promover la expresión de metaloproteinasas de matriz [12], [28]. Estos resultados son consistentes con los de Coupel
et al.
Que muestra la producción sHLA-E por las células endoteliales tras el tratamiento con IFN-γ y TNF-α [29]. Sin embargo, en oposición a su estudio, no se observó ningún efecto del tratamiento con IL-1β en la producción de sHLA-E por las células tumorales, probablemente debido a una baja expresión del receptor IL-1 (IL-1R1) por las líneas celulares tumorales ensayadas en nuestro estudio. Sin embargo, como se ha informado de que las líneas celulares tumorales, incluyendo las líneas celulares de melanoma, pueden expresar IL-1R1, podemos postular que la IL-1β, que es conocido por promover la expresión de metaloproteinasas de matriz, podría aumentar la producción de sHLA-E por IL las células tumorales que expresan -1R1 [30], [31].
Debido a su efecto sobre la proliferación de células tumorales, la angiogénesis y sus capacidades inmunomoduladoras, IFN-α se utiliza como la inmunoterapia en el tratamiento de diversos tumores sólidos , como el melanoma y el carcinoma renal [32]. Por lo tanto, como se muestra su capacidad para regular al alza sHLA-E producción por líneas de células tumorales, el tratamiento sistémico con IFN-α puede aumentar la producción sHLA-E en pacientes con melanoma. En este apoyo, el tratamiento con IFN-α se asocia con niveles séricos elevados de sHLA-G en pacientes con melanoma [33]. Por otra parte, se ha informado de que γ-irradiación regula a la baja la expresión en superficie de HLA-G1 en células de melanoma, potenciando la escisión proteolítica de esta molécula [34]. Por lo tanto, será interesante determinar si este mecanismo se observa también con el HLA-E, que luego se libera en el microambiente del tumor y de esta manera afecta el estado inmunológico local de
.
Independientemente del posible mecanismo de sHLA- la producción de E, es importante destacar cómo la generación de sHLA-E por las células tumorales podría contribuir para el escape inmunovigilancia. Dado que la interacción de la membrana HLA-E con los receptores inhibidores de CD94 /NKG2-A inducida por la inhibición de las respuestas de las células NK y T, la actividad inmunosupresora de sHLA-E debe ser investigada. En apoyo de un potencial fonction inmunorreguladora, Coupel
et al.
Informó que sHLA-E a proteger las células endoteliales de la lisis celular mediada por células NK [29]. Además, sHLA-G y SMICA se ha demostrado que disminuir el reconocimiento inmune y la destrucción de las células tumorales. sHLA-G, a través de su interacción con el inhibidor de los receptores de ILT-2 y ITL-4, se ha demostrado que inhiben la actividad lítica de las células NK, para inducir la apoptosis de las células CD8
+ CTL, para afectar CD4
+ alloproliferation y para deteriorar NK /DC diafonía [35] - [38]. Por otra parte, la MICA soluble derivado del tumor induce la endocitosis y la degradación de la cognado receptor activatory NKG2-D en los linfocitos infiltrantes de tumor, afectando su activación [29], [39]. En conjunto, estos datos pusieron de relieve la importancia de ligandos NKR solubles derivados del tumor en la prestación de un microambiente tumoral favoreciendo escape inmune. Por otra parte, se ha informado de que sHLA-G se producen
in vitro
como formas monoméricas y multiméricas y que sHLA-G dimerización aumenta la inhibición mediada por ILT-2 de T alorespuesta celular [40]. Por lo tanto, la existencia de multímeros sHLA-E también debe ser investigado.
En conclusión, el presente estudio proporciona la primera evidencia de un tiempo elevado sHLA-E en el suero de los pacientes con melanoma, lo que indica que el HLA-E podría servir como un marcador clínico para el pronóstico o predicción de los resultados clínicos de estos tipos de cáncer, especialmente en el contexto de la inmunoterapia. Debido a que un sensible sHLA-E-ELISA tiene ventajas prácticas para el cribado a gran escala, que podría ser aprobada para su uso rutinario en el inmunológica seguimiento de los melanomas y otros cánceres humanos. Aunque la función de tumor derivado soluble HLA-E queda por definir, podemos postular que estas moléculas podrían reforzar la supresión inmune del huésped a través de la inhibición de las funciones de las células NK y T, y de ese modo favorecer la supervivencia de las células tumorales. La función clínicamente relevante de estas moléculas sHLA-E debe ser analizado cuidadosamente con el fin de desarrollar estrategias de inmunoterapia apropiadas.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
MEM-E /07 y MEM-e /08 mAb (Exbio, República Checa), que se une a las proteínas nativas de HLA-e se utilizaron para ELISA.
Los péptidos recombinantes y solubles HLA
Los péptidos se adquirieron en Eurogentec (Angers , Francia). Pureza (& gt; 85%) se controló mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Diversa HLA y β2-microglobulina proteínas recombinantes se replegaron con péptidos sintéticos seguido el indicado. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201 péptido señal) y HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-A
27-35) monómeros fueron generados por las instalaciones de la proteína recombinante (IFR 26, Nantes). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL y HLA-B * 2705 monómeros /HRCQAIRKK fueron suministrados por la instalación de producción tetrámero (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Lausana, Suiza) .
pacientes y muestras
muestras
se recogieron los sueros de pacientes con melanoma (n = 127), todo ello con el consentimiento formal. Los sueros de donantes sanos (n = 94) fueron proporcionados por el Etablissement Français du Sang (EFS) (Nantes, Francia) y se utilizó como control.
Ética Declaración
consentimientos por escrito se obtuvieron de todos pacientes y donantes sanos. Todos estos estudios fueron aprobados por la ética commmitees locales "Comité de Protección des Personnes Ouest IV-Nantes" y la "Agencia Francesa de Seguridad Sanitaria de los Productos de Santé".
líneas celulares de cultivo
se establecieron líneas celulares de melanoma en la Unidad de GMP de Terapia celular y en nuestro laboratorio (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Francia) y pertenecen a la Biocollection PC-U892-NL (CHU de Nantes). líneas celulares de carcinoma colorrectal se adquirieron de ATCC o establecidos en nuestro laboratorio UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU de Nantes). líneas celulares de carcinoma renal se establecieron en el INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, París, Francia) [41]. líneas celulares de cáncer de mama fueron adquiridos de ATCC o establecidos en nuestro laboratorio UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU de Nantes). líneas celulares de cáncer de pulmón y mesotelioma líneas celulares se adquirieron de ATCC o regalos de M. Grégoire (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Francia, Biocollection PC-U892-MG, CHU de Nantes). Las células de mieloma líneas fueron regalos de C. Pellat (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Francia, Biocollection PC-U892-MA, CHU de Nantes). Ovario carcinoma, glioma, leucemia, tiroides, cuello uterino y de células de cáncer de próstata líneas se fueron adquiridos de ATCC y proporcionado amablemente por C. Sai, F. y F. Vallette París (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Francia). líneas de células de osteosarcoma se adquirieron de ATCC y los regalos de M. Padrines (EA3822, INSERM U957, Nantes, Francia). Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI o DMEM con 10% de suero de ternera fetal (FCS, PAA, Austria).
sobrenadantes tumorales producción
Para el cribado de producción sHLA-E, 500 000 células tumorales se cultivaron en placas de 6 pocillos en 3 ml de 10% de FCS-RPMI, suplementado o no con IFN-γ (20 ng /ml). Después de 48 horas, se recogieron los sobrenadantes tumorales, se centrifuga 5 minutos a 2500 g y se mantuvo congelada antes de la prueba de ELISA
.
El impacto de otras citoquinas en producción sHLA-E, en un principio ha sido probado en 20 ng /ml durante 48 horas con dos líneas celulares de melanoma (M88 y M102) y una línea celular de adenocarcinoma de colon (HT29). evaluaciones de dosis-respuesta y la cinética de IFN-γ, IFN-a2A y TNF-α se realizaron como se describe en segundo lugar (concentración que varía de 40 a 0,02 ng /ml durante 1 a 6 días) con estas tres líneas celulares de tumores.
Detección de sHLA-E por ELISA
placas Nunc-Immuno MaxiSorp de microtitulación se revistieron (50 l /pocillo) con MEM-E /08 mAb a 1 g /ml en tampón carbonato /bicarbonato (CO
3HNa 35 mM, CO
3Na
2 15 mM, pH 9,5) durante la noche a 4 ° C. Después de cuatro lavados con PBS-0,05% de Tween 20 (200 l /pocillo), las placas se saturaron con PBS que contenía 10% de FCS durante 2 h a temperatura ambiente (200 l /pocillo). Después de cuatro lavados, las muestras biológicas (50 l /pocillo diluida opcionalmente en tampón de saturación) se añadieron (por triplicado) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Los sobrenadantes de cultivo se ensayaron sin diluir, mientras que se utilizaron seis diluciones dobles de sueros. La detección biotinilado MEM-E /07 mAb diluido a 1 mg /ml en tampón de saturación se añadieron después de cuatro lavados (50 l /pocillo) y se incubaron de nuevo durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces y se incubaron con reactivo strepta-HRP (BD Pharmingen) diluido a 1/1000 en tampón de saturación durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron cuatro veces y se incubaron con sustrato (3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina líquido, Sigma, ST Qentin Fallavier, Francia) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad (100 l /pocillo). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 l /pocillo de 1 M H
3PO
4. La absorbancia se midió a 450 nm con un Thermo Scientific Multiskan EX. El análisis de la curva de calibración y la interpolación de las concentraciones de las muestras se realizó usando Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).
El análisis estadístico
Los sueros de pacientes con cáncer se compararon con sueros de donantes sanos. De acuerdo con la distribución no paramétrica de los niveles séricos sHLA-E, los datos se presentan como medias, medianas, rangos y porcentajes de sueros positivos sHLA-E. Para la comparación general de los dos grupos, el análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. Distribución de las concentraciones en toda etapa se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Para comparar la frecuencia de sueros positivos sHLA-E, se utilizó el test de Fisher. El análisis estadístico del efecto modulador de citoquinas en la producción de sHLA-E mediante líneas celulares tumorales se realizó mediante ANOVA de una vía y seguido por el test post hoc de Bonferroni. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).
Reconocimientos
Agradecemos sinceramente Pr Marie-Françoise Avril (APHP, hospital Cochin, servicio de Dermatologie, París, Francia) para proporcionar muestras de sangre melanoma. Los autores también agradecen a Philippe Guillaume de la planta de producción de tetrámero del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer (Lausana, Suiza) para la producción de monómeros de HLA.