Extracto
Cdc37 es una chaperona molecular de 50 kDa que se dirige a las proteínas quinasas intrínsecamente inestables a la chaperona molecular HSP90. También es una oncoproteína sobre-expresado que media la carcinogénesis y el mantenimiento del fenotipo maligno mediante la estabilización de las estructuras comprometidas de quinasas oncogénicas expresadas-over mutante y /o. Aquí mostramos que Cdc37 no se restringe de forma intracelular, sino que también está presente en la superficie de células MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano MDA-MB-453 y, si se demuestra a participar en los procesos de motilidad celular de cáncer. Además, se demuestra el uso de una célula de anticuerpo impermeable anti-Cdc37, que de manera similar a su homólogo intracelular, esta piscina superficie de Cdc37 interactúa específicamente con HSP90, así como los receptores de quinasa de HER2 y EGFR en la superficie celular, probablemente actuando como un co-factor en las actividades de chaperones extracelulares de HSP90. Finalmente, se muestra que la inhibición funcional de HSP90 superficie utilizando mAb 4C5, un anticuerpo monoclonal impermeable a las células contra esta proteína, no sólo conduce a la interrupción de la Cdc37 /HSP90 complejo, sino también a la inhibición de los receptores de los complejos Cdc37 /ErbB. Estos resultados apoyan un papel esencial para la superficie de Cdc37 en concierto con HSP90 en la superficie celular durante los procesos de invasión de células cancerosas y fortalecer el potencial terapéutico de mAb 4C5 para el tratamiento de cáncer de
Visto:. El Hamidieh A, N Grammatikakis , Patsavoudi E (2012) Superficie celular Cdc37 participa en la célula extracelular HSP90 cáncer mediada por la invasión. PLoS ONE 7 (8): e42722. doi: 10.1371 /journal.pone.0042722
Editor: Wanjin Hong, Instituto de Biología Molecular y Celular, Singapur
Recibido: 29 Marzo, 2012; Aceptado: 10 de julio de 2012; Publicado: August 17 de, 2012
Copyright: © El Hamidieh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AEH recibido una beca del Instituto Pasteur Helénica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
HSP90 es una chaperona molecular que funciona en asociación con una cohorte de co-chaperones para guiar a la estabilización y la activación de una gran variedad de proteínas, incluyendo las quinasas oncogénicas, factores de transcripción y los receptores de hormonas [1], [2 señalización ]. Cdc37 (división celular proteína del ciclo 37) se considera como un componente clave de esta maquinaria chaperona multimérica, jugando un papel especializado e indispensable en la maduración y /o estabilización de un gran subconjunto de proteínas quinasas, implicado en la transducción de señales, la proliferación y la supervivencia [ ,,,0],3]. Al bloquear el cierre del sitio de unión a ATP HSP90 N-terminal, Cdc37 inhibe la actividad ATPasa de [4] HSP90 y ayuda a la carga de proteínas cliente quinasa en la maquinaria chaperona [4], [5]. Ιn en particular, Cdc37 actúa como un adaptador o andamio, facilitando la interacción quinasa cliente con HSP90 [6] y, posteriormente, mediante el reclutamiento de estos cliente quinasas en el complejo de HSP90, que se estabiliza y /o los mantiene en una conformación competente de plegado [7]. Además, Cdc37 promueve el ensamblaje de los complejos de HSP90-proteína quinasa [8] y expresión de una forma dominante negativa que carece del dominio de unión HSP90-inhibe la activación de la quinasa en células de mamíferos [9]. Muchas proteínas cliente interactúan directamente tanto con Cdc37 y HSP90 y su plegado, la maduración y la estabilidad dependen de la actividad de ambas chaperones. Por lo tanto Cdc37 media la formación de complejos HSP90-Cdk4 [10] y estas interacciones son necesarias para la estabilidad y función de proteínas quinasa-HSP90 Raf1 [9] y. La compleja relación entre Cdc37 y HSP90 se ilustra por el hallazgo de que su interacción es estabilizado por la proteína cliente [11]. En los últimos años ha habido cada vez más pruebas que demuestran que la HSP90 intracelular juega un papel fundamental en la adquisición y el mantenimiento del fenotipo maligno [12], [13], [14], [15]. En consecuencia, existe un creciente interés en Cdc37 en el contexto de malignidad [16], [17] ya Cdc37 también regula múltiples clientes quinasa oncogénica. De hecho los niveles de Cdc37 se encontraron un aumento en muchos cánceres clínicos [17]. En particular, Cdc37, se incrementa en los tejidos proliferantes, y está fuertemente expresado en ciertos tipos de cáncer, incluyendo el linfoma anaplásico de células grandes [18] de la leucemia mielocítica aguda [19], carcinoma hepatocelular [20] y el mieloma múltiple [21]. Además, los datos se han presentado que indica que Cdc37 puede funcionar como un oncogén, como ratones modificados para sobre-expresa Cdc37 desarrollar tumores a una frecuencia alta [22], lo que sugiere que el establecimiento de vías de la proteína quinasa mediada por HSP90 /Cdc37 puede ser una tasa evento -Limitar en la transformación de células epiteliales [22]. Más recientemente se ha demostrado que Cdc37 es esencial para mantener la próstata crecimiento de células tumorales [23]. Además, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas que se regula hacia arriba y activa en varios tumores malignos forma un complejo con HSP90 y la co-chaperona Cdc37 en ovario, glioblastoma, cáncer de pulmón y las células [24]. En conjunto, estos resultados apoyan la focalización de Cdc37 para la terapia del cáncer.
Nosotros y otros han identificado previamente una piscina de HSP90 extracelular tanto en células normales y cancerosas que ha demostrado estar involucrados en los procesos de migración y la invasión, respectivamente [ ,,,0],25], [26], [27], [28], [29], [30]. Por otra parte, y por la explotación de la función de las propiedades de un anticuerpo monoclonal impermeable a las células llamado mAb 4C5, dirigidos específicamente contra HSP90 bloqueo hemos demostrado que HSP90 extracelular interactúa con HER-2 en la superficie celular [28], así como las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 [29]. Aunque también se encontró un número creciente de co-chaperones de HSP90 como HSP70, Hop y p23 en la superficie celular [31], [32], [33], su acción y los mecanismos subyacentes no se han elucidado todavía. Tomando en consideración lo anterior, en el presente trabajo se explora la localización de la superficie celular de Cdc37 y examinar su posible implicación en los procesos de invasión de células de cáncer, así como sus potenciales socios que interactúan durante este proceso, mediante el MDA-MB-453 y MDA- líneas celulares de cáncer de mama MB-231 humano y un anticuerpo policlonal comercialmente disponible contra Cdc37. Por otra parte y teniendo en cuenta datos de informes anteriores que muestran que el mAb 4C5 inhibe la invasión de células cancerosas mediante la interrupción de la asociación de extracelular HSP90 con HER2 [28] y metaloproteinasas de MMP2 y MMP9 [29] En este trabajo se investiga el posible efecto de esta célula impermeable anti-HSP90 anticuerpo en las interacciones de superficie Cdc37 con HSP90 y los receptores ErbB.
Materiales y Métodos
anticuerpos y reactivos
MAb 4C5 fue producido en nuestro laboratorio, tal como se describe anteriormente [ ,,,0],34]. En el presente estudio, mAb 4C5 se utilizó como sobrenadante libre de suero se concentró en todos los experimentos realizados. Los anticuerpos policlonales contra EGFR, HER-2 y anticuerpo monoclonal contra la ciclina D1 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Se utilizaron dos anticuerpos anti-Cdc37, de Santa Cruz de Biotecnología y Abcam que reconocen diferentes epítopos. Los anticuerpos policlonales contra HSP90 eran de Chemicon International. DMEM, RPMI y suero bovino fetal (FBS), eran de Invitrogen. Todos los demás materiales eran de fuentes descritos anteriormente [25].
Los cultivos celulares y de inmunofluorescencia
HER-2-que expresan más de MDA-MB-453, EGFR-que expresan más de MDA-MB- 231 líneas celulares de cáncer de mama y células de mama epiteliales no cancerosas MCF-12A se adquirieron de la American Type Culture Collection. MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231 se mantuvieron en RPMI y DMEM, respectivamente, suplementados con 10% de FBS. células MCF-12A se mantuvieron en DMEM F12-HAM suplementado con 20 ng /ml de EGF humano, 100 ng /ml de hidrocortisona, 0,01 mg /ml de insulina bovina y 10% de FBS.
Para los estudios de inmunofluorescencia, se sembraron células en poli-L-lisina recubierto cubreobjetos, a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en una placa de 48 pocillos y se cultivaron en el medio apropiado suplementado con 10% FBS. Después de 24 h, las células se cambiaron a medio libre de suero durante 18 h. Las células vivas MDA-MB-453, MDA-MB-231 y MCF-12A se marcaron mediante inmunofluorescencia indirecta como se informó anteriormente [28]. Brevemente, las células no fijadas se incubaron con anticuerpo 2 g /ml anti-Cdc37 por 2 h. Después, las células se lavaron, se fijaron en acetona enfriada con hielo y se marcaron con anticuerpo secundario conjugado con Alexa488.
Preparación de lisados celulares, el análisis de transferencia Western y Co-inmunoprecipitación
Las células fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos en medio de cultivo suplementado con 10% de FBS hasta sub-confluencia, desplazados en medio libre de suero durante 24 h y luego expuestos a anti-Cdc37 y /o mAb 4C5 para 16 h. Los cultivos de control se hicieron crecer en medio de cultivo, ya sea solo o en medio de cultivo que contiene 200 mg /ml de un anticuerpo monoclonal IgG2a contra la proteína no relacionada BM88 [35]. anticuerpo no unido en exceso se eliminó a continuación por lavado con medio fresco. Los cultivos se lavaron inmediatamente dos veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron como se describe anteriormente [28].
fraccionamiento celular se llevó a cabo en cultivos celulares preparados y tratados como se describió anteriormente, utilizando el kit de extracción de proteínas compartimental (Chemicon), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
total y /o lisados de proteínas compartimentales se cuantificaron, y cantidades iguales de proteína total se sometieron a SDS-PAGE seguido de transferencia Western con los anticuerpos apropiados. Las bandas inmunorreactivas se detectaron usando un reactivo de quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences) y película X-Omat AR (Eastman Kodak Co.) tal como se describe por los fabricantes.
se realizó Co-inmunoprecipitación como se describe anteriormente [25]. En breves cantidades, iguales de lisados celulares pre-aclarado se incubaron con los anticuerpos apropiados para 18 horas a 4 ° C. Los inmunocomplejos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con proteína G-Sepharose y se lavaron tres veces con tampón de lisis. Las proteínas unidas se analizaron mediante electroforesis en gel seguida por Western blot como se describió anteriormente. Para todos los experimentos de inmunoprecipitación, controles negativos se realizaron con IgG irrelevantes.
La internalización de anticuerpos se realizaron Ensayo
experimentos de internalización de anticuerpos como se describe anteriormente [28]. Brevemente, se incubaron las células mientras que en cultivo con 200 mg de anticuerpo anti-Cdc37 /ml durante 16 h. Después, las células se lavaron y se fijaron en acetona fría durante 3 min. Para la detección de la posible internalización del anticuerpo, las células se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS y posteriormente se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con Alexa488-(Molecular Probes). Para todos los experimentos, los controles se realizaron con el mAb 4C5 que es impermeable a las células y la comercial anti-HSP90 que se internaliza [27].
ARN de interferencia
plásmido pLL3.7 con una inserción de orientación Cdc37 se utilizó. Cdc37 fue derribado utilizando ARN de horquilla corta. Para este fin, el "Programa de Selección siRNA WI" del Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica se utilizó, para diseñar y seleccionar el siRNA dirigidos Cdc37. Con el fin de crear una estructura de tallo-bucle, se inserta un espaciador (TTCAAGAGA) en las secuencias de sentido y antisentido. oligómeros de ADN se hibridaron y clonaron en el plásmido pLL3.7. La inserción fue confirmada por secuenciación. MDA-MB 453 y MDA-MB células 231 se cultivaron a una densidad de 70% y después se transfectaron con 3 g de ADN plásmido con las secuencias insertadas o no (control), utilizando el reactivo Xfect Transfección de Clontech, de acuerdo con protocolo de los fabricantes. 72 horas después de la transfección, se recogieron las células, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. Para la detección de inmunofluorescencia de Cdc37, las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina y se transfectaron con ADN de plásmido como anteriormente. 72 horas después de la transfección, las células vivas se lavaron con PBS, se incubaron con anticuerpo anti-Cdc37 durante 2 horas, se fijaron con acetona enfriada con hielo y se marcaron con anticuerpo Alexa647-secundaria.
Curación de Heridas Motilidad Ensayo
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [28]. Brevemente, MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231 se sembraron en una placa de 48 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
5 células /pocillo y 5 × 10
4 células /pocillo, respectivamente, y se dejaron durante 24 h en medio que contenía suero, sin tratamiento adicional. El medio se cambió después a libre de suero, y 16 h más tarde, se generó una zona libre de células por el rascado suavemente la monocapa de células con una punta de Gilson-pipeta amarilla estéril, por lo que resulta en la formación de una célula de 1 mm de ancho área exento. Inmediatamente después del rascado, el medio se reemplazó con medio fresco, o medio que contiene el anticuerpo anti-Cdc37. Se hicieron crecer cultivos de control ya sea en medio de cultivo solo o en medio de cultivo que contiene 200 mg /ml de un anticuerpo monoclonal IgG2a contra la proteína no relacionada BM88 [35].
migración de las células de cáncer de mama dentro de la brecha se controló microscópicamente en intervalos de tiempo dados, utilizando un microscopio invertido Leica DM IL, equipado con una cámara de vídeo LEICA DM300 conectado a un ordenador. La inhibición de la migración se calculó mediante la adquisición y el análisis de imágenes digitales, utilizando el software de análisis de Pro Plus [36] y se evaluó con dos formas diferentes, dependiendo de la línea celular estudiado Imagen. Más específicamente para las células MDA-MB-453 se expresó como el porcentaje de la distancia cubierta por las células en los cultivos de control, mientras que para las células MDA-MB-231 se expresó como el porcentaje de células observadas dentro de la brecha de la herida en cultivos de control análisis estadístico se realizó mediante el uso de
t de Student
.
Resultados
Cdc37 se expresa en la superficie celular de células MDA-MB-453 y MDA-MB-231 células de cáncer de mama
con el fin de examinar la localización de la superficie celular de Cdc37, MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano no fijado MDA-MB-453 y se incubaron con el anticuerpo anti-Cdc37. Después, las células se lavaron, se fijaron y se marcaron con anticuerpo secundario conjugado con Alexa488. Por lo tanto el anticuerpo primario tenía acceso sólo a la superficie externa de la célula. La inmunotinción observada confirmó la localización de la superficie celular de Cdc37 en ambas líneas celulares de cáncer de mama humanos estudiados (Fig. 1). Como control positivo, mAb 4C5 que se une específicamente a la superficie HSP90 cuya presencia se ha demostrado previamente en ambas líneas celulares [28] [26] fue utilizado. En este punto, es de interés observar que los experimentos de inmunofluorescencia mostró, como era de esperar, la ausencia no sólo de Cdc37, sino también de HSP90 en la superficie de las células cancerosas no adultos MCF-12A (Fig. S1). se aplicaron controles positivos adicionales, utilizando anticuerpos contra HER-2 y EGFR para las células MDA-MB-453 y MDA-MB-231, respectivamente. Finalmente anticuerpos contra EGFR y HER2 se utilizaron como controles negativos en MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231, respectivamente (Fig. 1A y B). Los resultados anteriores se confirmaron mediante transferencia de Western usando fracciones de membrana derivadas de las dos líneas celulares (Fig. 1C y D). Se han usado (1d. Fig anticuerpos) como control positivo anti-HER2 (Fig. 1C) y anti-EGFR, en MDA-MB-231 lisados de células de membrana MDA-MB-453 y, respectivamente. En las fracciones citosólicas y como se esperaba anti-Cdc37 dio inmunotinción positiva mientras que los anticuerpos contra los receptores ErbB fueron negativos. Además, las fracciones citosólicas de ambas líneas celulares dieron inmunotinción positiva cuando immunobloted con el anticuerpo contra la proteína intracelular Ciclina D1, mientras que las fracciones de membranas fueron negativos (Fig. 1C y D), lo que confirma la pureza de las fracciones se usa aquí y en el immunoprecipitaion experimentos que se describen a continuación.
A, inmunofluorescencia indirecta de células MDA-MB 453 en directo usando anticuerpo anti-Cdc37. El inmunomarcaje revela la localización en la superficie de Cdc37. Anti-HER2 y mAb 4C5 se utilizaron como controles positivos. anticuerpo anti -EGFR se utilizó como control negativo. B, inmunofluorescencia indirecta de células MDA-MB 231 en directo usando anticuerpo anti-Cdc37. Anti-EGFR y mAb 4C5 se utilizaron como controles positivos. Los anticuerpos anti -HER2 se utilizó como control negativo. C, fraccionamiento de la célula de MDA-MB 453 células seguida por análisis de transferencia Western confirmó la presencia de Cdc37 en fracciones de membrana celular. Los anticuerpos anti-HER2 se utilizaron como controles positivos y negativos en la membrana y las fracciones citosólicas, respectivamente. D, fraccionamiento de la célula de MDA-MB 231 células, seguido de análisis de transferencia Western confirmó la presencia de Cdc37 en fracciones de membrana celular. Los anticuerpos anti-EGFR se utilizaron como controles positivos y negativos en la membrana y las fracciones citosólicas, respectivamente. En C y D de anticuerpos contra la proteína intracelular Ciclina D1 dio la inmunotinción positiva y negativa en los citosólicas y de membrana fracciones de ambas líneas celulares, respectivamente. CF, fracción citosólica; MF, fracción de membrana. Barra de escala = 20 micras.
Con el fin de confirmar la especificidad del anticuerpo anti-Cdc37 comercial utilizada en nuestros estudios, se aplicó la tecnología siRNA. Más específicamente, cuando MDA-MB-453 y MDA-MB-231cells transfectadas con siRNA dirigidos Cdc37 se inmunotiñeron como se describe anteriormente con el anticuerpo anti-Cdc37, se observó un etiquetado extremadamente débil en comparación con las células transfectadas con el vector de control (Fig. 2 A y B). Del mismo modo en que se realizó el análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-Cdc37 en los lisados celulares totales derivadas de las células anteriores, una disminución significativa se obtuvo inmunotinción en los lisados de la transfectadas con siRNA dirigidos contra Cdc37 en comparación con contols (Fig. 2C y D ).
A, B, inmunofluorescencia de vida MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células, respectivamente, usando el anticuerpo anti-Cdc37. Las células fueron transfectadas con siRNA dirigidos Cdc37 (shRNA Cdc37) o con ADN de plásmido sin inserción (control). células transfectadas ShRNA Cdc37 presentan niveles extremadamente bajos de tinción de inmunofluorescencia de superficie en comparación con los controles. Barra de escala = 20 micras. C, D, análisis de transferencia de Western de lisados de células totales derivadas de MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células, respectivamente, utilizando el anticuerpo anti-Cdc37, en células transfectadas con siRNA dirigidos Cdc37 y las células de control. El nivel de Cdc37 detectado es significativamente menor en las dos líneas celulares transfectadas con siRNA dirigidos a Cdc37, en comparación con transfecciones de control.
El anticuerpo anti-Cdc37 es impermeable a las células
La célula la naturaleza impermeable de la anti-Cdc37 utilizado se examinó mediante la incubación de las células MDA-MB-453 y MDA-MB-231, mientras que en cultivo con el anticuerpo durante 16 h. Las células fueron luego cuidadosamente lavadas, y la unión del anticuerpo se analizó después de la fijación y permeabilización celular, utilizando un anticuerpo secundario conjugado con Alexa488. Hemos observado que para ambas líneas celulares el anticuerpo anti-Cdc37 no se internaliza y se mantuvo unido en la superficie celular (Fig. 3). MAb 4C5 y el policlonal anti-HSP90 que han sido previamente demostrado para permanecer en la superficie y ser internalizado, respectivamente [27], se utilizaron como controles (Fig. 3). Cabe señalar que cuando se incubaron las células antes mencionadas por medio de cultivo solo como control negativo, no se obtuvo la inmunotinción (datos no mostrados).
internalización de anticuerpos Anti-Cdc37 se ensayó tanto en MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células. Las células vivas de las dos líneas celulares se cultivaron en cubreobjetos y se incubaron a 37 ° C durante 16 h con anti-Cdc37. MAb 4C5 y anti-HSP90 se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Para la detección de la internalización de anticuerpos, las células se fijaron y se permeabilizaron como se describe en materiales y métodos y los anticuerpos se detectaron mediante microscopía confocal usando un anticuerpo secundario Alexa 488. No internalización del anticuerpo anti-Cdc37 se observó incluso en ambas líneas celulares. Barra de escala = 20 micras.
Superficie Cdc37 está implicada en la motilidad celular del cáncer de mama
Una vez establecido que el anticuerpo anti-Cdc37 no se internaliza, sino que sigue estando vinculado específicamente al por células superficie cuando se incuba con la vida MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231, examinamos siguiente la posible participación de la superficie de Cdc37 en la motilidad de estas células de cáncer de mama, usando el ensayo de curación de la herida. Los cultivos de control se hicieron crecer en medio de cultivo, ya sea solo o en medio de cultivo que contiene 200 mg /ml de un anticuerpo contra la proteína no relacionada BM88 [35]. Es importante tener en cuenta que no se observó diferencia estadísticamente significativa entre los dos tipos de controles que se utilizan. El valor de control ilustrado es el valor medio de los dos tipos de control. Como se muestra en la Fig. 4A, y la fig. 5A presencia del anticuerpo anti-Cdc37 en el medio de cultivo, tanto de la MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231, resultó en una tasa significativamente más lento de cierre de la herida, en comparación con los controles cultivos crecidos en medio de cultivo solo. Más específicamente, se obtuvo una inhibición del 57,7% y el 35,8% de la motilidad de células de cáncer cuando se incluyó a 200 g /ml de anti-Cdc37 en el medio de cultivo de células MDA-MB-453 y las células MDA-MB-231, respectivamente (Figs. 4C y 5C). Tinción con azul tripán lleva a cabo en el punto final del ensayo de curación de heridas, mostró que la tasa de mortalidad de las células tratadas con el anticuerpo fue similar a la observada en los cultivos de control para ambas líneas celulares (Figs. 4B y 5B). Este resultado apoya, además, que la disminución de la motilidad celular observada en presencia del anticuerpo anti-Cdc37 que no se internaliza no es causado por la muerte celular, pero no por la inhibición de la piscina superficie de Cdc37. En este punto es importante señalar que en este ensayo, el efecto del anticuerpo anti-Cdc37 se dirige hacia la invasión de células y no hacia la proliferación celular, desde muy bajo (& lt; 7%) la incorporación de BrdU se observó tanto en el cáncer de mama humano cultivos de células tratadas como anteriormente con diferencias aparentes entre las diferentes condiciones experimentales (datos no mostrados).
A, de la herida ensayo de curación. Las imágenes obtenidas a las 0 horas y las 24 horas después de la formación de cero. Las células se dejaron migrar en condiciones de control o en presencia de 200 g /ml de anticuerpo anti-Cdc37. B, Al final de las celdas de punto de tiempo se tiñeron con azul de tripano. Ninguna muerte celular significativa se observó en ambos casos. C, efecto Cuantitativa de Cdc37 en la migración celular. La adición de 200 g /ml de anticuerpo anti-Cdc37 en el medio de cultivo celular dio lugar a una inhibición de 57,7% de cierre de la herida en comparación con el control que se considera como el cierre 100% de la herida (P & lt; 0,005). Columna es el promedio de tres experimentos independientes ± SE. Dentro de un único experimento de cada condición se ensayó por triplicado. Las barras de escala A = 165 m, B = 80 micras.
A, la herida de ensayo de curación. Las imágenes obtenidas a las 0 horas y las 24 horas después de la formación de cero. Las células se dejaron migrar en condiciones de control como se describe en Materiales y Métodos o en presencia de 200 g /ml de anticuerpo anti-Cdc37. B, Al final de las celdas de punto de tiempo se tiñeron con azul de tripano. Ninguna muerte celular significativa se observó en ambos casos. C, efecto Cuantitativa de Cdc37 en la migración celular. La adición de 200 g /ml de anticuerpo anti-Cdc37 en el medio de cultivo celular como resultado la inhibición 35,8% de las células que invaden el espacio en comparación con el control que se considera como el cierre 100% de la herida (P & lt; 0,005). Columna es el promedio de tres experimentos independientes ± SE. Dentro de un único experimento de cada condición se ensayó por triplicado. Las barras de escala A = 165 m, B = 80 micras.
Superficie Cdc37 interacciona con HSP90 en las dos líneas celulares de cáncer de mama y con HER-2 y EGFR en MDA-MB-453 y MDA-MB- 231cells
respectivamente
Teniendo en cuenta la participación por encima de la superficie de la muestra Cdc37 en los procesos de invasión de células de cáncer el próximo examinado las posibles interacciones de esta molécula con HSP90 y los receptores quinasa ErbB. Para este fin hemos realizado experimentos de co-inmunoprecipitación usando fracciones de membrana derivadas de las células MDA-MB-453 y MDA-MB-231 cultivadas o bien en medio de control como se ha mencionado en Materiales y Métodos o en presencia de 200 g /ml de anti- anticuerpo Cdc37 durante 16 h y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Cdc37. El análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-EGFR anti-HSP90, anti-HER2 y respectivamente, reveló que el anticuerpo anti-Cdc37 interrumpe específicamente la interacción superficie de Cdc37 con HSP90 y ambos receptores en las dos líneas celulares estudiadas (Fig. 6A) desde una se observó una cantidad reducida de estas moléculas en los cultivos tratados en comparación con los controles. En este punto es importante señalar que la interrupción observado confirma la localización en la superficie celular de las interacciones moleculares estudiado, ya que como se muestra anteriormente, el anticuerpo anti-Cdc37 no se internaliza y permanece unido a la superficie celular cuando se incluye en el medio de cultivo.
A, fracciones de la membrana de proteínas de MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células (control) se immunoprecipitaded con anticuerpo anti-Cdc37. Análisis de las proteínas unidas por transferencia Western con anticuerpo contra HSP90 y anticuerpos anti HER-2 y anti -EGFR respectivamente, reveló que Cdc37 interacciona no sólo con HSP90, sino también con las dos receptores ErbB estudiados. Presencia de 200 mg /ml de la célula impermeable anti-Cdc37 durante 16 h en el medio de cultivo de las dos líneas celulares, seguido de inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western como anteriormente reveló que el anticuerpo anti-Cdc37 interrumpe la asociación de Cdc37 con HSP90 y la ErbB receptores en las dos líneas celulares. B, MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células se trataron o no con 200 mg de mAb /ml 4C5 durante 16 horas. fracciones de proteínas de membrana derivadas de estos cultivos se immunoprecipitaded con anti-Cdc37 seguido por análisis de transferencia de Western usando anti-HSP90 y anti-HER2 y anticuerpos anti EGFR, respectivamente. C, fracciones de la membrana de proteínas de MDA-MB 231 células cultivadas en ausencia o presencia de 200 g /ml de mAb 4C5 para 16 h se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-EGFR. Análisis de las proteínas unidas por transferencia Western con anticuerpo anti-HSP90 reveló que HSP90 superficie interactúa con EGFR y que esta interacción se interrumpe por el mAb 4C5. IgG irrelevantes sirvieron como control negativo para todos los experimentos anteriores. D, Densitometría cuantificación de las interacciones observadas reduce en presencia de anti-Cdc37 en el medio de cultivo de células MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células dio lugar a una disminución de 33% y 59% con HSP90 y HER-2, respectivamente, con respecto a la MDA -MB 453 células y en una disminución de 56% y 47% con HSP90 y EGFR, respectivamente, con respecto a las células MDA-MB 231. La presencia de mAb 4C5 en el medio de cultivo de células MDA-MB 453 y MDA-MB 231 células dio como resultado una disminución de 60% y 58% con HSP90 y HER-2, respectivamente, con respecto a las células MDA-MB 453 y en un 88% y 70% disminuir con HSP90 y EGFR en relación, respectivamente, las células MDA-MB 231.
MAb 4C5 interrumpe específicamente la interacción superficie de Cdc37 con HSP90 y los receptores ErbB
Una vez establecido que de manera similar a su contraparte intracelular, Cdc37 superficie se asocia físicamente con HSP90 superficie, a continuación trató de investigar el efecto de la función de bloqueo de anticuerpo monoclonal anti-HSP90, mAb 4C5, en esta interacción. Con este fin, las fracciones de membrana derivadas de MDA-MB-453 y MDA-MB-231 cultivos que fueron tratados con 200 g /ml de mAb 4C5 durante 16 h se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Cdc37. El análisis de transferencia de Western usando anti-HSP90 reveló que mAb 4C5 interrumpe específicamente la interacción superficie de Cdc37 con HSP90 en ambas líneas celulares de cáncer usadas (Fig. 6B). Más específicamente, el anticuerpo anti-Cdc37 co-inmunoprecipitado niveles más bajos de HSP90 en los cultivos tratados mAb 4C5 en comparación con los controles.
Hemos demostrado anteriormente utilizando mAb 4C5 que la superficie HSP90 interactúa específicamente con el dominio extracelular de HER -2 en MDA-MB-453 células [28] .En el presente trabajo, y con el fin de examinar más a fondo el modo de acción de la superficie Cdc37 en las dos líneas celulares estudiadas, fue necesario primero investigar la posible interacción de la superficie de la piscina de HSP90 con EGFR. Con este fin, las fracciones de membrana derivadas de MDA-MB-231 cultivos tratados en ausencia o en presencia de 200 mg de mAb /ml 4C5 durante 16 h, se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-HSP90 y a inmunotransferencia con anti-EGFR. Como se muestra en la Fig. 6C EGFR interactúa específicamente con HSP90. La reducción observada en la presencia de la célula mAb impermeable 4C5 indica la localización de la superficie celular de esta interacción Habiendo mostrado la asociación de superficie de HSP90 y EGFR y, además, de que Cdc37 interacciona no sólo con HSP90 sino también con HER2 y EGFR A continuación trató de investigar la posible efecto de mAb 4C5 en la interacción del co-chaperona con los receptores ErbB. En consecuencia fracción de membrana derivada de MDA-MB-453 y MDA-MB-231 cultivos tratados o no con mAb /ml 200 mg 4C5 para 16 h se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Cdc37. El análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-EGFR anti-HER2 y respectivamente, reveló que el mAb 4C5 interrumpe específicamente la interacción superficie de Cdc37 con las dos moléculas de receptor ya que se observaron niveles más bajos de los receptores ErbB en los cultivos tratados mAb 4C5 (Fig. 6B).
Discusión
en el presente trabajo se demuestra que la co-chaperona Cdc37 se localiza en la superficie de 231-MDA-MB células de cáncer de mama MDA-MB-453 y, cuando es necesario para la motilidad de estas células y de manera similar a su homólogo intracelular que interactúa específicamente con la chaperona molecular HSP90. Además, nuestros resultados muestran que esta piscina superficie de Cdc37 interactúa directamente con los miembros de la familia ErbB de los receptores del factor de crecimiento posiblemente actuando como un co-factor en la HSP90 actividades chaperones extracelular implicados en procesos de invasión de células de cáncer y que el mAb anticuerpo anti-HSP90 4C5 interrumpe estas interacciones.
localización en la superficie de la célula de Cdc37 se demostró tanto por inmunocitoquímica en vivo MDA-MB-453 y MDA-MB-231 células de cáncer de mama y de transferencia Western utilizando lisados de fracción de membrana derivadas de estas líneas celulares.
la inhibición de MDA-MB-453 y MDA-MB-231 de la motilidad celular de cáncer de mama, por el anticuerpo anti-Cdc37 se demostró usando el ensayo de curación de la herida. La presencia de este anticuerpo en el medio de cultivo reduce significativamente la tasa de la motilidad de las dos líneas celulares estudiadas. En este punto, es interesante observar que cuando el anticuerpo anti-HSP90 mAb 4C5 y el anticuerpo anti-Cdc37 se incluyeron ya sea por separado o en combinación en el medio de cultivo de las células anteriores no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los cierres para heridas.