Extracto
Antecedentes
células supresoras mieloides derivadas (MDSC) son importantes reguladores de la respuesta inmune. Se evaluó la función mecánica del agotamiento de MDSC en célula presentadora de antígeno (APC), las actividades de células NK, T y las respuestas de la vacunación terapéutica en modelos murinos de cáncer de pulmón.
Principales conclusiones
Individual agotamiento mediado por anticuerpos de MDSC (anti-Gr1 o anti-Ly6G) mejorado la actividad antitumoral contra el cáncer de pulmón. En comparación con los controles, MDSC agotamiento aumentó la actividad APC y el aumento de la frecuencia y de la actividad de los efectores de células NK y T en el tumor. En comparación con los controles, el anti-Gr1 o tratamiento anti-Ly6G condujeron a un aumento de: (i) las células T CD8, (ii) las células NK, (iii) CD8 T o NK expresión intracitoplasmática de IFN, perforina y granzima (iv) CD3 T las células que expresan la CD107a marcador de activación y CXCR3, (v) la reducción de células T CD8 producción de IL-10 en los tumores (vi) reducen tumor angiogénico (VEGF, CXCL2, CXCL5, y Angiopoietin1 & amp; 2), pero mejorada anti-angiogénica (CXCL9 y CXCL10 ) expresión y (vii) la reducción de la tinción de tumor de marcador endotelial Meca 32. la inmunocitoquímica de secciones de tumores demostraron una reducción de las células que expresan Gr1 con el aumento de células CD3 T infiltrados en los grupos anti-anti-Ly6G Gr1 o. MDSC agotamiento condujo a una marcada inhibición del crecimiento del tumor, el aumento de la apoptosis de células tumorales y reduce la migración de los tumores del sitio primario en el pulmón en comparación con los controles. respuestas vacunación terapéutica se mejoraron
in vivo
tras el agotamiento MDSC con 50% de los ratones tratados erradicar completamente los tumores establecidos. Los ratones tratados que rechazaron sus tumores primarios adquiridos memoria inmunológica frente a una exposición tumor secundario. El 50% restante de los ratones de este grupo tenía 20 veces en la reducción de la carga tumoral en comparación con los controles.
Importancia
Nuestros datos demuestran que la orientación MDSC puede mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales que sugieren una amplia aplicabilidad del combinado enfoques basados inmune contra el cáncer. Este enfoque multifacético puede resultar útil contra los tumores donde MDSC desempeñar un papel en la evasión inmune del tumor
Visto:. Srivastava MK, Zhu L, M Harris-White, Kar T, Huang M, Johnson MF, et al. Actividad antitumoral (2012) supresor de células mieloides agotamiento Augments en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (7): e40677. doi: 10.1371 /journal.pone.0040677
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Marzo, 2012; Aceptado: June 12, 2012; Publicado: 16 Julio, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Programa de Cáncer de Pulmón de California en Los Ángeles, Departamento de Asuntos de Veteranos Medical Fondos de Investigación, Institutos Nacionales de Salud ( NIH) Subvenciones (SR1 CA95686, CA90388 SR1 CA126944 y P50), el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, Grant UL1TR000124 y tabaco Programa Premio Programa de Enfermedades relacionadas de la Universidad de California (15RT-0207 y 20FT0082). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Cuando este estudio se realizó RS fue un empleado de la Universidad de Virginia, Charlottesville. RS ahora se emplea en Norvartis Institutos de Investigación Biomédica. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
cáncer
pulmón sigue siendo un problema de salud de enormes proporciones, con más de 1,1 millones de muertes atribuidas al cáncer de pulmón en todo el mundo cada año [1]. Con los esfuerzos terapéuticos existentes la supervivencia a largo plazo para los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo baja, por lo tanto se necesitan nuevas estrategias terapéuticas. Aunque la inmunoterapia del cáncer ofrece una opción terapéutica atractiva, la activación del sistema inmune por sí sola no es suficiente para la actividad antitumoral. Anticipamos que las terapias combinadas que se dirigen a las vías de activación inmune y los mecanismos de supresión inmune serán necesarios para combatir el cáncer de pulmón. El microentorno del tumor consiste en células tumorales, el estroma, vasos sanguíneos, infiltrados inmunes y la matriz extracelular. alteraciones genéticas en oncogenes y genes supresores de tumor o cambios epigenéticos en el tumor que modulan el crecimiento del tumor y la invasión en el tejido circundante orquestan la persistencia de infiltrados inflamatorios. Estos infiltrados celulares modular el desarrollo y progresión del tumor. Los infiltrados tumorales varían según el tamaño y la composición en diversos tipos de tumores y en diferentes etapas de desarrollo del tumor. Los programas tumorales los infiltrados celulares para sostener una inflamación dysregulated que es hipo sensible al tumor. Que contribuyen a los infiltrados inflamatorios celulares mieloides son células supresoras derivadas (MDSC) que modulan negativamente la respuesta inmune y promover la progresión tumoral y la metástasis [2].
MDSC son una población heterogénea de células mieloides inmaduras que se compone de los progenitores mieloides y precursores de macrófagos, granulocitos y células dendríticas (DC) [3]. En ratones, MDSC son identificados por anticuerpos que detectan la expresión de la superficie celular de Gr1 y CD11b. Los aumentos en el número de MDSC evocan fuerte actividad supresora natural en pacientes con cáncer [4], [5] o ratones portadores de tumores [4], [6], [7]. Se ha demostrado que las células supresoras inmunitarias Gr1 + CD11b + son capaces de inhibir la célula T respuesta proliferativa inducida por aloantígenos [8], CD3 ligadura [9], o diversos mitógenos [10], [11], y también puede inhibir la IL- 2 utilización [12], así como la actividad de células NK [5], [13]. Estos estudios indican que el crecimiento progresivo del tumor está asociado con la baja regulación de respuestas de células T y que la MDSC están involucrados en los mecanismos inmunorreguladores negativos. En modelos de tumores murinos, los aumentos de MDSC en los tumores, bazos, médula ósea y sangre regula a la baja las respuestas de células T [2]. Teniendo en cuenta la información anterior, es importante entender los efectos del agotamiento MDSC en la modulación de la respuesta inmune en cáncer de pulmón.
En este estudio, se evaluó la contribución de las células mielomonocítica Gr1 o Ly6G que expresan el tumor 3LL respuestas de crecimiento y vacunación terapéutica en ratones C57BL /6. Nuestros resultados demuestran que MDSC agotamiento aumento de la actividad APC y aumentó la frecuencia y la actividad de NK y células T efectores que llevaron al crecimiento del tumor reducida, las respuestas de vacunación terapéutica mejorada y confieren memoria inmunológica. Nuestros datos proporciona soporte para el desarrollo de agentes que se dirigen MDSC de inmunodeficiencia combinada basada en enfoques terapéuticos en el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
El Lewis murino El carcinoma de pulmón (3LL, H-2
b, también conocido como LLC, ATCC CRL-1642) obtenido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), DC2.4 (especie de regalo del Instituto del cáncer Dana Farber KL Roca, Boston , Mass.) [14] y la β galactosidasa hibridoma de células reportero T (B3Z) que reconoce el k
b molécula de clase I y un ovoalbúmina péptido (OVA), SL8 (SIINFEKL) se obtuvo a partir de N Shastri (UC Berkeley, CA) [15] fueron utilizados en estos estudios. células 3LL-OVA se generaron mediante la transfección de células parentales 3LL con las construcciones de OVA obtenidos de Dr. Frelinger (Universidad de Rochester, NY). Los vectores de expresión que codifican ya sea de longitud completa óvulos o OVA truncada (138-386) (Ova no secretor) fueron transfectadas utilizando lipofectina (GIBCO /BRL) según las instrucciones del fabricante. Selección con el fármaco apropiado se llevó a cabo como se describe [16]. Se seleccionaron transfectantes estables 3LL-OVA OVA siguiente ELISA de los lisados celulares y se clonan por dilución limitada en placas de 96 pocillos. Para los experimentos descritos en este estudio se utilizó la 3LL-OVA que expresa el truncado OVA (138-386). El medio de cultivo (CM) contenía RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), penicilina (100 unidades /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml), y 2 mmol /L glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Fluoresceína isothiocyanate-, ficoeritrina, allophycocyanin-, PerCP- o APC-Cy7 conjugados con anticuerpos monoclonales anti-ratón para CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD69 (H1.2F3) y CD8a (53-6.7) se compraron de BD Biosciences (San Diego, CA). Fluorescente conjugado con Abs de ratón anti-CD49b, anti-CD11c, anti-CD69, anti-CD44, anti-perforina, anti-granzima, anti-IL10, anti-IFN, anti EpCAM y anti-CD107a eran de eBioscience (San Diego , CA) y anti-Gr1, anti-CD45 y anti-CD11b eran de Biolegend (San Diego, CA). Abs neutralizantes a: Gr1 (RB6-8C5), Ly6G (1A8) eran de BioXCell (West Lebanon, NH) y la queratina fue de Sigma. IL-2, IFN, IL-12, IL-10 y TNF se cuantificaron con kits de ELISA específicos de citocinas (eBioscience). Sensibilidad: IL-2 (3 pg /ml), IFN (3 pg /ml), IL-12 (3-5 pg /ml), IL-10 (30 pg /ml) y TNF (8 pg /ml). proteína ovoalbúmina y Bradford colorante cuantificación de proteínas se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). tampón de digestión de tejido consistió en [0,2 mg /ml de colagenasa A (Boehringer Mannheim /Roche, Indianapolis, IN), DNasa 25 U /ml (Sigma), y 0,3 U /ml de dispasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) en medio RPMI. columnas de purificación de células T se adquirieron de amp I +; D (Minneapolis) y MDSC separación magnética Ab era de Miltenyi Biotech (Auburn, CA). kit de aislamiento de ARN era de Qiagen (Valencia, CA) y el kit de ADNc a partir de BioRad (Hercules, CA) y cebadores de PCR en tiempo real fueron de IDT (Coralville, Iowa). carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se obtuvo de Invitrogen.
Cell Cultura y
Las células (3LL, DC 2.4, B3Z y 3LL-OVA) fueron cultivadas de forma rutinaria en Corning T75 cm
2 tisular frasco de cultivo en atmósfera húmeda que contiene 5% de CO
2 en el aire en medio de cultivo (CM). Las líneas celulares fueron
Mycoplasma Opiniones y patógeno viral murina libre. Las líneas celulares se utilizaron hasta el 10
º paso. La médula ósea (BM) se cosechó por el lavado de los fémures de ratones C57BL /6 con RPMI suplementado con 20% de medio bovino fetal (RP-20). Las células de médula combinadas se sembraron en RP-20 suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina y se cultivaron durante 72 horas en matraces recubiertos con 2% de gelatina (Sigma, St Louis MO). Las células no adherentes se eliminan mediante lavado y las células adherentes se expandieron en RP-20. Tras el período de cultivo (11-14 días), suspensiones de células individuales de células cultivadas BMA se tiñeron para los marcadores de superficie celular para: monocitos CD11b (
+), los macrófagos (CD11b
+ /F4 /80
+ ), las células del estroma (CD45
- /CD11b
- /CD44
+ /CD34
-), DC (CD11c células B
+, DEC205
+) y (CD19
+) y evaluadas por citometría de flujo análisis
Tumorigénesis Modelo
patógenos-C57BL /6 ratones libres (6-8wk de edad;. Charles River) se mantuvieron en los asuntos de los veteranos del oeste de los Ángeles vivero de Investigación Animal de acuerdo con las directrices de la junta de revisión institucional de animales. Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con la atención de asuntos de los veteranos de Animales institucional y el empleo directrices del Comité: Identificación del A3002-01. La atención de asuntos de los veteranos de Animales institucional y el empleo Comisión junta de revisión aprobados todos los estudios con animales en este manuscrito. Animales que exhiben signos de dolor o que satisfacen los criterios de punto final fueron sacrificados inmediatamente de acuerdo con el protocolo basado institución aceptada.
Los ratones se controlaron diariamente para detectar signos de sufrimiento de la carga tumoral y para mejorar el dolor y los ratones que sufren fueron sacrificados si el animales mostraron signos clínicos de dificultad, como la pérdida de apetito, pérdida de peso del 10% caquexia, pérdida de movilidad, inquietud, depresión, dificultad respiratoria, tumor /ruptura de la piel, o la ausencia de limpieza. las células del tumor 3LL (2.0 × 10
5) fueron inyectados
s.c..
en el derecho del área escapular supra de ratones C57BL /6. volúmenes de los tumores se monitorizaron mediante la medición de dos diámetros bisectrices de cada tumor con calibres. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: V = 0.4ab
2, (a = diámetro grande y b = diámetro pequeño). Hemos utilizado dos dosis para el
in vivo
agotamiento de MDSC basado en estudios anteriores [100 mg /dosis [17]] o [200 mg /dosis] administrada cada dos días [18], [19]. Para los estudios descritos en este manuscrito se utilizó el 200 mg /dosis. Una semana después de la inoculación del tumor, se inyectaron los ratones con tumores palpables
ip de
individualmente con anti-Gr-1-específico (200 mg /dosis), o específicos de Ly6G contra (200 mg /dosis), o IgG2b isotipo Ab (200 mg /dosis) cada 48 horas durante 2 semanas. Uno, dos o tres semanas después de la implantación del tumor, tumores, el bazo, la médula ósea y la sangre fueron recolectadas para la evaluación de la frecuencia y la actividad de las poblaciones leucocitarias por tinción específica /análisis de citometría de flujo.
modelo ortotópico
se realizó la implantación de los tumores en el pulmón, como se describe anteriormente [20]. Brevemente, 10
4 3LL células en 25 l de diluyente estéril NS se inyectaron por vía transtorácica de ratones C57BL /6 utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 30 en el pulmón izquierdo bajo anestesia de ketamina /xilazina. Una semana después de la inoculación del tumor, un grupo de ratones se sacrificaron para confirmar y determinar la carga tumoral línea de base antes de la iniciación de la terapia. Una semana después de la inoculación del tumor, los ratones se trataron individualmente con isotipo de control o anti-Gr1Ab (200 mg /dosis) a través de
i.p..
Ruta cada 48 horas durante 4 semanas. Cinco semanas después de la implantación del tumor, los pulmones fueron perfundidos y se cosechan para la evaluación de la carga tumoral por H & amp; E tinción de secciones de tumores. La carga tumoral se evaluó en una suspensión de células de digestos de tumor de pulmón por la tinción de EpCAM de las células tumorales, seguido de evaluación de citometría de flujo. Un total de 20.000 eventos fueron adquiridas en el citómetro de flujo FACSCanto y analizaron los datos mediante el software de FCS Express 3.
Vacunación Modelo
células tumorales
3LL-OVA (2.0 × 10
5) se inyectaron
sc Hoteles en la zona escapular derecha supra de ratones C57BL /6. La vacuna consistió en células adherentes de médula ósea (BMA) que habían sido pulsadas con la proteína OVA. Brevemente, las células de BMA se pulsaron con la proteína OVA (2,5 mg /ml) en CM a 37 ° C en una incubadora con una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 en aire durante 6 horas. Las células se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en solución salina normal (0,1 × 10
6 en 200 l /ratón) y administrados por
sc
inyección en el flanco contra-lateral izquierdo de la implantación del tumor en los días 7 y la inoculación del tumor 14 post. Grupos incluyen: (i) El diluyente, (ii) BMA-OVA, (iii) BMA-OVA + isotipo y (iv) BMA-OVA + anti-Gr1. Siete días después de la inoculación del tumor, el isotipo o anti-Gr1 Ab (200 mg /dosis) se administraron cada 48 h durante 2 semanas. La carga tumoral se monitorizó como se describe anteriormente y H & amp; E o inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó en las secciones del tumor. Los ratones tratados que habían rechazado completamente los tumores 3LL-OVA fueron re-estimularon con células tumorales 3LL-OVA (2 × 10
5) en el flanco izquierdo y supervisado por el crecimiento del tumor.
1A
, terrenos FACS representativos de MDSC en la sangre, BM, el bazo y el tumor de los ratones portadores de tumores 3LL (días 7, 14 y 21) en comparación con los ratones no expuestos.
1B
, España FACS datos de frecuencia de MDSC en sangre, BM, el bazo y los tumores (días 7, 14 y 21) representan como gráficos de barras (* p & lt; 0,05 vs día 14 día 7) , (** p & lt; 0,005 días 21 días vs 14).
1C
,
MDSC de ratones portadores de tumores suprimen la actividad de APC DC2.4 para activar las células T CD8 específicos del antígeno para secretar IL-2 (* p & lt; 0,05 en comparación con MDSC con y sin MDSC) ,
1D
, España MDSC de ratones portadores de tumores que llevan suprimen anti-CD3 /CD28 estimulada CFSE etiquetado proliferación de células T.
1Di
, España Representante FACS CFSE parcelas de intensidad para la proliferación de células T (con o sin MDSC).
1D-ii
, España media geométrica (GM) para las células T CFSE intensidad representados como gráficos de barras. (* P & lt; 0,05 con MDSC vs sin MDSC), valores reflejan la media ± error estándar de la media (SEM), n = 8 ratones por grupo
memoria inmunológica
Los esplenocitos. de los ratones que habían rechazado el desafío de tumores secundarios fueron controlados por células T fenotipo de memoria inmunológica mediante la tinción para T de memoria celular marcadores de superficie CD44, CD69 y IFN intracitoplasmática con o sin estimulación con la proteína OVA (2,5 mg /ml durante la noche)
in vitro
. IFN secretado por spenocytes (5 × 10
6) en el sobrenadante del cultivo se cuantificó mediante ELISA y CD4 y células T CD8 IFN o la producción de IL-10 se cuantificó mediante tinción /citometría de flujo. Los esplenocitos de los ratones ingenuos sirvieron como controles.
2A
, España Los cambios en el volumen del tumor siguientes anti-Gr1 o anti-Ab Ly6G agotamiento MDSC mediada.
2B
, España Cambios en pesos de los tumores de MDSC agotado y los grupos de control (día 21).
2C
, España FACS representativos parcelas y gráficos de barras para la frecuencia de CD11b + + Gr1 MDSC en el tumor después de anti-Gr1 o tratamiento anti-Ly6G Ab.
2D
, Terrenos FACS representativos para la frecuencia de CD11b + + Gr1 MDSC en el tumor después del tratamiento Ab anti-queratina.
2E
,
actividad representante de APC en el tumor para activar las células T específicas de antígeno CD8 a secretar IL-2 después de anti-Gr1, anti-Ly6G, control de isotipo Ab y diluyente tratamiento.
2F
, España CD107a la expresión de marcadores de activación de células T en el tumor tras el agotamiento MDSC.
2G
, España citólisis de células T del bazo purificada total contra el tumor parental 3LL (E: T de 10: 1, 5: 1) grupos para el MDSC agotados y controles de isotipo. No hubo diferencias en T citólisis celular de las células 3LL parental entre el diluyente y el grupo de control de isotipo (datos no mostrados). No hubo cambios en la citólisis de células T contra los tumores no relacionados con B16 entre los grupos y los controles MDSC empobrecido (datos no mostrados). Los datos de todos los paneles son representativos de 2-3 experimentos independientes (datos, media ± SEM, los valores de p: en comparación con los controles * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,005, n = 6 ratones /grupo
Tratamiento y presentación de antígenos de ensayo
DC 2,4 o BMA o una suspensión de células de tumor de digestión (5-10 × 10
4 c /pocillo) de los controles, anti-Gr1 o anti-Ly6G tratados ratones portadores de tumores se co-cultivaron con proteína OVA (2,5 mg /ml) y el MHC de clase I restringido línea de células CD8 T B3Z (10
5 c /pocillo) en CM en pocillos por triplicado de una placa de 96 pocillos durante 24 hrs. IL-2 secretadas por las células T CD8 activadas en el sobrenadante se cuantificó por ELISA
3A
, España H & amp;. e y IHC para las células T o GR1 que expresan las células tumorales en los tejidos tras el agotamiento o el control de los tratamientos MDSC
3B
, España H & amp;.. E de secciones de pulmón para evaluar la metástasis pulmonar tras el agotamiento MDSC
3C
, España Frecuencia de infiltrados tumorales (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD49b o F480), 3
D
, España células NK que expresan IFN, perforina y granzima,
3E
, CD8 que expresan IFN, perforina y granzima pero reducción de la expresión de IL-10 se analizaron por citometría de flujo.
3F
, España tumor expresión de citoquinas (IFN, IL-12, TNF e IL-10) tras el agotamiento MDSC. (Datos, media ± SEM, * p & lt; 0,05 en comparación con los controles, n = 8 ratones /grupo) guía empresas
Citometría de Flujo
La citometría de flujo se realizó de la siguiente superficie de la célula T. marcadores CD3, CD4, CD8, CD69 en suspensión de células individuales de esplenocitos o digestos de tumor después del tratamiento como se describe anteriormente. También se evaluaron los esplenocitos y compendios de células tumorales por las células NK con el marcador de superficie CD49b. las células T CD4, CD8 T y NK se evaluaron individualmente para perforina intracitoplasmática, granzima, IFN o IL-10. CD107a en las células T se evaluó mediante tinción de la superficie celular /citometría de flujo. Para los análisis de infiltrados leucocitarios en el tejido del tumor, los tumores se disociaron mecánicamente en una malla de alambre por trituración con una jeringa de 10 ml y se incubaron en tampón de digestión de tejidos a 37 ° C durante 25 min. Las células se filtraron a través de 70 micras filtros de nylon (BD Biosciences, Bedford, MA), se tiñeron con marcadores específicos y se analizaron por citometría de flujo. Las muestras se adquirieron en un flujo FACSCanto (BD Biosciences /citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) en la Universidad de California, Los Ángeles, Jonsson Cancer Center de Citometría de Flujo Core Facility. Un total de 10.000 a 25.000 eventos fueron adquiridas y las células tinción positiva dentro de la población total de células vivas se analizaron usando FCS Express 3 (de Novo Software, Canadá). células incubadas con anticuerpos isotipo irrelevante y células no teñidas sirvieron como controles.
4A
, España IHC para la caspasa 3 escindida en las secciones del tumor tras el agotamiento MDSC. Las flechas son indicativos de caspasa 3 escindida tinción.
4B
, España AnnexinV y tinción PI en digiere tumorales por citometría de flujo.
4C
, España relativa caspasa 8 de expresión por QRTPCR normalizada con la expresión de β-actina en los tejidos tumorales.
4D
, España MECA endotelial 32 expresión de células marcadoras y la expresión total de CXCR3 células T en los tumores por citometría de flujo.
4E-H
, España expresión de marcadores pro-angiogénicos y anti-angiogénico relativa en los tumores de QRTPCR normalizado por β- actina. MDSC agotamiento disminuyó pro-angiogénico (VEGF-A, CXCL2, CXCL5, Ang1 y Ang2) (4E-F), pero el aumento de anti-angiogénico (CXCL9 y CXCL10) (4G) y CXCR3 expresión (4H) en los tumores. (Datos, media ± SEM, los valores de p: en comparación con los controles * p & lt; 0,05, n = 8 ratones /grupo) guía empresas
5A
, España Representante. H & amp; e de secciones de tumor de pulmón siguientes agotamiento y controles MDSC; flechas indicativas de tumor.
5B
, España La carga tumoral evaluada por tinción de la superficie celular para EpCAM en una suspensión de células individuales de los digestos de tumor y se cuantifica por citometría de flujo. (Datos, media ± SEM, los valores de p: en comparación con los controles * p & lt; 0,05, n = 8 ratones /grupo) guía empresas
CFSE basada citolisis Ensayo
actividad de las células T citolítica total. en el bazo contra las células tumorales 3LL los padres o células de melanoma B16 singénico fueron evaluados después del tratamiento con anti-Gr1 o anti-Ab Ly6G en el día 21 posterior inoculación del tumor. dianas tumorales se marcaron con CFSE a una dosis (1 mM) en PBS durante 15-20 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las dianas marcadas se incubaron con células T purificadas a partir de bazos utilizando columnas de células T (R & amp; D), y se evaluaron las actividades citolíticas contra la línea de células tumorales autólogas 3LL y la línea celular de tumor de melanoma B16 de control singénicos. Los efectores de células T esplénicas purificadas fueron co-cultivadas con objetivos de células tumorales (E: T de 10:01-5:01) durante cuatro horas en pocillos cuádruples en una placa de 96 pocillos. Después de un co-cultivo, las células se lavaron y se analizaron por citometría de flujo. La disminución en la frecuencia e intensidad de las células CFSE marcado se utilizaron para calcular el% de citolisis en dianas de tumores.
6A
, página 14 días de cultivo BMA propaga en CM.
6B
, España BMA células procesan y presentan la proteína OVA para activar la línea de células T CD8 específica OVA para secretar IL-2.
6C
, el volumen del tumor después de la vacunación (
grupos: Diluyente, BMA-OVA, BMA-OVA + Isotipo y BMA-OVA + anti-Gr1 Ab).
6D
, España H & amp; E y IHC para la caspasa 3 escindida en los tejidos tumorales después de la vacunación. Las flechas indicativas de infiltrados leucocitarios y exfoliados caspasa 3 en la tinción de los tumores.
6E-G
, España flujo análisis de citometría de marcadores de células T de memoria y activación del bazo de los ratones que habían rechazado los tumores en la vacunación de más anti-Gr1 grupo de tratamiento en comparación con los no portadores de tumores controles no tratados previamente ; 6E, la producción de IFN esplénica, 6F, la frecuencia de IFN producción de CD4 y CD8 de memoria (CD44) y el marcador de activación (CD69) que expresan las células T. 6G, media geométrica de IFN producción de células T de memoria además de la vacunación anti-Gr1 tratamiento después de la estimulación con la proteína OVA en comparación con los controles no tratados previamente. (Datos, media ± SEM, los valores de p: en comparación con los controles * p & lt; 0,05, n = 8 ratones /grupo)
CFSE etiquetado y ensayos de supresión de la célula T
células T se purificaron a partir de bazos utilizando las columnas de aislamiento de células T. Después de dos lavados con PBS, las células T purificadas eran (2 × 10
6 células /ml) se mezclaron con un volumen igual de solución de CFSE 10 M durante 10 min. La reacción se terminó por la adición de 10 volúmenes de frío RPMI 1640/10% de FBS. Las células marcadas (1 × 10
6 células /ml) se lavaron dos veces con PBS /2% de FBS. En una placa de cultivo celular de fondo en U de 96 pocillos pre-recubierto con anti-CD3 Ab (5 g /ml), las células T purificadas (2 × 10
5) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y anti- CD28 Ab (5 mg /ml) durante 72 a 96 h. Para determinar el impacto de MDSC en la proliferación de células T, CFSE etiquetado células T fueron co-cultivadas con purificada Gr1 esplénica MDSC (2-4 × 10
5) de 3LL ratones o ratones no tratados previamente y los cambios en la proliferación de rodamiento se evaluó por el flujo de citometría. MDSC se aislaron a partir de bazos mediante el etiquetado de las suspensiones celulares con la rata anti-ratón Gr1 mAb (eBioscience), seguido de la separación celular magnética de anticuerpo usando microperlas anti-rata (Miltenyi Biotec). Las células aisladas eran & gt;. 90% puro para CD11b + Gr1 + expresar MDSC como se determina por citometría de flujo
citoquinas ELISA
Las citoquinas (IFN, TNF, IL-10 e IL-12) en sobrenadantes de cultivos de esplenocitos o de bazo o tumorales homogeneizados se determinaron por ELISA y las placas de leer en las longitudes de onda especificadas con un lector de microplacas (Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA).
tumor Tissue Seccionamiento y inmunohistoquímica
Para determinar el grado de infiltración de linfocitos de los tumores de los diferentes grupos de tratamiento, se inyectó a ratones C57BL /6 portadores de tumores de 7 días
ip
con Gr1-específica (200 mg /dosis) o específica Ly6G (200 g /dosis) o isotipo IgG2b Ab (200 mg /dosis) cada 48 horas durante 2 semanas. Los tumores no necróticos fueron aisladas y se embebieron en parafina y se seccionaron en serie a espesor 5-m. Las secciones fueron H & amp; E o manchado inmunológico de linfocitos CD3 T o células que expresan Gr1. Para determinar las células tumorales apoptóticas, secciones de tumor se tiñeron para la caspasa escindido 3. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con citrato de sodio (10 mmol /L, pH 6,0). Las secciones se bloquearon con suero de cabra normal 10%, y se sondearon con un anticuerpo contra CD3, Gr1 o caspasa 3. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 ° C troceados. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (Vector Laboratories), la tinción fue desarrollado utilizando el kit de sustrato DAB para la peroxidasa (SK-4100, Vector Laboratories). Tinción de contraste se realizó con hematoxilina. Se observaron las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia Olympus 1X71 conectado a una cámara CCD. Las imágenes fueron adquiridas con 10X, 20X y 60X objetivos utilizando el software Image Pro.
Apoptosis
Para determinar la extensión de la apoptosis de células tumorales, una suspensión de células de los tejidos tumorales fueron teñidas utilizando un V-FITC kit de detección de apoptosis PI /anexina (BD Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el porcentaje de células tumorales apoptóticas (cerrada en CD45
- células) se analizaron por citometría de flujo
ARN total. Preparación, síntesis de ADNc y en tiempo real QPCR
Ratones portadores de tumores de siete días de edad fueron tratados con isotipo, anti-Gr1 o anti-Ly6G Ab y 2 semanas después del tratamiento, los tejidos tumorales fueron cuantificados para
caspasa 8, Angiopoietin1, Angiopoietin2, VEGF-a, CXCL2, CXCL5, CXCL9, CXCL10 y CXCR3
la expresión génica utilizando un kit de SYBR Green PCR cuantitativa en el iCycler (Bio-Rad) y corregir con la
actina β-
control de genes de limpieza. Para los análisis de QPCR, el ARN se aisló utilizando un kit de Qiagen. El ADNc fue preparado con un kit (BioRad) según las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones se realizaron en un volumen total de 25 l durante 40 ciclos de 15 s a 95ºC, 20 s a 60 ° C, y 30 s a 72 ° C. Primer secuencias fueron los siguientes: β-
actina F
, 5'-CCACAGCTGAGAGGGAAATC -3 'y R', 5'-TCTCCAGGGAGGAAGAGGAT -3 ';
La caspasa página 8 M, 5'-TGCTTGGACTACATCCCACAC-3 'y R', 5'-GTTGCAGTCTAGGAAGTTGACC -3 ';
Ang-1